KR100355846B1

KR100355846B1 - 팔라티노스 정제과정 중 발생되는 모액을 이용한에리스리톨의 제조방법

Info

Publication number: KR100355846B1
Application number: KR1019990052917A
Authority: KR
Inventors: 정수련; 노봉수; 오덕근; 김상용; 김경아; 이정걸
Original assignee: 주식회사 보락; 주식회사 바이오앤진
Priority date: 1999-11-26
Filing date: 1999-11-26
Publication date: 2002-10-18
Also published as: KR20010048273A

Abstract

본 발명은 토룰라(Torulasp.)속 변이주(기탁번호 KCCM-10171호)를 팔라티노스 정제과정 중 발생되는 트레할룰로스 30∼60%, 팔라티노스 10∼30%, 과당 5∼15%, 포도당 5∼25%, 설탕 0∼10%로 구성된 팔라티노스 정제 모액 배지에서 발효 배양하여 고수율 고생산성의 에리스리톨의 제조방법을 제공하는 것이다.

Description

팔라티노스 정제과정 중 발생되는 모액을 이용한 에리스리톨의 제조방법{A process for preparing erythritol using mother liquor produced from purification process of palatinose}

본 발명은 토룰라 변이주(Torulasp. 돌연변이주로 한국미생물보존협회 기탁번호 KCCM-10171호로 기탁)를 생산배지로 팔라티노스 정제과정 중 발생되는 모액을 이용하여 고농도의 에리스리톨(erythritol)을 생산하는 방법에 관한 것이다.

에리스리톨은 사탄당 알코올로 올리고당이나 자일리톨과 더불어 대표적인 기능성 감미료로 자연계에 광범위하게 존재하고 있다. 에리스리톨은 해초류, 버섯및 과실류 비롯하여 포도주나 맥주, 된장 등의 발효식품에서도 검출된다. 에리스리톨의 당도는 설탕의 70∼80%이고 용해될 때 열 감소가 일어나 입안에서 느끼는청량감이 큰 특성이 있고 용해도가 낮아 결정이 잘 생기는 성질이 있다. 이러한 성질들로 인하여 에리스리톨은 청량감과 결정성이 필수적인 캔디 등의 제과제품의 무설탕 원료로 사용되고 있다. 에리스리톨은 저 칼로리 감미료로 체내에서 에너지원으로 이용되지 않고 소변으로 대부분 배출되며, 충치균에 의해서 이용되지 않기 때문에 충치 예방효과도 가지고 있다.

에리스리톨의 생산에는 추출법, 화학합성법 및 발효법이 있다. 이중 추출법은 과일이나 채소 등의 자연상태에서 극히 미량으로만 존재하기 때문에 산업적으로 경제성이 없다. 화학합성법은 원료물질이 고가이기 때문에 경제성이 없어 대량생산에 이용되고 있지 못하고 있다. 따라서 발효법은 화학합성법의 단점을 극복할 수 있는 방안으로 연구가 활발히 진행되고 있다.

발효법에 의한 에리스리톨의 생산은 주로 효모에 의해서 일어나고 지금까지 여러 가지 효모가 보고되고 있다. 이 중 모닐리엘라 토멘토사 바 폴리니스 (Moniliella tomentosavar.pollinis) 균주는 포도당으로부터 41% 라는 고수율로 에리스리톨을 생산하였지만 글리세롤, 리비톨 등이 부산물로 많이 생성되기 때문에 상업화에는 이르지 못했다. 또한, 상업적 생산에 이용되고 있는 균주로는 오레오바시디움(Aureobasidiumsp.)속 균주 등이 있는데 이 균주는 일본의 농림수산성 식품종합연구소와 일연화학의 공동연구에 의하여 분리 동정되었다.

자연에서 분리한 오레오바시디움속 야생균주는 에리스리톨 생산성과 내당성에 있어서도 만족할만하지 못했지만 이 균주를 돌연변이시켜 생산성과 내당성의 향상된 돌연변이주를 얻을 수 있었다. 이 변이주는 포화 포도당 농도(83.3%)에서도 발효가 가능하고 포도당 농도 40∼50%에서 2 g/L-h의 에리스리톨 생산성을 보였다. 또한, 포도당으로부터 에리스리톨의 수율이 45%(w/w)로 높은 수준이었으며 부산물은 소량의 글리세롤을 생성하였다.

그러나, 발효에 의한 에리스리톨의 생산에서는 주원료인 포도당이 제조원가에서 가장 많은 부분을 차지하고 있다. 제조원가를 낮추려면은 에리스리톨의 수율과 생산성이 높여야하고 주원료의 가격을 내려야 한다. 에리스리톨의 수율과 생산성이 높이는 것은 균주개발과 공정개발로 가능하지만 어느 정도 이상은 불가능하다. 주원료의 가격은 고정된 가격으로 절감하기가 어렵지만, 가격이 전혀 없는 당 제조과정 중 발생하는 폐액을 사용하면 제조원가를 획기적으로 절감할 수 있다.

따라서, 본 발명자들은 팔라티노스 정제과정 중 발생되는 폐액의 주성분이 설탕, 팔라티노스(Palatinose), 트레할룰로스(Trehalulose) 등으로 구성되어 있어 좋은 에리스리톨 생산 원료임을 발견하고, 이 폐액을 탄소원으로 사용하여 고수율, 고생산성의 에리스리톨 발효 제조방법을 발명하여 본 발명을 완성한 것이다.

따라서 본 발명의 목적은 토룰라(Torulasp.)속 변이주(기탁번호 KCCM-10171호)를 팔라티노스 정제과정 중 발생되는 트레할룰로스 30∼60%, 팔라티노스 10∼30%, 과당 5∼15%, 포도당 5∼25%, 설탕 0∼10%로 구성된 팔라티노스 정제 모액 배지에서 발효 배양하여 고수율 고생산성의 에리스리톨의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한 이때, 배양 배지인 팔라티노스 정제 모액 중 당농도가 20∼50%임을 특징으로 하고, 배양 배지인 팔라티노스 정제 모액 중 탄소원으로는 20∼50% 트레할룰로스 또는 20∼50% 팔라티로스를 포함함을 특징으로 하는 에리스리톨의 제조방법 및 그 방법에 따라 제조된 에리스리톨을 제공하는 것이다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 고수율 에리스리톨을 생산할 수 있는 변이주 및 그의 분리 방법을 설명하면 다음과 같다.

38∼42% 설탕용액에서 대기로부터 에리스리톨을 생산하는 야생 균주를 선택하였다. 단일 콜로니는 성장배지(18∼22% 포도당과 0.9∼1.1% 효모 추출물 포함) 50㎖을 포함한 250㎖ 플라스크에서 배양하였다. 600 nm에서 배양액의 흡광도 (optical density)가 1.0에 도달할 때까지 27∼33℃ 온도로, 교반 속도 220∼280 rpm에서 배양하였다. 성장 균주는 3,000 g에서 20분간 원심분리하여 선택하고 pH 5.0∼6.0의 0.1 M 구연산염 완충액으로 세척한다. 선택된 균주는 0.009∼0.011% NTG(N-methyl-N-nitro-nitroguanidine)를 포함하는 완충 용액으로 현탁하고 27∼33℃ 온도에서 25∼35분간 배양한다. NTG 처리 후, 균주은 YM 모액(YM broth)에서 27∼33℃ 온도로 8∼12시간 배양하고 고수율 에리스리톨 생산 변이주를 선택하기 위해 38∼42% 포도당과 1.8∼2.2% 효모 추출물을 포함한 아가 플레이트(agar plate)에 도말한다.

선택된 콜로니는 진탕 플라스크에서 에리스리톨 생성 활성도를 시험하기 위해서 18∼22% 포도당과 0.9∼1.1% 효모 추출물을 포함하는 발효 배지로 옮긴다. 27∼33℃ 온도, 교반 속도 220∼280 rpm으로 100 ∼160 시간 배양한 후, 고수율 에리스리톨 생산 변이주는 선택되고, 콜로니는 3번 이상의 반복 분리 방법에 의해 분리된다. 얻어진 콜로니는 다시 도말하고 250∼270 nm의 자외선 조명하에서 18∼22% 포도당과 0.9∼1.1% 효모 추출물을 포함한 배지에서 배양한다. 마지막으로, 생성된 콜로니는 분리되고 변이주를 얻어 본 발명의 생산 균주로서 사용하였다.

선택된 변이주는 포도당으로부터 에리스리톨 수율, 용적 생산성(volumetric productivity) 및 내당성(sugar tolerance)에 있어서 야생균주보다 우수한 특성을 지니고 있다.

고수율 에리스리톨 생산 변이주의 특성

포도당으로부터 에리스리톨을 생산할 수 있는 균주는 선택되었고 토룰라 (Torulasp.)속으로 동정되었다. 고수율 에리스리톨 생산 변이주의 균학적 특성은 다음과 같다.

ⅰ) 성상(description)

크림 콜로니; 버딩(budding)에 의해 영양생식할 수 있음; 필라멘트 (filament) 없음; 유성생식 불가

ⅱ) 본 균주의 발효성을 표1에 나타내었다.

발효성(탄소원동화성)

기질	발효 유무	기질	발효 유무
D-포도당	+	유당	-
D-갈락토스	-	셀로비오스(cellobiose)	-
D-만노스	+	멜레지토스(melezitose)	-
D-과당	+	라피노스(raffinose)	-
맥아당(maltose)	-	녹말	-
설탕	+	이눌린(inulin)	-
트레할로스(trehalose)	-	D-자일로스(xylose)	-
멜리비오스(melibiose)	-

ⅲ) 본 균주의 성장배지로 사용할 수 있는 탄소원, 질소원 및 성장조건 등을 표2에 나타내었다.

기질	생장 유무	기질	생장 유무
D-포도당	+	D-만니톨(mannitol)	+
D-갈락토스	+	갈락티톨(galactitol)	-
D-만노스	+	myo-이노시톨(inositol)	-
D-과당	+	D-글루코네이트(gluconate)	+
L-소르보스(sorbose)	+	D-글루쿠로네이트(glucuronate)	-
D-글루코사민(glucosamine)	-	D-갈락투로네이트(galacturonate)	-
D-리보오스(ribose)	+	DL-젖산염(lactate)	-
D-자일로스	+	호박산염(succinate)	+
D-아라비노스(arabinose)	+	구연산염	+
L-람노스(rhamnose)	+	메탄올	-
맥아당	-	에탄올	-
설탕	+	프로판다이올(propanediol)	-
팔라티노스(palatinose)	+	질산염	-
트레할룰로스(trehalulose)	+	에틸아민	+
트레할로스	-	L-라이신	+
멜리비오스	-	카다베린(cadaverine)	+
살리신(salicin)	+	크레아틴	-
아부틴(arbutin)	+	크레아티닌	-
유당	-	글루코사민	-
셀로비오스	-	이미다졸(imidazole)	-
멜레지토스	-	비타민 결핍	-
라피노스	-	25℃	+
녹말	-	37℃	+
이눌린	-	40℃	-
글리세롤	+	0.01% 시클로헥시미드	+
에리스리톨	-	0.1% 시클로헥시미드	-
리비톨(ribitol)	+	1.0% 아세트산	-
자일리톨(xylitol)	+	50% D-포도당	+
L-아라비니톨(arabinitol)	-	60% D-포도당	+
D-글루시톨(glucitol)	+	70% D-포도당	-

ⅳ) 본 균주의 부가적 대사특성을 표 3에 나타내었다.

	특성 유무		특성 유무
녹말 형성	-	요소 가수분해	-
아세트산 생성	-	디아조니움 블루 B 반응(diazonium Blue B reaction)	-

이 변이주는 한국미생물보존협회에 1999년 9월 7일 부다페스트 조약에 의거기탁번호 제KCCM-10171호로 국제기탁하였다.

본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

성장배지로는 포도당 18∼22%, 효모추출물 0.9∼1.1%로 구성된 배지를 사용하였고, 발효 생산배지는 탄소원으로 팔라티노스 정제 모액에 효모 추출액 및 0.3% 일인산칼륨(KH₂PO₄)을 첨가한 배지를 사용하였다. 즉 탄소원으로는 30∼60% 트레할룰로스, 10∼30% 팔라티노스, 5∼15% 과당, 5∼25% 포도당 및 0∼10% 설탕으로 구성된 팔라티노스 정제 모액을 사용하였다.

종배양은 보관된 토룰라의 단일 군락을 성장배지 5 mL가 들어있는 20 mm 직경의 테스트 튜브에 접종하여 진탕배양기에서 교반 속도 220∼280 rpm, 28∼32℃ 온도로 43∼52시간 동안 배양하였다. 5 mL의 배양액을 100 mL의 성장배지가 들어있는 500 mL의 플라스크에 접종하여 교반 속도 220∼280 rpm, 28∼32℃ 온도로 22∼26시간 동안 배양하였다. 본 배양은 5 L 발효조(한국발효기(주))를 사용하여 배양을 수행하였다.

배지부피가 3 L 이었고 발효과정 중에 교반속도는 발효 24시간 전까지 용존산소가 20% 이상 유지되는 범위에서 500∼800 rpm으로 조절하였고 24시간 이후에는600 rpm으로 고정하였다. 통기량은 배양과정 중에 0.4∼0.6 vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정 동안 5.0∼6.0으로 조절하였고 배양온도는 32∼36℃이었다.

에리스리톨의 농도는 탄수화물 분석칼럼(Carbohydrate analysis column, Waters, USA)이 장착된 HPLC(Shimadzu C-R6A, Japan)의 귤절률 검출기(Refractive Index Detector : Shimadzu RID-6A, Japan)를 이용하여 측정하였다. 이때, 용매는 아세토니트릴(acetonitrile)과 물을 8 대 2로 섞어 사용하였고, 유속은 2.0 mL/min이었다. 균체농도는 분광계를 이용하여 600nm에서 현탁도를 측정하여 미리 측정한 표준곡선을 이용하여 건조중량으로 전환하였다. 포도당의 농도는 포도당 산화효소(영동제약, 한국)를 사용하여 측정하였다. 용존산소의 농도는 인골드사 (Ingold : Swiss, polarographic type)의 용존산소 전극을 사용하여 측정하였다.

본 발명을 실시 예에 따라 상술하면 다음과 같다.

(실시예 1)

종 배양 : 보관된 토룰라의 단일 군락을 성장배지 5 mL가 들어있는 20 mm 직경의 테스트 튜브에 접종하여 진탕배양기에서 250 rpm, 30℃로 48시간 동안 배양하였다. 5 mL의 배양액을 100 mL의 성장배지가 들어있는 250 mL의 플라스크에 접종하여 250 rpm, 30℃로 24시간 동안 배양하였다.

본 배양 : 5 L 발효조(한국발효기(주))에서 본배양을 수행하였다. 배양에서 설탕이 함유된 배지부피가 3 L 이었고 발효과정 중에 교반속도는 발효 24시간 전까지 용존산소가 20% 이상 유지되는 범위에서 500에서 800 rpm으로 조절하였고 24시간 이후에는 600 rpm으로 고정하였다. 통기량은 0.3에서 0.5 vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정 동안 5.5로 조절하였고 배양온도는 34℃이었다. 배지성분은 설탕과 효모 추출물이 함유되어 있고 이 외 0.3% 일인산칼륨(KH₂PO₄)으로 구성되어있다. 팔라티노스의 정제 모액의 구성성분인 설탕의 농도에 따라 에리스리톨의 생산을 살펴본 결과를 표 4에 나타내었다. 이때, 수율은 소비된 설탕에 대한 것이다.

토룰라 속 변이주를 이용하여 발효조에서 설탕의 농도에 따른 에리스리톨의 생산

설탕/효모추출물(g/L)/(g/L)	에리스리톨(g/L)	수율 (%)	생산성(g/L.h)
300/15	132.0	44.0	1.07
400/20	190.0	47.5	1.58
500/25	222.5	44.5	1.55

(실시예 2)

본 배양 : 5 L 발효조(한국발효기(주))에서 본배양을 수행하였다. 배양에서 설탕이 함유된 배지부피가 3 L 이었고 발효과정 중에 교반속도는 발효 24시간 전까지 용존산소가 20% 이상 유지되는 범위에서 500에서 800 rpm으로 조절하였고 24시간 이후에는 600 rpm으로 고정하였다. 통기량은 0.3에서 0.5 vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정 동안 5.5로 조절하였고 배양온도는 34℃이었다. 배지성분은 설탕과 효모 추출물이 함유되어 있고 이 외 0.3% 일인산칼륨(KH₂PO₄)으로 구성되어있다. 팔라티노스의 정제 모액의 구성성분인 팔라티노스의 농도에 따라 에리스리톨의 생산을 살펴본 결과를 표 5에 나타내었다. 이때, 수율은 소비된 팔라티노스에 대한 것이다.

토룰라 속 변이주를 이용하여 발효조에서 팔라티노스의 농도에 따른 에리스리톨의 생산

팔라티노스/효모추출물(g/L)/(g/L)	에리스리톨(g/L)	수율(%)	생산성(g/L.h)
300/15	110.0	36.7	0.92
400/20	160.0	40.0	1.33
500/25	180.0	38.0	1.29

(실시예 3)

본 배양 : 5 L 발효조(한국발효기(주))에서 본배양을 수행하였다. 배양에서 설탕이 함유된 배지부피가 3 L 이었고 발효과정 중에 교반속도는 발효 24시간 전까지 용존산소가 20% 이상 유지되는 범위에서 500에서 800 rpm으로 조절하였고 24시간 이후에는 600 rpm으로 고정하였다. 통기량은 0.3에서 0.5 vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정 동안 5.5로 조절하였고 배양온도는 34℃이었다. 배지성분은 설탕과 효모 추출물이 함유되어 있고 이 외 0.3% 일인산칼륨(KH₂PO₄)으로 구성되어있다. 팔라티노스의 정제 폐액의 구성성분인 트레할룰로스의 농도에 따라 에리스리톨의 생산을 살펴본 결과를 표 6에 나타내었다. 이때, 수율은 소비된 트레할룰로스에 대한 것이다.

토룰라 속 변이주를 이용하여 발효조에서 트레할룰로스의 농도에 따른 에리스리톨의 생산

트레할룰로스/효모추출물(g/L)/(g/L)	에리스리톨(g/L)	수율(%)	생산성(g/L.h)
300/15	90.0	30.0	0.75
400/20	140.0	35.0	1.17
500/25	170.0	34.0	1.21

(실시예 4)

본 배양 : 5 L 발효조(한국발효기(주))에서 본배양을 수행하였다. 배양에서 설탕이 함유된 배지부피가 3 L 이었고 발효과정 중에 교반속도는 발효 24시간 전까지 용존산소가 20% 이상 유지되는 범위에서 500에서 800 rpm으로 조절하였고 24시간 이후에는 600 rpm으로 고정하였다. 통기량은 0.3에서 0.5 vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정 동안 5.5로 조절하였고 배양온도는 34℃이었다. 배지성분은 47.5% 트레할룰로스 20% 팔라티노스, 17.5% 과당 및 15% 포도당으로 구성 된 팔라티노스의 정제 모액과 효모 추출물이 함유되어 있고 이 외 0.3%일인산칼륨(KH₂PO₄)이 함유되어있다. 팔라티노스의 정제 모액을 총당 농도에 따라 에리스리톨의 생산을 살펴본 결과를 표 7에 나타내었다. 이때, 수율은 소비된 총당에 대한 것이다.

토룰라 속 변이주를 이용하여 발효조에서 팔라티노스 정제 모액의 농도에 따른 에리스리톨의 생산

총당/효모추출물(g/L)/(g/L)	에리스리톨(g/L)	수율(%)	생산성(g/L.h)
300/15	120.0	40.0	1.00
400/20	160.0	40.0	1.33
500/25	190.0	38.0	1.27

(실시예 5)

본 배양 : 5 L 발효조(한국발효기(주))에서 본배양을 수행하였다. 배양에서 설탕이 함유된 배지부피가 3 L 이었고 발효과정 중에 교반속도는 발효 24시간전까지 용존산소가 20% 이상 유지되는 범위에서 500에서 800 rpm으로 조절하였고 24시간 이후에는 600 rpm으로 고정하였다. 통기량은 0.3에서 0.5 vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정 동안 5.5로 조절하였고 배양온도는 34℃이었다. 배지성분은 총당이 40%인 팔라티노스 정제 모액과 2.0% 효모 추출물이 함유되어 있고 이 외 0.3% 일인산칼륨(KH₂PO₄)으로 구성되어있다. 시간에 따른 에리스리톨의 생산을 살펴본 결과를 표 8에 나타내었다.

토룰라 속 변이주를 이용하여 발효조에서 40% 팔라티노스 정제 모액으로부터 에리스리톨의 생산

시간(h)	균체(g/L)	에리스리톨(g/L)
0	0.1
24	2.8	5.2
40	8.2	48.2
62	12.5	76.5
80	17.8	102
96	18.9	126
120	21.4	160

(비교예 1)

본 배양 : 5 L 발효조(한국발효기(주))에서 본배양을 수행하였다. 배양에서 설탕이 함유된 배지부피가 3 L 이었고 발효과정 중에 교반속도는 발효 24시간 전까지 용존산소가 20% 이상 유지되는 범위에서 500에서 800 rpm으로 조절하였고 24시간 이후에는 600 rpm으로 고정하였다. 통기량은 0.3에서 0.5 vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정 동안 5.5로 조절하였고 배양온도는 34℃이었다. 배지성분은 40% 포도당과 2.0% 효모 추출물이 함유되어 있고 이 외 0.3% 일인산칼륨(KH₂PO₄)으로 구성되어있다. 시간에 따른 에리스리톨의 생산을 살펴본 결과를 표 9에 나타내었다.

토룰라 속 변이주를 이용하여 발효조에서 40% 포도당으로부터 에리스리톨의 생산

시간(h)	균체(g/L)	에리스리톨(g/L)
0	0.1
24	7.2	8.1
40	24.5	50.2
62	26.5	98.5
80	27.5	120
96	29.3	145
120	31.0	170

본 발명의 효과는 팔라티노스 정제과정 중 발생되는 폐액의 주성분이 설탕, 팔라티노스(Palatinose), 트레할룰로스(Trehalulose) 등으로 구성되어 있어 좋은 에리스리톨 생산 원료로 사용하여, 그 폐액을 탄소원으로 사용하여 고수율, 고생산성의 에리스리톨 발효 제조방법을 제공하는 것이다. 더욱 상세히는 토룰라(Torulasp.)속 변이주(기탁번호 KCCM-10171호)를 팔라티노스 정제과정 중 발생되는 트레할룰로스 30∼60%, 팔라티노스 10∼30%, 과당 5∼15%, 포도당 5∼25%, 설탕 0∼10%로 구성된 팔라티노스 정제 모액 배지에서 발효 배양하여 고수율 고생산성의 에리스리톨의 제조방법을 제공하는 것이다.

Claims

토룰라(Torulasp.)속 변이주(기탁번호 KCCM-10171호)를 팔라티노스 정제과정 중 발생되는 트레할룰로스 30∼60(w/v)%, 팔라티노스 10∼30(w/v)%, 과당 5∼15(w/v)%, 포도당 5∼25(w/v)%, 설탕 0∼10(w/v)%로 구성된 팔라티노스 정제 모액 배지에서 발효 배양시킴을 특징으로 하는 고수율 고생산성의 에리스리톨의 제조방법
제 1항에 있어서, 배양 배지인 팔라티노스 정제 모액 중 당농도가 20∼50(w/v)%임을 특징으로 하고, 배양 배지인 팔라티노스 정제 모액 중 탄소원으로는 20∼50(w/v)% 트레할룰로스 또는 20∼50(w/v)% 팔라티로스를 포함함을 특징으로 하는 에리스리톨의 제조방법
에리스리톨 제조용 토룰라(Torulasp.)속 변이주(기탁번호 : KCCM-10171호)
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