KR20010067882A

KR20010067882A - 만니톨 생성균주 캔디다 매그노리아 및 이를 이용한만니톨의 발효 제조방법

Info

Publication number: KR20010067882A
Application number: KR1020010017904A
Authority: KR
Inventors: 송경화; 백홍; 박상미; 현형환; 정수련; 김상용; 이정걸; 송지윤
Original assignee: 정수련; 주식회사 바이오앤진; 정기련; 주식회사 보락
Priority date: 2001-04-04
Filing date: 2001-04-04
Publication date: 2001-07-13
Also published as: KR100416637B1; US6528290B1

Abstract

본 발명은 자일리톨 제조회사의 발효 슬러지로부터 분리한 만니톨 생산 신균주 캔디다 매그노리아(Candida magnoliae)(기탁번호 KCCM-10252호) 및 이 신균주 캔디다 매그노리아를 이용하여 각종 배양조건 및 배지조성을 최적화함으로써 고수율 고생산성의 만니톨 제조방법을 제공하는 것이다.

Description

만니톨 생성균주 캔디다 매그노리아 및 이를 이용한 만니톨의 발효 제조방법{Candida magnoliae producing mannitol and its fermentation method for producing mannitol}

본 발명은 천연으로부터 분리한 고수율 및 고생산성으로 만니톨(mannitol)을 생산하는 신균주 캔디다 매그노리아(Candida magnoliae) 및 이를 이용하여 과당(fructose)으로부터 만니톨을 제조하는 방법에 관한 것이다.

만니톨은 육탄당 당알코올로서 자연계에서는 갈조류, 버섯류, 균류 등에 함유되어 있으며, 설탕의 30∼40%의 감미도를 가지고 있어 설탕의 사용이 제한되는 식품제조에서 대체 감미료로 사용되고 있을 뿐 아니라, 냉음미, 저흡습성, 유동성등의 우수한 특성으로 인해 제과류의 첨가제, 의약품의 충진제, 계면활성제, 방수제 등으로 많이 이용되고 있다. 또한 저혈압 치료제의 중간물질로 사용되고, 각종 의약품 제제의 제조공정에서 쓴맛을 경감시켜 주기 위한 코팅제로도 이용되고 있는 등 식품 및 의약품 산업에서 광범위하게 사용되고 있다.

만니톨은 여러 가지 과일이나 채소에 자연상태로 존재하지만 이 경우에는 극히 미량으로만 존재하기 때문에 과일이나 채소로부터 추출하는 것은 산업적으로 경제성이 없다. 그러므로 만니톨의 상업적 생산 방법은 설탕 등으로부터 가수분해에 의하여 생성된 과당을 분리하고, 이 과당에 고온·고압하의 촉매 하에서 화학적으로 수소를 첨가하여 제조하는데, 부산물로서 솔비톨이 만들어져 별도의 정제 공정을 필요로 할 뿐 아니라 전환 수율이 매우 낮아 제조원가가 높다. 또한 고온 고압의 반응이므로 위험성과 폐기물 처리의 문제가 존재하는 단점이 있다.

이러한 단점을 해결하기 위하여 미생물에 의한 만니톨 생산방법에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 만니톨 생산에 관련된 미생물로는 효모의 경우 캔디다 제이라노이드(Candida zeylannoide), 캔디다 리포리티카(Candida lipolitica), 크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans), 톨루롭시스 만니토파시엔스(Torulopsis mannitofaciens) 등이 있고, 세균의 경우 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 류코노스톡 메센테리오드(Leuconostoc mesenteriode)와 마이코박테리움 스메그마티스(Mycobacterium smegmatis) 등이 있으며, 곰팡이의 경우 뮤코 라우지(Mucor rouxii), 아스퍼질러스 니듀란스(Aspergillus nidulans), 페니실럼 스카브로섬(Penicillum scabrosum) 등이 있다. 미생물에 의한 방법은 경제성이 높고, 포도당 또는 과당으로부터 특이적으로 만니톨만 생산시킬 수 있어 반응 후 만니톨의 분리 정제과정을 매우 용이하게 할 수 있으나, 그 생산성 또는 수율이 낮은 단점 때문에 산업화에 어려움이 있다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 자일리톨 제조회사(Bolak Co., Ltd. 오산)의 발효 슬러지에서부터 고수율의 만니톨 생산 신균주 캔디다 마그노리아(Candida magnoliae)를 분리 동정 개발하고, 배양 조건을 최적화함으로써 만니톨을 고생산성 및 고수율로 제조하는 방법을 개발한 것이다.

본 발명은 천연슬러지에서 분리된 신균주 캔디다 매그노리아(Candida magnoliae)(기탁번호 KCCM-10252호)를 종배양하고, 종배양된 균주를 포도당, 과당, 질소원 및 무기염류를 함유하는 배지에서 발효 배양시켜 생성된 만니톨을 분리 정제함을 특징으로 하는 고수율 고생산성의 만니톨 제조방법 및 그 방법으로 제조된만니톨을 제공하는 것이다.

또한 상기 발효배지는 포도당 50∼100g/L, 과당 50∼120g/L, 효모추출물 5∼20g/L, 황산암모니움 1∼5g/L, 이인산칼륨 1.0∼5.0g/L 및 황산마그네슘 0.1∼0.5g/L을 포함함을 특징으로 하고, 상기 발효 배양시 교반속도는 200∼500rpm이고, 통기량은 0∼0.5vvm이며, pH는 4.5∼5.5이고, 배양온도는 27∼35℃임을 특징으로 한다.

한편, 상기 신균주 캔디다 매그노리아의 종배양은 포도당 15∼25g/L, 효모추출물 7∼13g/L 및 펩톤 15∼25g/L가 함유된 YPD 배지에서 수행하고, 균체농도가 3∼5g/L로 성장할 때까지 진탕배양시킴을 특징으로 한다.

또한 천연 슬러지의 시료를 희석한 후 포도당 10∼20g/L, 과당 18∼22g/L, 펩톤 15∼25g/L, 효모추출물 7∼15g/L, 아가(agar) 12∼17g/L가 포함된 평판을 이용하여 27∼33℃에서 빨리 성장하는 균주들을 중심으로 단일 군락(single colony)을 선별하고, 이들 선별된 균주들을 포도당 30∼70g/L, 과당 50∼100g/L, 효모추출물 5∼20g/L, 황산암모니움 1∼5g/L, 이인산칼륨 1∼5g/L로 구성된 배지에서 발효시간 68∼76시간 후에 만니톨을 가장 많이 생성하는 균을 선별함을 특징으로 하는 신균주 캔디다 매그노리아(Candida magnoliae)(기탁번호 KCCM-10252호)의 분리방법 및 분리된 만니톨 생성 신균주 캔디다 매그노리아(Candida magnoliae)(기탁번호KCCM-10252호)를 제공한다.

이하 본 발명의 신균주 캔디다 매그노리아의 분리방법을 설명하면 다음과 같다.

자일리톨 제조회사의 발효 슬러지 시료를 적당히 희석한 후 포도당 200∼400g/L, 펩톤 15∼25g/L, 효모추출물 7∼15g/L, 아가(agar) 12∼17g/L 가 포함된 평판을 이용하여 27∼33℃에서 빨리 생장하는 균주들을 중심으로 단일 군락(single colony)을 선별하였고, 이들 선별된 균주들을 포도당 30∼70g/L, 과당 50∼100g/L, 효모추출물 5∼20g/L, 황산암모니움 1∼5g/L, 이인산칼륨 1∼5g/L로 구성된 배지에서 발효시간 68∼76시간 후에 만니톨을 가장 많이 생산하는 균을 최종적으로 선별하였다.

균주의 동정은 26s rRNA의 염기서열을 분석하는 방법(Kurtzman & Robnett, 1998) 및 형태학적, 배양학적 및 생리학적 특성을 Yarrow(Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1998)의 방법에 준하여 조사하였고 Barnett 등 (Yeasts : Characteristics and identification. Cambridge university Press, London, 1983)의 분류방법에 따라 동정하였다. 선별된 균주의 26s rRNA의 염기서열 및 유사종과의 염기서열 분석결과는 각각 표 1과 표 2에 나타내었다.

만니톨 생성 신균주 캔디다 매그노리아의 26s rRNA 염기서열

5'-AACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCCCTAGTAATGGCGAATGAACAGGCAAAAGCTCAGATTTGAAACCCTCGGGATTGTAATCTGGAGACCTGGATTTGGCACGCTGACCAAGTCTTCTGGAACGGAGCGCCATGGAGGGTGACAGCCCCGTAGCAGCAGCCGCAGTAAATCCGGGTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTATGCTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAATGGAAGGCAATGAGGTGCGATTGACCCGGACGTTTGCGGGCAGCACAAAAGCGCAGGCCGCCTCGGCATTGCCTGCGTGCATACTGCCTCGCGGACCACCGGTTCTAACAACGCCTTATTGCAC-3'

만니톨 생성 신균주 캔디다 매그노리아와 유사종 간의 26s rRNA D1/D2 domain의 염기서열 유사성

균주	Accession No.	유사도%
Candida magnoliae NRRL Y-2024	U45722	100
Candida geochares NRRL Y-17073T	U48591	97.56
Candida vaccinii NRRL Y-17684T	U45708	95.77
Candida apis NRRL Y-2482T	U48237	94.89
Candida gropengiesseri NRRL Y-1445T	U45721	88.94
Starmerella bombicola NRRL Y-17069T	U45705	80.9
Candida etchellsii NRRL Y-17084T	U45723	80.32
Candida bombi NRRL Y-17081T	U45706	80
Candida floricola NRRL Y-17676T	U45710	80
Candida stellata NRRL Y-1446T	U45730	79.78
Candida apicola NRRL Y-2481T	U45703	79.28
Candida lactis-condensi NRRL Y-1515T	U45724	78.88
Candida blankii NRRL Y-17068T	U45704	76.8

또한 형태학적 특성, 생리학적 및 생화학적 특성은 표 3에 나타내었고, 신균주의 탄소원 대사 여부를 표 4에 나타내었다.

본 발명 신균주 캔디다 매그노리아(KCCM-10252호)의 형태적, 생리적, 생화학적 특성

특성	본 발명의 신균주(KCCM-10252호)
세포모양	Rod-coccus
균락색깔	흰색
포자생성	-
산소 요구성	호기성
운동성	-
온도별 균의 증식
20℃	+
30℃	+
35℃	+
40℃	-
비타민 제거 배지에서의 증식	-
요소분해	-
초산생성	-
전분형성	-
디아조니움 블루 B 형성	-
질산염의 이용	+

본 발명 신균주 캔디다 매그노리아(KCCM-10252호)의 탄소원 이용

탄소원	증식여부	탄소원	증식여부
D-글루코스	+	리비톨	-
글리세롤	+	a-메틸-D-글루코사이드	-
2-케토-D-글루코네이트	-	N-아세틸-D-글루코사민	-
L-아라비노스	-	셀로비오스	-
D-자일로스	-	락토스	-
아도니톨	-	말토스	-
자일리톨	-	사카로스/수크로스	+
갈락토스	-	트레할로스	-
이노시톨	-	멜레지토스	-
솔비톨	+	라피노스	+

이상과 같은 균주의 특성을 동정한 결과 본 균주는 캔디다 매그노리아 종의 균주로 판명되었고, 신균주 캔디다 매그노리아(Candida magnoliae)를 한국미생물보존협회에 2001년 3월 5일 기탁번호 KCCM-10252호로 기탁하였다.

본 발명의 만니톨 발효 생성법을 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 균주의 종배양을 위한 성장배지로는 포도당 15∼25g/L, 효모추출물 7∼13g/L 및 펩톤 15∼25g/L가 함유된 YPD 배지를 사용하였고, 플라스크의 발효배지로는 탄소원으로 포도당 50g/L 및 과당 100g/L, 질소원으로는 효모 추출물 및 황산암모니움, 무기염으로는 이인산칼륨, 황산마그네슘으로 구성된 배지를 사용하였다. 각 성분의 양은 만니톨의 생산성을 높이기 위하여 변화시킬 수 있다. 발효조에서 사용한 배지는 유가식으로 총 첨가된 농도 300g/L인 과당, 포도당 50g/L, 효모 추출물 10g/L, 이인산칼륨 2.5g/L, 황산암모니움 2.5g/L, 황산마그네슘 0.4g/L로 구성된 최적배지이었다.

종배양은 냉동 보관된 균주를 YPD 배지 50ml가 들어있는 250ml의 플라스크에 접종하여 진탕 배양기에서 230∼270rpm, 27∼33℃로 균체 농도가 3∼4g/L (약 24시간)로 성장할 때까지 수행하였다. 플라스크 배양에서는 배지의 5%에 해당되는 종배양액을 발효 배지 50ml가 들어있는 250ml의 플라스크에 접종하여 진탕 배양기에서 210∼230rpm, 27∼33℃로 하여 68∼76시간동안 배양하였다.

유가식 발효조 배양에서는 발효초기에 100g/L의 과당이 함유된 배지 부피가 2L인 5L 발효조(한국배양기(주))를 사용하였으며, 발효과정 중에 교반속도는 200∼500rpm으로 조절하였고 통기량은 0∼0.5vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정동안 4.5∼5.5로 조절하였고 배양온도는 27∼33℃이었으며, 유지되는 과당의 농도는 50∼120g/L로 조절하였다.

포도당, 과당, 만니톨의 농도는 Carbohydrate Analysis 칼럼(Waters, USA)이 장착된 HPLC의 Refractive Index Detector (Waters 2410, USA)를 이용하여 측정하였다. 이때, 용매는 아세토니트릴(acetonitrile)과 물을 8 : 2로 섞어 사용하였고, 유속은 1.5 ml/분이었다. 균체농도는 탁도계를 이용하여 600nm에서 현탁도를 측정하여 미리 측정한 표준곡선을 이용하여 건조중량으로 전환하였다. 용존산소 농도는 Ingold사(Swiss, polarographic type)의 용존산소전극을 사용하여 특정하였다.

본 발명을 실시예에 따라 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

(실시예 1)

종배양 : 자일리톨 제조회사의 발효 슬러지로부터 분리한 균주 캔디다 매그노리아(KCCM-10252호)를 YPD 배지 50ml가 들어있는 250ml 플라스크에 접종하여 250rpm, 30℃로 24시간 배양하였다.

본배양 : 종 배양액을 발효배지 50ml가 함유된 250ml 플라스크에 접종한 후, 진탕배양기로 220rpm에서 30℃로 과당이 완전히 소모될 때까지 배양하였고, 배지의 pH는 발효 초기에 5.0으로 조절한 후 조절하지 않았다. 이때 배지 성분은 포도당 50g/L, 과당 100g/L, 효모추출물 5g/L, 황산암모니움 2.5g/L, 이인산칼륨 2.5g/L이었다. 시간경과에 따른 만니톨의 생산을 살펴본 결과를 표 5에 나타내었다. 분리균주의 최대 비증식속도는 0.26h^-1, 최대균체량은 3.9g/L 이었고 42g/L의 만니톨이 생산되었다.

250 ml 플라스크에서 분리균주의 시간에 따른 만니톨의 생성

배양시간	균체(g/L)	만니톨(g/L)
0	0.07
12	0.78
18	2.91	0.8
36	3.72	9.1
48	3.84	21.3
60	3.91	33.6
72	3.93	42.2

(실시예 2)

배양방법은 실시예 1과 같고, 포도당 50g/L, 과당 100g/L, 황산암모니움 2.5g/L, 이인산칼륨 2.5g/L, 효모 추출물 5g/L의 질소 함량에 준하는 각각의 질소원으로 구성된 발효배지에서 발효시간 72시간 후 여러 가지 질소원이 만니톨의 생산에 미치는 영향을 살펴보았다. 여러 가지 질소원에서 배양한 결과를 표 6에 나타내었다. 만니톨은 효모추출물(yeast extract)과 효모질소(yeast nitrogen base)를 제외한 다른 유기 질소원에서는 낮은 농도를 나타내었고, 효모추출물이 가장 좋은 질소원이었다.

250 ml 플라스크에서 만니톨의 생성에 미치는 질소원의 영향

질소원	균체(g/L)	만니톨(g/L)
효모추출물	3.93	42.2
효모질소	4.20	32.2
트립톤	2.62	15.3
대두박	3.86	6.8
옥수수 침지액	1.25	3.6
맥아 추출물	2.41	3.5
펩톤	2.24	2.8

(실시예 3)

배양방법은 실시예 1과 같고, 본 배양에서 발효 배지를 포도당 50g/L, 과당 100g/L, 황산암모니움 2.5g/L, 효모 추출물, 이인산칼륨 2.5g/L로 하여 이 중 효모 추출물의 농도를 변화시켜 72시간 동안 배양한 결과를 표 7에 표시하였다.

250 ml 플라스크에서 효모 추출물 농도별 만니톨의 생성량

효모 추출물(g/L)	균체(g/L)	만니톨(g/L)
0	0.0	0.0
1	0.7	0.0
2	2.2	8.8
5	3.9	42.2
7	4.1	45.6
10	4.0	48.5
15	3.4	43.1
20	2.3	34.4

(실시예 4)

배양방법은 실시예 1과 같고, 본 배양에서 발효 배지를 포도당 50g/l, 과당 100g/L, 효모 추출물 10g/L, 황산암모니움 2.5g/L, 이인산칼륨으로 하고, 이 중 이인산칼륨의 농도를 변화시키면서 72시간 동안 배양한 결과를 표 8에 표시하였다.

250 ml 플라스크에서 이인산칼륨 농도별 만니톨의 생성량

이인산칼륨(g/L)	균체(g/L)	만니톨(g/L)
0	0.0	0.0
1	3.6	45.2
2.5	4.0	48.8
5	3.9	46.0
10	3.4	40.9

(실시예 5)

배양방법은 실시예 1과 같고, 본 배양에서 발효 배지를 과당 100g/L, 효모 추출물 10g/L, 이인산칼륨 2.5g/L, 황산암모니움 2.5g/L, 황산마그네슘으로 하고 이중 황산마그네슘의 농도를 변화시키면서 30시간 동안 배양한 결과를 표 9에 표시하였다.

250 ml 플라스크에서 황산마그네슘 농도별 만니톨의 생성량

pH	균체(g/L)	만니톨(g/L)	배양시간(h)
4.0	9.2	62.8	60
4.5	11.3	74.1	60
5.0	12.0	78.0	60
5.5	12.4	75.2	60
6.0	12.2	68.7	60

(실시예 6)

종배양은 실시예 1과 같고, 본 배양에서 최적발효배지(포도당 50g/L, 과당100g/L, 효모 추출물 10g/L, 황산암모니움 2.5g/L, 이인산칼륨 2.5g/L, 황산마그네슘 0.4g/L)가 3L인 5L 발효조를 사용하여 배양하였다. 배양온도 30℃에서 여러 pH별 실험을 수행하였다. 통기량은 0.5 vvm, 교반속도는 200∼500rpm으로 조절하여 주고, pH를 변화시켜 과당이 완전히 소모될 때까지 배양한 결과를 표 10에 표시하였다.

5L 발효조에서 pH별 만니톨의 생성량

온도(℃)	균체(g/L)	만니톨(g/L)	배양시간(h)
25	7.8	66.5	120
27	11.9	75.7	92
30	12.0	78.2	60
33	10.5	75.3	72
35	8.2	74.0	80

(실시예 7)

배양방법과 발효배지는 실시예6과 같고, 본 배양에서는 배양 pH는 5.0으로 하여 배양온도별 실험을 수행하였고 그 결과를 표 11에 표시하였다.

5L 발효조에서 온도별 만니톨의 생성량

황산마그네슘(g/L)	균체(g/L)	만니톨(g/L)
0.0	4.0	48.6
0.1	4.0	49.5
0.2	4.1	50.3
0.4	4.1	52.0
0.6	4.0	48.2
0.8	3.8	44.8

(실시예 8)

선정된 최적배지(효모 추출물 10g/L, 이인산칼륨 2.5g/L, 황산마그네슘 0.4g/L)에서 과당의 농도를 300g/L로 증가시켜 발효조에서 유가식 배양을 수행하였다. 이때 유가식 배양을 수행한 이유는 캔디다 매그노리아의 경우 100g/L 이상의 과당에서는 만니톨 생산속도가 저하되었기 때문이었다. 배양은 발효초기에 탄소원으로 50g/L의 포도당이 함유된, 배지 부피가 2L인 5L 발효조(한국발효기(주))를 사용하였다. 발효과정 중에 225g의 과당이 함유된 250ml의 용액을 4번(20h, 36h, 62h, 90h) 추가하여 최종배양액의 부피가 3L(총 첨가된 과당의 농도는 300 g/L에 해당)가 되는 유가식 배양을 하였다. 용존산소는 교반속도를 500∼600rpm으로 조절하여 배양초기에는 20%이상 유지시키고 균체농도가 약 5g/L되는 시점에서 교반속도를 200∼350rpm으로 변화시켜 용존산소를 제한하였다. pH는 발효 전 과정 동안 5.0, 배양온도는 30℃, 통기량은 0.5 vvm으로 조절하였으며, 시간에 따른 만니톨의 생산은 표 12에 나타내었다. 이와같이 유가식 배양 방법에 의해 300g/L의 과당으로부터 120시간만에 248g/L의 만니톨을 얻었으며, 이러한 결과는 과당에 대한 만니톨의 수율 83%와 만니톨의 생산성 2.07g/L-h에 해당되는 것이다.

5L 발효조에서 300 g/L의 과당으로부터 시간별 만니톨의 생성량

배양시간(h)	균체(g/L)	만니톨(g/L)
0	0.1	0
12	6.4	0
24	10.4	8.0
36	12.8	24.3
48	12.2	46.4
60	11.0	100.1
72	10.4	152.7
84	9.8	199.2
96	9.6	214.6
108	9.0	226.6
120	8.5	248.0

본 발명의 효과는 천연슬러지에서 분리된 신균주 캔디다 매그노리아(Candida magnoliae)를 이용하여 포도당 50~100g/L, 과당 50∼120g/L, 효모추출물 5∼20g/L, 이인산칼륨 1.0∼5.0g/L 및 황산마그네슘 0.1∼0.5g/L을 함유하는 배지에서 배양하여 고수율·고생산성으로 만니톨을 생산할 수 있다. 이는 종래의 화학합성 및 발효방법에 비해 선택적, 경제적, 효과적으로 만니톨을 발효 생산하게 된 것으로 제품 품질 및 국제 경쟁력에서도 비교우위를 점할 수 있다.

Claims

천연슬러지에서 분리된 신균주 캔디다 매그노리아(Candida magnoliae)(기탁번호 KCCM-10252호)를 종배양하고, 종배양된 균주를 포도당, 과당, 질소원 및 무기염류를 함유하는 배지에서 발효 배양시켜 생성된 만니톨을 분리 정제함을 특징으로 하는 고수율 고생산성의 만니톨 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 발효배지는 포도당 50∼100g/L, 과당 50∼120g/L, 효모추출물 5∼20g/L, 황산암모니움 1∼5g/L, 이인산칼륨 1.0∼5.0g/L 및 황산마그네슘 0.1∼0.5g/L을 포함함을 특징으로 하는 만니톨의 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 발효 배양시 교반속도는 200∼500rpm이고, 통기량은 0∼0.5vvm이며, pH는 4.5∼5.5이고, 배양온도는 27∼35℃임을 특징으로 하는 만니톨의 제조방법
제 1항에 있어서, 상기 신균주 캔디다 매그노리아의 종배양은 포도당 15∼25g/L, 효모추출물 7∼13g/L 및 펩톤 15∼25g/L가 함유된 YPD 배지에서 수행하고, 균체농도가 3∼5g/L로 성장할 때까지 진탕배양시킴을 특징으로 하는 만니톨의 제조방법
천연 슬러지의 시료를 희석한 후 포도당 10∼20g/L, 과당 18∼22g/L, 펩톤 15∼25g/L, 효모추출물 7∼15g/L, 아가(agar) 12∼17g/L가 포함된 평판을 이용하여 27∼33℃에서 빨리 성장하는 균주들을 중심으로 단일 군락(single colony)을 선별하고, 이들 선별된 균주들을 포도당 30∼70g/L, 과당 50∼100g/L, 효모추출물 5∼20g/L, 황산암모니움 1∼5g/L, 이인산칼륨 1∼5g/L로 구성된 배지에서 발효시간 68∼76시간 후에 만니톨을 가장 많이 생성하는 균을 선별함을 특징으로 하는 신균주 캔디다 매그노리아(Candida magnoliae)(기탁번호 KCCM-10252호)의 분리방법
제 5항의 방법에 따라 분리된 만니톨 생성 신균주 캔디다 매그노리아(Candida magnoliae)(기탁번호 KCCM-10252호)