KR100339277B1

KR100339277B1 - 배양조건 최적화를 통한 에리스리톨의 제조방법

Info

Publication number: KR100339277B1
Application number: KR1019990037035A
Authority: KR
Inventors: 정수련; 노봉수; 오덕근; 김상용; 김경아
Original assignee: 정수련; 주식회사 바이오앤진; 정기련; 주식회사 보락
Priority date: 1999-09-02
Filing date: 1999-09-02
Publication date: 2002-06-03
Also published as: KR20010025945A

Abstract

본 발명은 피키아(Pichia)속 신균주 KCCM-10129호에 의한 에리스리톨 생산 공정 중에 최적의 배양조건을 제공함으로써 에리스리톨의 생산성을 현저히 향상시키는 에리스리톨의 발효 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 성장배지에서 종배양된 피키아(Pichia)속 신균주 KCCM-10129호를 설탕 20∼50(w/v)%, 효모추출물 0.2∼3.0(w/v)% 및 이인산칼륨 0.1∼1.0(w/v)%를 포함하는 배양 배지 속에서 pH는 4.5∼6.5로, 배양온도는 32∼36℃로, 용존산소 농도는 5∼15%로 조절하여 배양함을 특징으로 하는 고수율 에리스리톨의 제조방법에 관한 것이다.

Description

배양조건 최적화를 통한 에리스리톨의 제조방법{A process for preparing erythritol by optimizing the fermentation conditions}

본 발명은 피키아(Pichia)속 신균주 KCCM-10129호에 의한 에리스리톨 생산 공정 중에 최적의 배양조건을 제공함으로써 에리스리톨의 생산성을 현저히 향상시키는 에리스리톨의 발효 제조방법에 관한 것이다.

사탄당 알코올인 에리스리톨은 올리고당이나 자일리톨과 더불어 대표적인 기능성 감미료로 자연계에 광범위하게 존재하고 있으며, 해초류와 버섯류의 저장물질이고, 멜론, 포도, 배 등과 같은 과실류에도 함유되고 있다. 에리스리톨은 세균과 효모 등 미생물에 의해서도 생산되므로 포도주나 맥주, 된장 등의 발효식품에서도 검출된다.

에리스리톨은 설탕의 70∼80%의 당도를 가지고 용해될 때 열 감소가 일어나는 특성으로 인하여 입안에서 느끼는 청량감이 크고 용해도가 낮아 결정성이 부여되며 이러한 성질들로 인하여 청량감과 결정성이 필수적인 캔디 등의 제과제품의 무설탕 원료로 사용되고 있다. 에리스리톨은 저 칼로리 감미료로 체내에서 에너지원으로 이용되지 않고 소변으로 대부분 배출되며, 충치균에 의해서 이용되지 않기 때문에 충치 예방 효과도 가지고 있다.

저분자 물질인 에리스리톨은 빙점 강하와 비점 상승을 유도할 뿐 아니라 삼투압을 증가시키는 물질이므로 저 흡습성 물질과 저 점성 물질과 같이 사용하면 식품의 수분 활성도 조절에 매우 용이하다.

에리스리톨의 생산에는 추출법, 화학합성법 및 발효법이 있다. 이중 추출법은 과일이나 채소 등의 자연상태에서 극히 미량으로만 존재하기 때문에 산업적으로 경제성이 없다. 화학합성법은 원료물질이 고가이기 때문에 경제성이 없어 대량생산에 이용되고 있지 못한다. 따라서 현재 발효법으로 생산되며 새로운 미생물에 의한 연구도 활발히 진행되고 있다.

미생물에 의하여 에리스리톨을 생산할 때는 배지에 탄소원, 질소원, 무기염 및 여러 가지 비타민을 적당히 첨가해 주어야 하고, pH, 온도, 교반속도 및 통기량등을 적절히 조절하여야만 에리스리톨의 생산성을 향상시킬 수 있다. 그러나, 아직까지 미생물에 의한 에리스리톨 생산시 배양조건의 전반적인 검토를 시도한 예는 보고된 바 없다.

에리스리톨 생산시 탄소원과 질소원 또한 무기염의 조절은 중요한 인자이다. 피키아의 영양요구성은 비교적 복잡하여 화학합성 배지(chemical synthetic medium)에서는 거의 생산되지 않아 여러 가지 비타민을 첨가해 주어야만 한다. 이에 본 발명자들은 피키아(Pichia)속 신균주 KCCM-10129호를 사용하여 염을 추가하여 고농도의 에리스리톨을 생산하는 방법을 이미 한국특허 출원번호 제98-37486호로 특허출원 한 바 있다.

그러나 상기 특허에 개시된 방법 역시 충분한 수율로 고농도의 에리스리톨을 생산하기는 어려운 점이 있어, 그 발효 배양조건을 최적화하기 위한 연구를 계속 하던 중 본 발명을 완성하게 된 것이다. 따라서 본 발명자들은 피키아(Pichia)속 신균주를 이용하여 배지 및 배양조건을 적절히 조절하면 에리스리톨의 생산성이 증가됨을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 성장배지에서 종배양된 피키아(Pichia)속 신균주 KCCM-10129호를 설탕 20∼50(w/v)%, 효모추출물 0.2∼3.0(w/v)% 및 이인산칼륨 0.1∼1.0(w/v)%를 포함하는 배양 배지 속에서 pH는 4.5∼6.5로, 배양온도는 32∼36℃로, 용존산소 농도는 5∼15%로 조절하여 배양함을 특징으로 하는 최적조건으로 고수율 에리스리톨을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

이때 종배양을 위한 성장 배지는 포도당 10∼30(w/v)%, 효모추출물 0.5∼20(w/v)%로 구성되어 있음을 특징으로 하고, 또한 이때 발효 후기인 40∼60시간 발효 배양 후, 염화칼륨을 첨가하여 염화칼륨의 최종농도가 1.0∼2.5% 되도록 유지 조절함을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

종배양을 위한 성장배지로는 포도당 15∼25%, 효모추출물 0.8∼1.2%로 구성된 배지를 사용하였고, 본배양을 위한 생산배지는 배지 최적화를 위하여 성장배지를 기초로 하여 변형하였다.

종배양은 보관된 피키아의 단일 군락을 성장배지 5 mL가 들어있는 20 mm 직경의 테스트 튜브에 접종하여 진탕배양기에서 230∼270 rpm, 28∼32℃로 45∼51시간 동안 배양하였다. 5 mL의 배양액을 100 mL의 성장배지가 들어있는 500 mL의 플라스크에 접종하여 230∼270 rpm, 28∼32℃로 22∼26시간 동안 배양하였다.

본 배양은 플라스크 배양의 경우는 생산배지 100 mL가 들어있는 500 mL의 배플(baffled) 플라스크에 접종하여 초기 pH를 5.5로 조절하고 진탕배양기에서 230∼270 rpm, 32∼36℃로 110∼130시간 동안 배양하였고, 발효조 배양의 경우는 5 L 발효조(한국발효기(주))를 사용하여 배양을 수행하였다.

회분식 배양에서는 설탕이 함유된 배지부피가 3 L 이었고 발효과정 중에 교반속도는 용존산소가 고갈되지 않는 범위에서 500∼800 rpm으로 조절하였고 통기량은 0.3∼0.5 vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정 동안 4.5∼6.5로 조절하였고 배양온도는 32∼36℃이었다.

유가식 배양에서는 초기에 1200 g 설탕과 60 g의 효모추출물 9 g의 이인산칼륨이 함유된 배지 2.76 L, 2.82 L, 2.88 L, 및 2.94 L에 NaCl 용액 60 g이 함유된 240 mL, 45 g이 함유된 180 mL, 30 g이 함유된 120 mL, 및 60 g이 함유된 60 mL 각각을 배양시간 60시간에서 80시간까지 첨가하여 각각의 최종 부피가 3 L로 조절하였다.

에리스리톨의 농도는 탄수화물 분석칼럼(Carbohydrate analysis column,Waters, USA)이 장착된 HPLC(Shimadzu C-R6A, Japan)의 Refractive Index Detector (Shimadzu RID-6A, Japan)를 이용하여 측정하였다. 이때, 용매는 아세토니트릴(acetonitrile)과 물을 8 : 2로 섞어 사용하였고, 유속은 2.0 mL/min이었다. 균체농도는 분광계를 이용하여 600 nm에서 현탁도를 측정하여 미리 측정한 표준곡선을 이용하여 건조중량으로 전환하였다. 포도당의 농도는 포도당 산화효소(영동제약, 한국)를 사용하여 측정하였다. 용존산소의 농도는 Ingold사(Swiss, polarographic type)의 용존산소 전극을 사용하여 측정하였다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 다음 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

(실시예 1)

종 배양 : 보관된 피키아의 단일 군락을 성장배지 5 mL가 들어있는 20 mm 직경의 테스트 튜브에 접종하여 진탕배양기에서 250 rpm, 30℃로 48시간 동안 배양하였다. 5 mL의 배양액을 100 mL의 성장배지가 들어있는 250 mL의 플라스크에 접종하여 250 rpm, 30℃로 24시간 동안 배양하였다.

본 배양 : 생산배지 100 mL가 들어있는 500 mL의 배플(baffled) 플라스크에 접종하여 초기 pH를 5.5로 조절하고 진탕배양기에서 250 rpm, 34℃로 120시간 동안배양하였다. 배지성분은 탄소원 20%와 효모추출물 1.0%이었다. 여러 가지 탄소원에서 에리스리톨의 생산을 살펴본 결과를 표 1에 나타내었다. 이때, 수율은 소비된 탄소원에 대한 것이다.

피키아속 신균주를 이용하여 플라스크에서 여러 가지 탄소원에서 에리스리톨의 생산

탄소원	에리스리톨(g/L)	수율(%)	생산성(g/L·h)
포도당	40.2	20.1	0.34
갈락토스	28.3	14.2	0.24
만노스	32.7	16.4	0.27
과당	21.4	10.7	0.18
소르보스	5.2	2.6	0.04
설탕	53.8	26.9	0.45
유당	-	-	-

(실시예 2)

본 배양 : 생산배지 100 mL가 들어있는 500 mL의 배플(baffled) 플라스크에접종하여 초기 pH를 5.5로 조절하고 진탕배양기에서 250 rpm, 34℃로 120시간 동안 배양하였다. 배지성분은 여러 농도의 설탕과 효모추출물 1.0%이었다. 여러 가지 농도의 설탕에서 에리스리톨의 생산을 살펴본 결과를 표 2에 나타내었다. 이때, 수율은 소비된 설탕에 대한 것이다.

피키아속 신균주를 이용하여 플라스크에서 여러 가지 농도의 설탕에서 에리스리톨의 생산

설탕(g/L)	에리스리톨(g/L)	수율(%)	생산성(g/L·h)
100	19.0	19.0	0.17
200	64.7	32.3	0.46
300	143.4	47.8	1.02
400	138.5	34.6	0.99

(실시예 3)

본 배양 : 생산배지 100 mL가 들어있는 500 mL의 배플(baffled) 플라스크에접종하여 초기 pH를 5.5로 조절하고 진탕배양기에서 250 rpm, 34℃로 120시간 동안 배양하였다. 배지성분은 설탕 30%와 효모추출물 1.0% 해당되는 같은 질소량을 지닌 여러 가지 질소원이었다. 여러 가지 질소원에서 에리스리톨의 생산을 살펴본 결과를 표 3에 나타내었다. 이때, 수율은 소비된 포도당에 대한 것이다.

피키아속 신균주를 이용하여 플라스크에서 여러 가지 질소원에서 에리스리톨의 생산

질소원	에리스리톨(g/L)	수율(%)	생산성(g/L·h)
카사미노산	68.2	22.7	0.49
맥아 추출액	12.0	4.0	0.09
펩톤	28.8	9.6	0.21
트립톤	80.2	26.7	0.57
효모 추출액	143.4	47.8	1.02

(실시예 4)

본 배양 : 생산배지 100 mL가 들어있는 500 mL의 배플(baffled) 플라스크에접종하여 초기 pH를 5.5로 조절하고 진탕배양기에서 250 rpm, 34℃로 120시간 동안 배양하였다. 배지성분은 30% 설탕과 여러 농도의 효모추출물이었다. 여러 가지 농도의 설탕에서 에리스리톨의 생산을 살펴본 결과를 표 4에 나타내었다. 이때, 수율은 소비된 설탕에 대한 것이다.

피키아속 신균주를 이용하여 플라스크에서 여러 가지 농도의 효모추출물에서 에리스리톨의 생산

효모추출물(g/L)	에리스리톨(g/L)	수율(%)	생산성(g/L·h)
5	130.6	43.5	0.17
10	143.4	47.8	1.02
15	133.0	48.3	0.95
20	129.5	43.2	0.93
25	121.0	40.3	0.86

(실시예 5)

본 배양 : 생산배지 100 mL가 들어있는 500 mL의 배플(baffled) 플라스크에접종하여 초기 pH를 5.5로 조절하고 진탕배양기에서 250 rpm, 34℃로 120시간 동안 배양하였다. 배지성분은 30% 설탕과 1.5% 효모추출물과 인산칼륨(KH₂PO₄)이었다. 여러 가지 농도의 설탕에서 에리스리톨의 생산을 살펴본 결과를 표 5에 나타내었다. 이때, 수율은 소비된 설탕에 대한 것이다.

피키아속 신균주를 이용하여 플라스크에서 여러 가지 농도의 인산칼륨에서 에리스리톨의 생산

인산칼륨(g/L)	에리스리톨(g/L)	수율(%)	생산성(g/L·h)
0	143.4	43.5	1.02
1	148.0	49.3	1.06
3	155.2	51.7	1.11
5	151.2	50.4	1.08
8	146.8	48.9	1.05

(실시예 6)

본 배양 : 생산배지 100 mL가 들어있는 500 mL의 배플(baffled) 플라스크에접종하여 초기 pH를 5.5로 조절하고 진탕배양기에서 250 rpm, 34℃로 120시간 동안 배양하였다. 배지성분은 30% 설탕과 1.5% 효모추출물과 0.3% 이인산칼륨 및 황산마그네슘이었다. 여러 가지 농도의 황산마그네슘에서 에리스리톨의 생산을 살펴본 결과를 표 6에 나타내었다. 이때, 수율은 소비된 설탕에 대한 것이다.

황산마그네슘(g/L)	에리스리톨(g/L)	수율(%)	생산성(g/L·h)
0.0	153.2	51.1	1.09
0.2	154.4	51.5	1.10
0.4	151.6	50.5	1.08
0.6	156.2	52.1	1.12
0.8	156.2	52.1	1.12
1.0	154.8	51.6	1.11

(실시예 7)

본 배양 : 5 L 발효조(한국발효기(주))에서 본배양을 수행하였다. 배양에서설탕이 함유된 배지부피가 3 L 이었고 발효과정 중에 교반속도는 발효 24시간 전까지 용존산소가 20% 이상 유지되는 범위에서 500에서 800 rpm으로 조절하였고 24시간 이후에는 600 rpm으로 고정하였다. 통기량은 0.3에서 0.5 vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정 동안 5.5로 조절하였고 배양온도는 34℃이었다. 배지성분은 30% 또는 40% 설탕과 여러 농도의 효모추출물과 0.3% 인산칼륨(KH₂PO₄)이었다. 여러 가지 C/N (설탕 g/효모추출물 g)에서 에리스리톨의 생산을 살펴본 결과를 표 7에 나타내었다. 이때, 수율은 소비된 설탕에 대한 것이다.

피키아속 신균주를 이용하여 발효조에서 여러 가지 C/N에서의 에리스리톨의 생산

설탕 g/ 효모추출물 g(설탕 300 g/L)	수율(%)	설탕 g/ 효모추출물 g(설탕 400 g/L)	수율(%)
13.33	34.5	12.00	39.1
16.00	40.2	15.00	43.3
20.00	44.0	20.00	47.5
26.67	33.0	30.00	41.3
		40.00	22.6

(실시예 8)

본 배양 : 5 L 발효조(한국발효기(주))에서 본배양을 수행하였다. 배양에서 설탕이 함유된 배지부피가 3 L 이었고 발효과정 중에 교반속도는 발효 24시간 전까지 용존산소가 20% 이상 유지되는 범위에서 500에서 800 rpm으로 조절하였고 24시간 이후에는 600 rpm으로 고정하였다. 통기량은 0.3에서 0.5 vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정 동안 5.5로 조절하였고 배양온도는 34℃이었다. 배지성분은 설탕과 효모 추출물이 함유되어 있고 그 비율(g/g)이 20이었고 이 외 0.3% 인산칼륨(KH₂PO₄)으로 구성되어있다. 설탕/효모추출물 (g/g)의 비율이 20에서 설탕의 농도에 따라 에리스리톨의 생산을 살펴본 결과를 표 8에 나타내었다. 이때, 수율은 소비된 설탕에 대한 것이다.

피키아속 신균주를 이용하여 발효조에서 설탕/효모추출물 (g/g)의 비율이 20에서의 설탕의 농도에 따른 에리스리톨의 생산

설탕/효모추출물(g/L)/(g/L)	에리스리톨(g/L)	수율(%)	생산성(g/L·h)
300/15	132.0	44.0	1.07
400/20	190.0	47.5	1.58
500/25	143.4	44.5	1.55

(실시예 9)

본 배양 : 5 L 발효조(한국발효기(주))에서 본배양을 수행하였다. 배양에서 설탕이 함유된 배지부피가 3 L 이었고 발효과정 중에 교반속도는 발효 24시간 전까지 용존산소가 20% 이상 유지되는 범위에서 500에서 800 rpm으로 조절하였고 24시간 이후에는 여러 가지 교반속도로 조절하였다. 통기량은 0.3에서 0.5 vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정 동안 5.5로 조절하였고 배양온도는 34℃이었다. 배지성분은 40% 설탕과 2.0% 효모 추출물 및 0.3% 이인산칼륨으로 구성되어있다. 교반속도에 따라 에리스리톨의 생산을 살펴본 결과를 표 9에 나타내었다. 이때, 수율은 소비된 설탕에 대한 것이다.

피키아속 신균주를 이용하여 발효조에서 여러 가지 교반속도에 따른 에리스리톨의 생산

교반속도/용존산소(rpm)/(%)	에리스리톨(g/L)	수율(%)	생산성(g/L·h)
400/1.5-2.0	149.8	37.5	1.07
500/2.0-5.0	176.0	44.0	1.35
600/5.0-10	190.0	47.5	1.58
500-850/20±1	142.6	35.7	1.43

(실시예 10)

본 배양 : 5 L 발효조(한국발효기(주))에서 본배양을 수행하였다. 배양에서 설탕이 함유된 배지부피가 3 L 이었고 발효과정 중에 교반속도는 발효 24시간 전까지 용존산소가 20% 이상 유지되는 범위에서 500에서 800 rpm으로 조절하였고 24시간 이후에는 600 rpm으로 조절하였다. 통기량은 0.3에서 0.5 vvm으로 조절하였다. pH는 발효 전 과정 동안 5.5로 조절하였고 배양온도는 34℃이었다. 유가식 배양에서는 초기에 1200 g 설탕과 60 g의 효모추출물 9 g의 이인산칼륨이 함유된 배지 2.76 L, 2.82 L, 2.88 L, 및 2.94 L에 염화칼륨(NaCl) 60 g이 함유된 240 mL, 45 g이 함유된 180 mL, 30 g이 함유된 120 mL, 및 60 g이 함유된 60 mL 각각을 배양시간 60시간에서 80시간까지 첨가하여 각각의 최종 부피가 3 L로 조절하였다. 첨가된 염화칼륨에 따라 에리스리톨의 생산을 살펴본 결과를 표 10에 나타내었다. 이때, 수율은 소비된 설탕에 대한 것이다.

피키아속 신균주를 이용하여 발효조에서 유가식 배양을 통한 여러 가지 농도의 염화칼륨에 따른 에리스리톨의 생산

염화칼륨(g/L)	에리스리톨(g/L)	수율(%)	생산성(g/L·h)
0	190	47.5	1.58
5	198	49.3	1.70
10	210	52.5	2.00
15	220	55.0	2.20
20	215	52.1	2.04

본 발명의 효과는 피키아(Pichia)속 신균주를 이용하여 배지 및 배양조건을적절히 조절하면 에리스리톨의 생산성이 증가되므로, 이에 따라 에리스리톨을 고수율로 발효 생산하게 된 것이다.

Claims

성장배지에서 종배양된 피키아(Pichia)속 신균주 KCCM-10129호를 설탕 20∼50(w/v)%, 효모추출물 0.2∼3.0(w/v)% 및 이인산칼륨 0.1∼1.0(w/v)%를 포함하는 배양 배지 속에서 pH는 4.5∼6.5로, 배양온도는 32∼36℃로, 용존산소 농도는 5∼15%로 조절하여 배양함을 특징으로 하는 최적조건으로 고수율 에리스리톨을 제조하는 방법
제 1항에 있어서, 성장 배지는 포도당 10∼30(w/v)%, 효모추출물 0.5∼20(w/v)%로 구성되어 있음을 특징으로 하는 고수율 에리스리톨의 제조방법
제 1항에 있어서, 발효 후기인 40∼60시간 발효 배양 후, 염화칼륨을 첨가하여 염화칼륨의 최종농도가 1.0∼2.5% 되도록 유지 조절함을 특징으로 하는 고수율 에리스리톨의 제조방법
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