KR19980075195A

KR19980075195A - 트리코스포로노이데스 속 변이균주 및 이를 이용한 에리스리톨의 제조방법

Info

Publication number: KR19980075195A
Application number: KR1019970011342A
Authority: KR
Inventors: 서승현; 김대철; 조영제; 전영중; 이재흥
Original assignee: 손경식; 제일제당 주식회사
Priority date: 1997-03-26
Filing date: 1997-03-26
Publication date: 1998-11-16
Also published as: US5962287A; US5939311A; JP3023326B2; JPH1132754A

Abstract

본 발명은 고 삼투압내성 고 역가균주인 트리코스포로노이데스 마디다 (Trichosporonoides madida) KCTC 8712P로부터 변이유발제인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘과 호흡억제제인 소듐아자이드를 사용하여 에리스리톨의 고 생성능을 유지하면서도 저산소요구성을 부여한 변이균주 트리코스포로노이데스 마디다 CJ-NT1를 획득하고, 이 균주를 이용하여 통기량이 낮은 조건 하에서도 정상적으로 배양될 수 있으며 이에 따라 거품발생량을 낮춤으로써 발효기 이용효율을 높이는 것을 특징으로 하는 에리스리톨의 제조방법에 관한 것이다.

Description

트리코스포로노이데스 속 변이균주 및 이를 이용한 에리스리톨의 제조방법

에리스리톨은 발효식품, 버섯 등의 식물, 포유동물의 체액에 존재하는 천연물질로 감미도는 설탕의 70 내지 80% 이다. 에리스리톨은 열량이 설탕의 1/10미만 (0.3Kcal/g)인 저칼로리 감미료로서 용해시 흡열작용을 하여 시원한 감미특성을 가지고 있고, 흡습성 및 착색성이 낮아 모든 식품에 잘 적용된다. 또한 충치균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutants)가 이용하지 못하므로 산이나 글루칸(Glucan)이 생성되지 않기 때문에 비충치성인 특징도 가지고 있다. 게다가, 기존의 당알콜류의 일반적인 단점은 다량 섭취시 설사를 유발하는 것이나 에리스리톨은 상대적으로 다량 섭취하여도 설사유발이 적은 장점도 가지고 있다.

종래의 에리스리톨 제조방법은 오레오바시디움 (Aureobasidium) 속 균주를 이용하는 방법 (일본특허공개 제61-31091호), 모닐리엘라 (Moniliella) 속 균주를 이용하는 방법 (유럽특허공개 제0,136,805호), 캔디다 자이라노이데스(Candida zeylanoides)를 이용하는 방법 (일본특허공개 제49-118889호), 캔디다 리포리티카 (Candida lipolytica)를 이용하는 방법(미국특허 제3,756,917호), 데바리오마이세스 (Debaryomyces) 속 균주를 이용하는 방법 (미국특허 제2,986,495호) 등이 있다.

캔디다속 균주를 이용하는 경우 기질농도가 20%를 넘지않아 생산성이 낮고, 기질로서 탄화수소를 사용하므로 제품 중에 탄화수소가 잔류할 가능성 때문에 식품에 사용할 때 안전성 문제가 제기될 수 있다. 데브리오미이세스속 균주를 이용하는 경우에는 에리스리톨 외에도 글리세롤, 아라비톨이 다량 부생하여 제품수율이 떨어지고 또한 분리정제에도 어려움이 따른다. 한편 오레오바시디움속이나 모닐리엘라속 균주의 경우에는 기질의 에리스리톨 변환비가 높고 배지의 기질농도를 높은 수준까지 증가시킬 수 있는 특징이 있으나 배양시 다량의 거품발생으로 인해 다량의 소포제를 첨가하여야 하며 초기에 배양기에 사입할 수 있는 배지량이 높지않아 배양기 단위부피당 생산성이 떨어지는 단점이 있다.

본 발명자들은 벌집으로부터 에리스리톨 생산균주인 트리코스포로노이데스(Trichosporonoides)속 균주를 분리하고 이 균주로부터 고 삼투압 내성을 부여한 트리코스포로노이데스 마디다 (T. madida)변이균주를 개발하여 한국에 특허출원하여 이 특허원은 현재 계류중에 있다 (한국 특허공개 제 호). 이 균주는 특허목적으로 한국 대전광역시에 소재하는 유전공학센터 수탁번호 KCTC 8712P로 기탁되어 있다. 그러나, 트리코스포로노이데스 마디다 KCTC 8712P는 소포제로도 잘 제거되지 않는 거품이 다량 발생하여 발효액과 균체가 배기라인 쪽으로 유실이 되거나 정상적인 발효를 수행하기 어렵게 하는 문제가 있다. 거품발생량은 통기량을 줄이거나 교반속도를 늦추어 줌으로써 낮출 수 있으나 이 경우 균체의 성장과 에리스리톨의 생성에 적절한 산소공급을 할 수 없어서 생산성이 떨어지게 되므로, 트리코스포로노이데스 마디다 KCTC 8712P를 이용하여 에리스리톨를 생산하는 것은 현실적으로 채택할 수 없는 방법으로 평가되었다.

따라서, 본 발명자들은 기존의 에리스리톨 생산역가를 유지하면서도 거품발생으로 인한 문제점들을 최소화하기 위하여 저산소요구성 균주를 개발하고 이러한 균주를 사용하여 효율적으로 에리스리톨을 생산하는 방법을 찾고자 부단한 연구를 수행하였다.

본 발명은 에리스리톨 생산균주인 트리코스포로노이데스 마디다 KCTC 8712P를 모균주로 하여 이를 인공적으로 돌연변이시켜 얻은 변이 균주에 관한 것으로 본 발명의 균주는 저산소요구성이면서 고역가의 에리스리톨 생산성을 갖고있다. 본 출원인은 본 발명에 따른 신규한 균주를 트리코스포로노이데스 마디다 CJ-NT1로 명명하고 특허목적상 부다페스트 협약하에 한국 서울특별시에 소재하는 국제기탁기관인 한국 미생물 보존센터에 1997년 월 일자로 수탁하고 기탁번호 KCCM 를 부여받았다. 이하 본원에서는 본 발명의 따른 신규한 균주는 트리코스포로노이데스 마디다 CJ-NT1로 기술될 것이다.

또한, 본 발명은 트리코스포로노이데스 마디다 CJ-NT1을 낮은 통기 조건하에서 배양함을 특징으로하여 글루코오스로부터 에리스리톨을 높은 수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.

트리코스포로노이데스 마디다 CJ-NT1의 분리

본 발명자들은 에리스리톨 고역가변이주인 트리코스포로노이데스 마디다 KCTC 8712P를 발아배지 (글루코오스 또는 설탕 20%(w/v), 분말효모 1%(w/v))에서 3일동안 배양한 후 원심분리하여 상등액을 분리하고 균체를 희석하여 돌연변이제인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-mitrosoguanidine)이 1 mg/ml 포함된 완충용액에 처리하였다. 그런 다음 이 처리물을 이스트 나이트로젠 베이스(Difco 제품)에 글루코스 1%(w/v), 호흡억제제인 소듐 아자이드를 20 mg/L 첨가한 배지에 3일간 배양하고 염화나트륨이 1M 포함된 한천 배지에 도말하여 배양시키고 생육한 균주를 선별하였다. 이렇게 선별된 균주를 산소공급이 원활하지 못한 조건을 부여하기 위하여 최적 volume인 50 mL보다 훨씬 높은 100 mL의 40% 글루코오스 배지를 담은 250 mL 삼각 플라스크에 접종시키고 200rpm에서 120시간 배양하여 에리스리톨 생성능이 탁월하고 저산소요구성 에리스리톨 고역가균주를 분리하였다.

본 발명의 균주 트리코스포로노이데스 마디다 CJ-NT1는 모균주 트리코스포로노이데스 마디다 KCTC 8712P의 약 60% 수준의 낮은 통기조건 하에서 배양하여도 모균주와 동일한 에리스리톨 수율을 나타낸다. 또한, 본 발명의 신규한 균주를 사용하였을 때 배양중에 거품의 발생량이 현저히 줄어 들어서 배양기내 배지사입 부피를 기존의 약 40 내지 약 50% 수준에서 약 60 내지 약 70% 수준으로 올릴 수 있게 됨에 따라 배양기 단위부피당 생산성이 약 30 내지 약 50%가량 증가된다.

또한, 본 발명의 부수적인 효과로서 통기량의 감소와 더불어 발효열의 발생도 감소하게 되므로 공기압축기 가동을 위한 전력 및 냉각수의 사용량을 줄일 수 있어 유틸리티 비용도 대폭 절감할 수 있다.

트리코스포로노이데스 마디다 CJ-NT1의 성상

본 발명의 균주 트리코스포로노이데스 마디다 CJ-NT1은 저산소요구성이라는 점에서 모균주인 트리코스포로노이데스 마디다 KCTC 8712P의 돌연변이균주이며 이의 성상은 다음과 같다:

1) 효모 맥아 한천 (Yeast malt agar) 배지에서 크림색 콜로니를 형성하고 시간이 경과하면 검은색의 콜로니로 변한다. 단세포 형태로 조건에 따라 가균사를 형성하는 경우도 있으며 출아에 의해 번식하며 분절포자, 출아포자 및 분생포자를 형성한다.

2) 생리학적 성질

생육온도: 약 40℃까지

최적 생육온도: 28 내지 32℃

생육 pH: 2.5 내지 8.0

최적 pH: 4.0 내지 7.0

우레아제(Urease) 생산: 있음

DBB(Diazonium B Blue) 염색: 양성

이용성: 있음

가균사 생성: 있음

3) 당의 발효성

D-글루코오스 + , 락토오스 - , D-갈락토오스 - , 라피노오스 - ,

L-솔보오스 - , 말토스 + , 슈크로오스 +

4) 당 유기산의 동화성

D-글루코오스 + , D-갈락토오스 -, L-솔보오스, 슈크로오스 +, 말토스 + , 셀로비오스 + , 트레할로스 + , 락토오스 - , 메리비오스 - , 라피노스 + , 메레지토스 - , 이눌린 - , D-자이로스 + , L-아라비노스 + ,

D-아라비노스- , D-리보오스 + , L-람노스 + , 글리세롤 + , 에리스리톨 + , D-만니톨 + , 메틸-α-D-글루코시드- , 살리신- , 락테이트 - , 호박산 - , 이노시톨 -

본 발명의 균주 트리코스포로노이데스 마디다 CJ-NT1의 배양에 사용할 수 있는 탄소원으로는 글루코오스, 설탕, 과당 등이 있으며 유기 및 무기질소원으로는 분말효모, 옥수수 침지액, 펩톤, 요소 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 변이주의 배양온도 25 내지 37℃의 범위가 적당하며, 바람직 하기로는 30 내지 32℃의 범위이다. 배양에 최적인 pII는 중성 부근이며, 4-5일간 통기 교반하면서 배양하면 에리스리톨이 생성된다. 배양액에는 주로 에리스리톨이 생성되고 부산물로 소량의 글리세롤이 생성되는데 글리세롤 양이 적을수록 에리스톨 정제공정 중 결정화 수율이 향상된다. 정제공정은 통상의 정제법을 사용할 수 있다. 예를들면, 여과나 원심분리하여 균체를 제거하고 이온교환 수지를 사용 탈색탈염한 후 농축하여 에리스리톨 결정을 석출시켜 분리한다.

다음의 실시예에서 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다

실시예 1 (소듐아자이드 내성의 측정)

야생균주 트리코스포로노이데스 마디다 및 고삼투압내성 변이주인 트리코스포로노이데스 마디다 KCTC 8712P의 소듐아자이드에 대한 내성을 알아보았다. 이스트 나이트로젠 베이스 (Difco 제품)에 글루코오스 1%(w/v), 소듐아자이드 0 내지 20 mg/L을 첨가한 배지를 250 mL 삼각플라스크에 50ml 넣고 한천보존배지 배양으로부터 얻은 야생균주 트리코스포로노이데스 마디다 및 트리코스포로노이데스 마디다 KCTC 8712P의 균체 1백금니를 무균적으로 접종하였다. 그런 다음 32℃에서 120시간 동안 진탕 회전(200rpm)시키면서 배양하고 흡광도를 측정하여 소듐아자이드 농도변화에 따른 균체성장 억제효과를 측정하였다. 이의 결과는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

표 1. 소디움 아자이드 농도에 따른 균체성장 억제효과

표1의 결과 양균주 모두 10mg/L의 소듐아자이드 농도에서부터 현저한 균체성장 억제효과가 있어 저산소 요구주 선별시 소듐아자이드 농도를 20mg/L로 하였다.

실시예 2 (배지부피의 영향)

에리스리톨 발효에 있어서 통기량의 변화에 대한 영향을 알아보기 위한 예비실험으로써 삼각플라스크 중 배지부피를 변화시키면서 에리스리톨 생성량을 측정하였다. 설탕 40%, 분말효모 1%, 요소 0.1%가 포함된 배지를 각각 30, 50, 70, 100mL 씩 250mL 삼각플라스크에 넣고 그런 다음 한천보존배지 배양으로부터 얻은 트리코스포로노이데스 마디다 KCTC 8712P의 균체 1백금니를 무균적으로 접종하였다. 그런 다음 32℃에서 120시간 동안 진탕 회전(200rpm)시키면서 배양하였다. 그 결과는 표 2에 나타낸 바와 같다.

표 2. 배지 용량의 영향

실시예 3(변이주의 선별)

고삼투압내성 변이주인 트리코스포로노이데스 마디다 KCTC 8712P를 글루코오스 20% 및 분말효모 1%가 포함된 배지에 3일간 배양하였다. 배양액은 원심분리하여 균체를 분리하고 균체를 1 mg/mL 농도의 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘이 포함된 완충용액에 희석하여 30분간 처리하고 그런 다음 이 처리물을 이스트 나이트로젠 베이스(Difco 제품)에 글루코스 1%(w/v), 소디움 아자이드를 20 mg/L 첨가한 배지에 3일간 배양하고 염화나트륨이 1M 포함된 한천 배지에 도말하여 배양시키고 생육한 균주를 1차 선별하였다. 이렇게 선별된 균주 중 40주를 100 mL의 글루코오스 40%, 효모분말 1%, 요소 0.1%가 포함된 배지 (초기 pH 6.0)를 담은 250 mL 삼각 플라스크에 접종시키고 200rpm으로 120시간 배양하여 배양액 중의 에리스리톨 농도를 측정한 결과 이중 에리스리톨 생성능이 높은 균주 4주를 2차 선별하였다. 이 균주들을 이용하여 3회 반복적으로 상기한 조건에서 플라스크배양을 실시하여 그 결과 에리스리톨 생산능이 상당히 우수하며 글리세롤 생성이 비교적 적은 저산소요구성 고역가균주를 분리하였다.

이 변이균주를 트리코스포로노이데스 마디다 CJ-NT1로 명명하고 저산소 조건에서 배양하여 에리스리톨 생산성을 측정하였다. 또한, 동일한 저산소 조건에서 모균주인 트리코스포로노이데스 마디다 KCTC 8712P의 에리스리톨 생산성도 측정하였다. 이의 결과는 하기 표 3에 나타낸 바와 같다.

표 3. 변이주의 저산소조건에서의 에리스리톨 생산성

(40% glucose, 250mL 삼각플라스크, 100mL 배지 volume, 200rpm)

실시예 4 (5L 발효에서의 통기량의 영향)

본 발명의 신규한 변이주 트리코스포로노이데스 마디다 CJ-NT1를 이용하여 5L 소형발효조에서 배양을 실시하며 에리스리톨 생성에 미치는 통기량의 영향을 검토하였다. 글루코오스 40%, 분말효모 1%, 요소 0.1% 포함하고 초기 pH가 6.0으로 조정된 배지 2L를 5L 용적의 발효조에 넣고 121℃에서 15분간 살균하였다. 트리코스포로노이데스 마디다 CJ-NT1 및 트리코스포로노이데스 마디다 KCTC 8712P의 균체 종배양액 150mL를 각각 접종하고 통기량 0.3 및 0.5 vvm, 온도 32℃, 교반속도 600rpm의 조건에서 96시간 배양하였다. 이의 배양 결과는 표4와 같다.

표4. 5L 발효조에서의 통기량이 에리스리톨 생성에 미치는 영향

실시예 5 (30L 발효조에서의 배지부피의 영향)

본 발명의 신규한 변이균주 트리코스포로노이데스 마디다 CJ-NT1을 이용하여 30L 발효조에서 배지용량을 증가시키며 발효를 실시하여 에리스리톨 생산성, 및 거품상태로 배기라인을 따라 유출되고 남은 배지용량을 측정하였다. 글루코오스 40%, 분말효모 1%, 요소 0.1% 포함하고 초기 pH가 6.0으로 조정된 배지 13 L 및 17 L를 각각 다른 30 L용적의 발효조에 넣고 121℃에서 15분간 살균하였다. 트리코스포로노이데스 마디다 CJ-NT1의 균체 종배양액 1.0 L를 각각 접종하고 통기량 0.3 및 0.5 vvm 및 온도 32℃, 교반속도 500rpm의 조건에서 96시간 배양하였다. 배양결과는 표5와 같다.

표5. 30 L 발효조에서의 초기용량에 따른 생산성

본 발명의 신규한 변이균주 트리코스포로노이데스 마디다 CJ-NT1는 낮은 통기량하에서 고역가의 에리스리톨 생성능을 갖고 있으므로 통상적으로 호기적 배양시 발생되는 거품의 발생을 현저히 줄일 수 있음에 따라 발효기의 이용효율을 증대시키고 궁극적으로 에리스리톨을 고수율로 생산하는데 유용하다 할 것이다.

본 발명의 목적은 식품의 감미료로서 이용되는 에리스리톨의 생산성을 높여줄 수 있는 새로운 미생물을 개발하고 그러한 미생물을 이용하여 에리스리톨을 고 수율로 제조하는 개선된 방법을 제공하는데 있다.

Claims

낮은 산소공급 조건 하에 배양하여 높은 에리스리톨 생산성을 제공하는 변이 미생물 트리코스포로노이데스 마디다 CJ-NT1.
제 1 항의 미생물을 저 산소공급 조건하에 배양함을 특징으로하여 글루코오스로부터 에리스리톨을 제조하는 방법.
제 2 항에 있어서, 통기량이 0.3 vvm이하인 방법.