KR100277489B1 - 칸디다 속의 내염성 돌연변이주 및 이를 이용한 에리트리톨의 생산방법 - Google Patents

칸디다 속의 내염성 돌연변이주 및 이를 이용한 에리트리톨의 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 에리트리톨의 수율 및 생산성이 높은 칸디다(Candida) 속의 내염성 돌연변이 균주인 칸디다 마그놀리에(Candida magnoliae) SR101 균주(기탁번호 제 KFCC-11023 호) 및 이를 이용한 에리트리톨(erythritol) 생산방법에 관한 것으로, 본 발명의 돌연변이 균주는 당류를 함유하는 배지중에서 에리트리톨을 고수율 로 생산한다.

Description

칸디다 속의 내염성 돌연변이주 및 이를 이용한 에리트리톨의 생산방법
본 발명은 에리트리톨 수율 및 생산성이 높은 새로운 칸디다 속의 내염성 돌연변이주 및 이를 이용한 에리트리톨의 생산방법에 관한 것이다.
에리트리톨은 해조류, 버섯류, 과실류 등 자연계에 광범위하게 존재하는 사탄당 알콜로, 설탕의 70 내지 80%의 감미도를 가지고 있어 올리고당이나 자일리톨과 함께 설탕을 대체하는 대표적인 기능성 감미료로 각광받고 있다. 특히, 에리트리톨은 큰 용해잠열로 인해 입안에서 느끼는 청량감이 크고, 물에 대한 용해도가 낮아 결정이 쉽게 형성되는 성질을 가지고 있어, 이러한 성질이 필수적으로 요구되는 캔디 등의 제과제품에서 설탕을 대체하는 감미료로 사용되고 있다. 또한 에리트리톨은 저칼로리로 체내에서 에너지원으로 이용되지 않으며 대부분이 소변으로 배출되고 충치균에 의해 이용되지 않기 때문에 충치예방효과도 가지고 있다.
이렇게 유용한 에리트리톨을 생산하는 방법으로는 추출법, 화학합성법 및 발효법이 사용되고 있다. 이중 추출법은 과일 또는 채소 등으로부터 에리트리톨을 추출하는 것으로, 자연상태의 과일 또는 채소에 함유된 에리트리톨이 소량이기 때문에 이 방법은 산업적으로 경제성이 없다는 단점이 있다. 또한 화학합성법은 니켈 촉매를 이용하여 에리트로스(erythrose)를 에리트리톨로 전환시키는 것으로, 원료로 사용되는 에리트로스의 가격이 고가이어서 이 방법도 역시 산업적으로 경제성이 없어 에리트리톨의 대량생산에 적용되지 못하고 있는 실정이다.
한편 발효법은 효모 등의 미생물을 이용하여 배지중의 포도당으로부터 에리트리톨을 생산하는 것으로, 저렴한 포도당을 사용함으로써 화학합성법의 단점을 해결하여 산업화가 가능한 방안으로 주목받고 있다.
그러나 대부분의 에리트리톨 생산 균주들은 에리트리톨 외에도 글리세롤 등의 다른 당알콜류를 부산물로 생산하는 경향이 있는데, 이 부산물은 에리트리톨과 물리화학적 특성 및 화학적 구조가 유사하여 에리트리톨의 정제를 복잡하게 하고, 발포성에 의해 발효공정의 어려움을 야기하는 등의 문제점이 있다. 예를 들어, 보고된 에리트리톨 생산 균주인 모닐리엘라 토멘토사 바 폴리니스(Moniliela tomentosa var polinis) 균주는 41%의 높은 수율로 에리트리톨을 생산하지만, 부산물로 글리세롤과 리비톨을 많이 생산하기 때문에 산업화에 사용되지 못하고 있는 실정이다.
한편 일본의 농림수산성 식품종합연구소와 일연화학에 의해 분리된 곰팡이 오레오바시디움(Aureobasidium) 균주가 에리트리톨의 공업적 생산에 이용되고 있는데, 이 야생균주는 에리트리톨 생산성과 내당성이 저조하지만 이 균주에 돌연변이를 유발시켜 얻어진 돌연변이주는 에리트리톨 생산성과 내당성이 향상되어 83.3%의 포화 포도당 농도에서도 발효가 가능하고 40 내지 50%의 포도당 농도에서 2 g/L 시의 에리트리톨 생성속도를 가지고 있다. 이 돌연변이주는 포도당으로부터 45%의 높은 수준의 수율로 에리트리톨을 생산하며 소량의 글리세롤을 부산물로 생산하는 장점이 있다. 그러나 이 돌연변이주는 효모보다 배양이 어려운 단점이 여전히 남는다.
이러한 종래의 문제점을 극복하고 있을 뿐 아니라 고역가로 에리트리톨을 생산하는 방법을 개발하기 위하여 본 발명자들은 에리트리톨 생산 수율이 높은 칸디다 속의 야생 균주를 분리한 후 돌연변이를 유발하여 고수율과 고생산성으로 에리트리톨을 생산하는 돌연변이주를 개발하였으며 이 균주를 이용하여 에리트리톨을 고수율과 고생산성으로 생산하는 최적의 배양 조건을 결정함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 에리트리톨을 고수율 및 고생산성으로 생산하는 칸디다 속의 돌연변이주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 돌연변이주를 이용하여 에리트리톨을 고수율 및 고생산성으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 칸디다 마그놀리에 SR101 균주의 배양액에 대한 HPLC분석 결과를 나타내는 그래프이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 에리트리톨을 고수율 및 고생산성으로 생산하는 칸디다 돌연변이주인 칸디다 마그놀리에(Candida magnoliae) SR101 균주(기탁번호 제 KFCC-11023 호)를 제공한다.
다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 돌연변이주를 단당류 또는 이당류를 포함하는 배지에서 배양하여 에리트리톨을 생산하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 돌연변이주는 에리트리톨 생산성이 약 0.7g/L 시 정도로 높은 내염성 돌연변이주로, 소비(벌집)으로부터 분리된 칸디다 속의 야생균주 JH1에 돌연변이를 유발하여 제조된다.
즉, 소비 일부를 포도당 40%와 효모 추출물 1%가 포함된 액체배지에서 배양한 후 배양액을 희석하여 한천배지(포도당 20%, 효모 추출물 1.0% 및 한천 2.0%)위에 도말하고 배양하여 콜로니를 얻고, 이 콜로니를 발효배지(포도당 10% 및 효모 추출물 1.0%)에서 배양한 후 배양액을 원심분리하여 세포를 제거하고 상층액을 여과한 다음 여액에 대하여 HPLC를 실시하여 에리트리톨 생산능력이 뛰어난 칸디다 속의 야생균주 JH1을 얻는다. 이 야생균주 JH1은 둥근 세포모양을 가지고 출아(budding)를 하는 등 일반적인 효모의 특징을 나타낸다. 이 균주의 동정을 한국과학기술연구원 생명공학연구소에 의뢰한 결과 칸디다 속 균주로 확인되었으며, 마이크로첵크사(Microcheck사)에 의뢰한 결과 칸디다 마그놀리에 균주로 확인되었다.
이 야생균주 JH1을 성장배지(포도당 2.0%, 효모 추출물 1.0% 및 펩톤 1.0%)에서 배양한 후 고체배지(포도당 10%, 효모 추출물 0.8%, 펩톤 0.3% 및 한천 2.0%)위에 도말하고 배양하여 콜로니를 얻고, 이 콜로니를 다시 포자형성배지(포도당 0.1%, 효모 추출물 0.25%, 염화칼륨 0.18%, 초산나트륨 0.85% 및 한천 1.5%)위에 도말하고 배양하여 포자를 형성시킨다. 포자가 형성된 균체를 멸균 증류수로 수집하고 10 mM 2-머캅토에탄올로 처리한 후 0.5 mg/mL 리티카제(lyticase 100,000 단위) 용액과 반응시켜 균체를 제거하고 포자만을 선별한다. 선별된 포자에 0.8% 에틸메탄올 설포네이트(EMS) 등과 같은 돌연변이제를 처리하여 돌연변이를 유발하고, 돌연변이가 유발된 포자를 선별배지(포도당 30%, 염화칼륨 18%, 효모 추출물 0.1% 및 한천 2.0%)에서 배양하여 성장속도가 빠른 균주를 중심으로 내염성이 우수한 단일 콜로니를 선별한다. 이러한 선별배지의 고삼투압 조건하에서는 원형질 분리에 의해 대부분의 균주가 사멸하고 고농도의 당알콜을 생산하는 균주만이 원형질 분리없이 생존하게 된다. 선별된 균주를 발효배지에서 배양한 후 배양액중의 에리트리톨 농도를 측정하여 에리트리톨 생산량이 가장 많은 칸디다 속의 내염성 돌연변이 균주를 선별한다. 이 균주를 칸디다 마그놀리에 SR101(Candida magnoliae SR101) 균주로 명명하고 한국종균협회에 1998년 3월 27일자 기탁번호 제 KFCC-11023 호로 기탁하였다.
본 발명의 칸디다 마그놀리에 SR101 균주를 이용하여 에리트리톨을 생산하는 방법은 다음과 같다.
먼저, 칸디다 마그놀리에 SR101 균주를 통상적인 방법에 따라 종배양하는데, 예를 들면 성장배지(포도당 2.0%, 효모 추출물 1.0% 및 펩톤 1.0%)에 접종하고 교반속도 240 rpm로 30℃에서 48 시간 동안 배양한다.
상기 종 배양액을 단당류 또는 이당류를 포함하는 발효배지에 접종하여 본 배양한다. 상기 단당류로는 포도당이 바람직하고, 상기 이당류로는 설탕이 바람직하다. 상기 포도당을 포함하는 발효배지는 포도당 10 내지 50%(w/v), 효모 추출물 0.2 내지 2.0%(w/v), KH2PO40.1 내지 10%(w/v), (NH4)2SO40.1 내지 5%(w/v) 및 MgSO4·2O 0.01 내지 1.0%(w/v)를 포함하는 배지가 바람직하며, 포도당 25%, 효모 추출물 0.5%, KH2PO40.5%, (NH4)2SO40.2% 및 MgSO4·2O 0.04%를 포함하는 배지가 더욱 바람직하다. 배양조건으로는 초기 pH 6 내지 8, 바람직하게는 7, 교반속도 500 rpm, 통기량은 0.75 내지 2.0 vvm, 바람직하게는 1.0 vvm, 배양온도 26 내지 30℃, 바람직하게는 28 ℃로 배양하는 것이다. 특히, pH는 배양 도중에 조절하지 않아도 된다. 배양 방법으로는 발효조에서 회분식 또는 유가식으로 배양할 수 있는데, 특히 유가식 배양의 경우에는 에리트리톨 생산성을 높이기 위해 발효 초기에는 포도당 5 내지 10%(w/v)가 첨가된 배양액에서 배양하다가 세포성장이 최대치에 도달한 때에 포도당 10 내지 40%(w/v)을 연속적 또는 간헐적으로 첨가할 수 있다.
본 발명의 균주가 고농도의 당알콜을 생산하게 하는 고삼투압 조건을 유지하기 위해, 본 발명에서는 상기 발효배지에 염화칼륨 2 내지 10%(w/v)를 추가로 첨가할 수 있다.
에리트리톨은 상기 배양액으로부터 통상의 방법을 이용해 용이하게 정제할 수 있는데, 예를 들어 원심분리하여 균체를 제거하고 활성탄으로 탈색시킨 후 이온교환수지(SK-1B:SA20AP=2:1)로 탈염시키고 농축시킨 다음 5℃에서 보존하는 과정을 통해 결정상태로 얻을 수 있다.
이하, 본 발명을 참고예 및 실시예에 의하여 상세히 설명하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
참고예 1: 칸디다 속의 JH 1 야생균주의 분리 및 동정
소비(벌집) 일부를 포도당(Showa사) 400g/L와 효모 추출물(Difco사) 10g/L를 포함하는 액체배지가 들어있는 100mL 배플 플라스크(baffled flask)에 넣고 200 rpm의 교반속도로 30℃에서 24시간 배양하였다. 이 배양액을 증류수로 10 배로 희석한 후 한천배지(포도당 200 g/L, 효모 추출물 10g/L 및 한천 20g/L)위에 도말하고 30℃에서 48시간동안 배양하여 콜로니를 얻었다.
이 콜로니들을 각각 발효배지(포도당 100g/L 및 효모 추출물 10g/L)이 들어있는 시험관에 접종하고 200 rpm의 교반속도로 30℃에서 5일 동안 배양하였다. 이 배양액을 10000 rpm에서 5 분동안 원심분리하여 세포를 제거한 후, 상층액을 여과한 다음 여액에 대해 HPLC를 실시하여 에리트리톨 생산 여부를 검사하여 에리트리톨 생산균주 4개를 선별하고, 각각 JH 1,2,3 및 4로 명명하였다.
이중 에리트리톨 생산능력이 뛰어난 JH 1 균주를 선택하여 동정하였다. 즉, 광학 현미경으로 관찰한 결과, JH 1 균주는 둥근 세포 모양을 가지고 일부 세포에서는 출아(budding)하는 과정도 보이는 등 일반적인 효모의 특징을 나타내었다. 따라서, 이 균주는 출아법으로 번식함을 알 수 있다.
또한 한천배지위에 생성되는 콜로니는 둥글고 매끄러운데, 초기에는 투명해 보이다가 시간이 경과됨에 따라 점차 흰색, 연한 갈색 순으로 변하며 그 색도 더욱 진해졌다. 액체배지에 배양할 경우에도 배양액의 색이 한천배지의 경우와 유사하게 변했다.
정확한 동정을 위해 지방산 프로필 분석을 이용한 JH 1 균주의 동정을 마이크로체크사(Microcheck Inc.)에 의뢰한 결과, 이 균주는 칸디다 마그놀리에(Candida magnoliae)로 동정되었다.
참고예 2: 배양액중의 에리트리톨 농도, 균체농도 및 포도당 농도의 측정
칸디다 마그놀리에 SR101 균주 또는 칸디다 속의 야생균주의 배양액중의 에리트리톨 농도는 탄수화물 분석칼럼(Carbohydrate analysis column, Waters, USA) 또는 아민 칼럼(Shisheido, Japan)이 장착된 HPLC(Shimadzu C-R6A, Japan 또는 Waters, USA)의 굴절률 검출기(Refractive Index Detector, Shimadzu RID-6A, Japan 또는 Waters 410, USA)를 이용하여 측정하였다. 이때, 용매는 아세토니트릴(acetonitrile)과 물을 8:2의 비율로 섞어 사용하였고, 칼럼 온도는 35℃이고, 유속은 1.5 mL/분이었다.
균체 농도는 분광계를 이용하여 600nm에서 현탁도를 측정하였다.
또한 포도당 농도는 포도당 분석기(Glucose Analyser, YSI, USA)를 사용하여 측정하였다.
실시예 1: 칸디다 마그놀리에 SR101 균주의 제조
참고예 1에서 분리된 JH 1 균주를 성장배지(포도당 2.0%, 효모 추출물 1.0% 및 펩톤 1.0%)에 접종하고 48시간 동안 배양한 후, 고체배지(포도당 10%, 효모 추출물 0.8%, 펩톤 0.3% 및 한천 2.0%)위에 도말하고 30℃에서 36 시간동안 배양하여 콜로니를 얻었다. 이 콜로니를 다시 포자형성배지(포도당 0.1%, 효모 추출물 0.25%, 염화칼륨 0.18%, 초산나트륨 0.85% 및 한천 1.5%)위에 도말하고 30℃ 배양기에서 4일 동안 배양한 후 4℃ 냉장고에서 한달 동안 보관하여 포자를 형성시켰다.
포자형성평판에서 포자 및 균체를 멸균 증류수로 수집하고 10 mM 2-머캅토에탄올로 30분 동안 처리한 후 수집한 포자 및 균체 용액에 0.5 mg/mL 리티카제(lyticase 100,000 단위)를 가하고 30℃에서 4시간 동안 반응시켜 균체를 제거하고 포자만을 선별하였다.
선별된 포자에 0.8% 에틸메탄올 설포네이트(EMS)를 30분간 처리하여 돌연변이를 유발하고 5% 소디움 티오설페이트를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 내염성이 우수한 균주를 선별하기 위하여 돌연변이가 유발된 포자를 선별배지(포도당 30%, 염화칼륨 18%, 효모 추출물 0.1% 및 한천 2.0%)에 도말한 후 30℃에서 배양하여 성장속도가 빠른 균주를 중심으로 단일 콜로니를 선별하였다. 선별된 균주들을 발효배지 50 mL가 들어있는 250 mL의 플라스크에 접종하고 진탕배양기를 이용하여 240 rpm로 30℃에서 72시간 동안 배양한 후 참고예 2에서와 동일한 방법으로 에리트리톨 농도를 측정하여 에리트리톨 생산량이 가장 많은 칸디다 속의 내염성 돌연변이 균주를 선별하였다.
선별된 돌연변이 균주를 칸디다 마그놀리에 SR101(Candida magnoliae SR101) 균주로 명명하고 한국종균협회에 1998년 3월 27일자 기탁번호 제 KFCC-11023 호로 기탁하였다.
실시예 2: 칸디다 마그놀리에 SR101 균주의 에리트리톨 생산
실시예 1에서 제조된 칸디다 마그놀리에 SR101 균주를 성장배지(포도당 2.0%, 효모 추출물 1.0% 및 펩톤 1.0%) 50 mL가 들어있는 250 mL 플라스크에 접종하고 240 rpm로 30℃에서 48시간 동안 배양하여, 종 배양하였다.
종 배양액을 발효배지(포도당 10%, 효모 추출물 0.5%, KH2PO40.5%, (NH4)2SO40.2%, MgSO4·7H2O 0.04%) 50 mL가 들어있는 250 mL 플라스크에 접종한 후, 진탕배양기를 이용하여 240 rpm에서 28℃로 배양하여, 본 배양하였다. 이때 배지의 pH는 발효 초기에 7.0으로 맞춘 후 발효 도중에는 조절하지 않았다. 참고예 2에서와 동일한 방법으로 배양액의 에리트리톨 농도, 균체 농도 및 포도당 농도를 측정하였다.
그 결과, 본 배양 개시후 84시간이 경과한 때에 배지중의 포도당이 모두 고갈되었으며, 에리트리톨 생산량은 25 g/L이었고, 에리트리톨 생산성은 0.30 g/L 시이었다. 또한 발효액의 HPLC 분석 결과, 도 1에서 보듯이, 글리세롤 등의 부산물이 거의 생성되지 않음을 알 수 있다.
비교예 1: 칸디다 속의 야생균주의 에리트리톨 생산
칸디다 마그놀리에 SR101 균주 대신에 야생균주인 칸디다 속의 JH110(제 KFCC-10900 호)를 사용한다는 점을 제외하고는 실시예 2에서와 동일한 방법으로 배양하고, 참고예 2에서와 동일한 방법으로 배양액의 에리트리톨 농도, 균체 농도 및 포도당 농도를 측정하였다.
그 결과, 본 배양 개시후 108시간이 경과한 때에 배지중의 포도당이 모두 고갈되었으며, 에리트리톨 생산량은 17 g/L이었고, 에리트리톨 생산성은 0.15 g/L 시이었다.
실시예 2와 비교예 1의 결과를 종합하면, 본 발명의 칸디다 마그놀리에 SR101 균주는 칸디다 속의 야생균주에 비해 약 2배의 에리트리톨 생산성을 가진다.
실시예 3: 초기 pH에 따른 칸디다 마그놀리에 SR101 균주의 에리트리톨 생산량
본 배양에서 발효배지의 초기 pH를 4.0, 5.0, 6.0, 7.0 또는 8.0으로 조절한다는 점을 제외하고는, 실시예 2에서와 동일한 방법으로 칸디다 마그놀리에 SR101 균주를 배양하고, 참고예 2에서와 동일한 방법으로 배양액의 에리트리톨 농도 및 균체 농도를 측정하였다.
그 결과는 하기 표 1과 같다.
250 mL 플라스크에서 pH에 따른 에리트리톨 생산량
pH 균체 농도(OD600㎚) 에리트리톨 생산량(g/L)
4.0 73.1 12.6
5.0 82.8 21.4
6.0 92.9 23.6
7.0 87.6 25.0
8.0 88.4 18.6
표 1에서 보듯이, 균체 농도는 초기 pH 6인 배지에서 가장 높았고 에리트리톨 생산량은 초기 pH 7인 배지에서 가장 많았다.
실시예 4: 배양온도에 따른 칸디다 마그놀리에 SR101 균주의 에리트리톨 생산량
본 배양에서 배양온도를 24, 26, 28 또는 30℃로 조절한다는 점을 제외하고는, 실시예 2에서와 동일한 방법으로 칸디다 마그놀리에 SR101 균주를 배양하고, 참고예 2에서와 동일한 방법으로 배양액의 에리트리톨 농도 및 균체 농도를 측정하였다.
그 결과는 하기 표 2와 같다.
250 mL 플라스크에서 배양온도에 따른 에리트리톨 생산량
배양온도(℃) 균체 농도(OD600㎚) 에리트리톨 생산량(g/L)
24 70.4 15.4
26 70.6 15.0
28 93.5 25.0
30 84.5 20.7
표 2에서 보듯이, 28℃의 배양온도에서 균체 농도와 에리트리톨 생산량이 가장 높다.
실시예 5: 염화칼륨 농도에 따른 칸디다 마그놀리에 SR101 균주의 에리트리톨 생산량
본 배양에서 배지에 염화칼륨을 0.0, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 또는 6.0%(w/v)의 농도로 더 첨가한다는 점을 제외하고는, 실시예 2에서와 동일한 방법으로 칸디다 마그놀리에 SR101 균주를 배양하고, 참고예 2에서와 동일한 방법으로 배양액의 에리트리톨 농도 및 균체 농도를 측정하였다.
그 결과는 하기 표 3과 같다.
250 mL 플라스크에서 염화칼륨 농도에 따른 에리트리톨 생산량
염화칼륨 농도(%) 균체 농도(OD600㎚) 에리트리톨 생산량(g/L)
0.0 93.5 25.0
1.0 96.3 25.2
2.0 91.0 23.7
3.0 91.9 23.3
4.0 95.9 27.1
5.0 88.7 27.6
6.0 85.1 26.5
표 3에서 보듯이, 균체 농도는 4.0%의 염화칼륨 농도에서 가장 높고, 에리트리톨 생산량은 5.0%에서 가장 높다.
비교예 2: 염화칼륨 농도에 따른 칸디다 속의 야생균주의 에리트리톨 생산량
칸디다 마그놀리에 SR101 균주 대신에 야생균주인 칸디다 속의 JH110(제 KFCC-10900 호)를 사용하고, 배지에 염화칼륨을 0.0, 1.0, 2.0, 3.0 또는 4.0%(w/v)의 농도로 더 첨가한다는 점을 제외하고는 실시예 4에서와 동일한 방법으로 배양하고, 참고예 2에서와 동일한 방법으로 배양액의 에리트리톨 농도 및 균체 농도를 측정하였다.
그 결과는 하기 표 4와 같다.
250 mL 플라스크에서 염화칼륨 농도에 따른 칸디다속 야생균주의 에리트리톨 생산량
염화칼륨 농도(%) 균체 농도(OD600㎚) 에리트리톨 생산량(g/L)
0.0 89.1 17.0
1.0 96.3 20.2
2.0 99.5 23.7
3.0 79.8 14.2
4.0 72.7 13.0
표 4에서 보듯이, 균체 농도와 에리트리톨 생산량은 2.0%의 염화칼륨 농도에서 가장 높다.
실시예 5와 비교예 2의 결과를 종합하면, 본 발명의 칸디다 마그놀리에 SR101 균주는 칸디다 속의 야생균주에 비해 염에 대한 내성이 크다는 것을 알 수 있다.
실시예 6: 발효조에서 통기량에 따른 칸디다 마그놀리에 SR101 균주의 에리트리톨 생산량
실시예 1에서 제조된 칸디다 마그놀리에 SR101 균주를 성장배지 50 mL가 들어있는 250 mL 플라스크에 접종하고 240 rpm으로 30℃에서 48시간 동안 배양하여, 종 배양하였다.
종 배양액 50 mL를 발효배지(포도당 25%, 효모 추출물 0.5%, KH2PO40.5%, (NH4)2SO40.2% 및 MgSO4·7H2O 0.04%) 1 L가 들어있는 2.5 L 발효조(한국발효기(주))에 접종하고 통기량을 0.75, 1.0, 1.5, 또는 2.0 vvm으로 조절하여 84시간 동안 배양하였다. 이때 교반속도는 500 rpm으로 유지하였고, 초기 pH는 7로, 배양온도는 28℃로 조절하였다. 참고예 2에서와 동일한 방법으로 배양액의 에리트리톨 농도 및 균체 농도를 측정하였다.
그 결과는 하기 표 5와 같다.
발효조에서 통기량에 따른 칸디다속 야생균주의 에리트리톨 생산량
통기량(vvm) 균체 농도(OD600㎚) 에리트리톨 생산량(g/L)
0.75 117.8 131.2
1.00 143.4 143.3
1.50 137.4 125.0
2.00 129.2 111.8
표 5에서 보듯이, 균체 농도와 에리트리톨 생산량은 1.00 vvm의 통기량에서 가장 높다.
실시예 7: 발효조에서 포도당 농도에 따른 칸디다 마그놀리에 SR101 균주의 에리트리톨 생산성
실시예 6에서와 동일한 방법으로 칸디다 마그놀리에 SR101 균주를 종 배양한 후, 이 종 배양액 50 mL를 10.0, 15.0, 20.0, 25.0 또는 30.0% 농도의 포도당이 포함된 발효배지(포도당, 효모 추출물 0.5%, 염화칼륨 5.0 %, KH2PO40.5%, (NH4)2SO40.2% 및 MgSO4·7H2O 0.04%) 1 L가 들어있는 2.5 L 발효조(한국발효기(주))에 접종하고, 교반속도 500 rpm으로 배양하였다. 이때 통기량은 1.0 vvm으로 유지하였고, 초기 pH는 7로, 배양온도는 28℃로 조절하였으며, 배양시간은 포도당 농도 10.0, 15.0, 20.0, 25.0 및 30.0%인 경우 각각 63, 120, 20, 205 및 205 시간이었다. 참고예 2에서와 동일한 방법으로 배양액의 에리트리톨 농도 및 균체 농도를 측정하였다.
그 결과는 표 6과 같다.
발효조에서 포도당 농도에 따른 칸디다 마그놀리에 SR101 균주의 에리트리톨 생산성
포도당 농도(%) 에리트리톨 생산량(g/L) 생산성(g/L 시)
10.0 29.1 0.46
15.0 64.9 0.54
20.0 87.2 0.55
25.0 143 0.70
30.0 117 0.57
표 6에서 보듯이, 에리트리톨 생산량 및 에리트리톨 생산성은 25%의 포도당 농도에서 가장 높다.
실시예 8: 설탕 농도에 따른 칸디다 마그놀리에 SR101 균주의 에리트리톨 생산성
실시예 6에서와 동일한 방법으로 종 배양하고, 종 배양액 50 mL를 10.0, 15.0, 20.0, 30.0 또는 40.0% 농도의 설탕이 포함된 발효배지(설탕, 효모 추출물 0.5%, 염화칼륨 5.0%, KH2PO40.5%, (NH4)2SO40.2% 및 MgSO4·7H2O 0.04%) 부피 1 L가 들어있는 2.5 L 발효조(한국발효기(주))에 접종한 후, 교반속도 500 rpm으로 배양하였다. 이때, 통기량은 1.0 vvm으로 유지하였고, pH는 7로, 배양온도는 28℃로 조절하였다. 참고예 2에서와 동일한 방법으로 배양액의 에리트리톨 농도 및 에리트리톨 생산성을 측정하였다.
그 결과는 표 7과 같다.
발효조에서 설탕 농도에 따른 칸디다 마그놀리에 SR101 균주의 에리트리톨 생산성
설탕 농도(%) 에리트리톨 생산량(g/L) 생산성(g/L 시)
10.0 26.1 0.4
15.0 62.3 0.5
20.0 78.3 0.51
30.0 105 0.60
40.0 126 0.5
표 7에서 보듯이, 에리트리톨 생산량은 설탕 농도가 증가함에 따라 증가하지만, 에리트리톨 생산성은 30%의 설탕 농도에서 가장 높다.
본 발명의 칸디다 마그놀리에 SR101 균주는 포도당으로부터 에리트리톨을 50%의 고수율 및 고생산성으로 생산하므로, 본 발명의 균주를 이용한 에리트리톨의 생산방법은 고수율 및 고생산성을 가질 뿐 아니라, 원료로 포도당 또는 설탕을 사용함으로써 매우 경제적이며, 글리세롤 등의 부산물이 거의 생성되지 않아 에리트리톨의 분리 및 정제 공정이 간단하고 발효과정중에 거품 발생이 작다는 장점이 있어 대량생산에 적합하다.

Claims (8)

  1. 칸디다 마그놀리에(Candida magnoliae) SR101 균주(기탁번호 제 KFCC-11023 호).
  2. 칸디다 마그놀리에(Candida magnoliae) SR101 균주(기탁번호 제 KFCC-11023 호)를 단당류 또는 이당류를 포함하는 배지에서 배양하여 에리트리톨을 생산하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 단당류가 포도당인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 단당류를 포함하는 배지가 포도당 10 내지 50%(w/v), 효모 추출물 0.2 내지 2.0%(w/v), KH2PO40.1 내지 10%(w/v), (NH4)2SO40.1 내지 5%(w/v) 및 MgSO4·7H2O 0.01 내지 1.0%(w/v)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 2 항에 있어서,
    배지의 초기 pH가 6 내지 8인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 2 항에 있어서,
    통기량이 0.75 내지 2.0 vvm인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 2 항에 있어서,
    배양온도가 26 내지 30℃인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 2 항에 있어서,
    상기 배지에 염화칼륨 2 내지 10%(w/v)를 추가로 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
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