KR0177478B1 - 에리스리톨 생성능을 갖는 칸디다속 균주 및 이를 이용한 에리스리톨의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 포도당, 설탕, 과당을 기질로 사용하여 에리스리톨을 고수율로 생성할 수 있는 신규의 칸디다(Candida) JH110 균주(기탁번호 : KFCC-10900) 및 이 균주를 영양배지에서 호기적으로 배양하여 에리스리톨을 높은 수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

에리스리톨 생성능을 갖는 칸디다속 균주 및 이를 이용한 에리스리톨의 제조방법

본 발명은 에리스리톨(erythritol)을 생성하는 신규한 미생물 및 그 미생물을 이용한 에리스리톨의 제조방법에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 포도당, 설탕, 과당을 기질로 사용하여 에리스리톨을 고수율로 생성할 수 있는 신규의 칸디다속(Candida sp.)균주 및 이 균주를 영양배지에서 호기적으로 배양하여 에리스리톨을 높은 수율로 제조하는 방법에 관한 것이다.

에리스리톨은 발효식품, 버섯 등의 식물, 포유동물의 체액 등에 존재하는 천연물질로서 감미도는 설탕의 70내지 80%이다. 에리스리톨은 열량이 설탕의 1/10 (0.4Kcal/g)미만인 저칼로리 감미로로서 용해시 흡열작용을하여 시원한 감미특성을 갖고 있고 흡습성, 착색성이 낮아 모든 식품에 잘 적용된다. 또한, 충치균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)가 에리스리톨을 분해해서 이용하지 못하므로 산이나 글루칸(Glucan) 등을 생성하지 않는 비충치성 물질이며, 기존의 당 알콜류가 다량 섭취시 설사를 유발하는 단점을 갖고 있는 것에 비해 에리스리톨은 다량 섭취시에도 설사 유발도가 낮은 생리적 특성을 갖고 있다.

종래의 에리스리톨 제조방법으로는 오레오바시디움(Aureobasidium) 속의 미생물을 이용한 방법(참조 : 일본국 특허공개 소 62-24716 호), 토루라(Tolura) 미생물을 이용한 방법(참조 : 유럽특허출원 제 136,805 호), 트리고놉시스 베리어빌리스(Trigonopsis variabilis)를 이용한 방법(참조 : 일본국 특허 공개 소 49-118889 호) 또는 칸디다 리포리티카(Candida lipolytica)를 이용한 방법(참조 : 미합중국 특허 제 3,756,917 호) 등을 언급할 수 있다. 그러나, 상기 방법에서 사용된 균주들은 에리스리톨 이외에도 글리세롤 등의 다른 당알콜류를 부생하는 경향이 있어 발효액으로부터 에리스리톨을 정제하는 과정을 복잡하게 하거나, 발포성에 따른 발효의 어려움을 나타내는 등 에리스리톨의 제조에 공업적으로 이용하기에 부적합한 여러 가지 문제점을 나타내고 있다. 또한, 칸디다 리포리티카 균주의 경우에는 고가의 알칸계 탄소원을 이용해야 하기 때문에 비경제적일 뿐아니라, 기질로 사용된 알칸류가 제품중에 잔류할 가능성이 있는 등의 단점을 가지고 있다.

이에, 본 발명자들은 상기 설명한 기존의 에리스리톨 생산균주들이 나타내는 여러 문제점을 극복할 수 있을 뿐아니라 에리스리톨을 고역가로 제조할 수 있는 신규의 균주를 개발하고자 집중적인 연구를 수행하였으며, 그 결과 본 발명에 따른 칸디다속 균주 JH110이 이러한 목적에 부합됨을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 에리스리톨 생성능을 갖는 신규의 칸디다속 균주 JH110을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 신규의 균주를 이용하여 에리스리톨을 고수율로 제조하는 방법을 제공함을 목적으로 한다.

이하, 본 발명의 구성을 좀더 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 균주는 소비(벌집)에서 선별하였는데, 이와같이 소비를 이용한 이유는 에리스리톨의 생산성을 고려한 것으로서 고농도의 기질을 발효에 이용하는데 필요한 내당성 균주를 얻기위한 목적에서 고안되었다.

먼저, 본 발명가들은 경기도 일대의 봉장에서 소비를 채취한 다음, 포도당 및 효모추출물을 함유하는 배지에 첨가하여 30℃에서 24시간동안 배양하였으며, 배양액을 아가배지에 도말(spreading)하고 30℃에서 48시간동안 배양하는 과정을 거쳐 콜로니를 수득하였다. 수득된 각각의 콜로니를 포도당 100g/L, 효모추출물 10g/L 의 조성을 갖는 발효배지에 접종하고 교반하면서 30℃에서 5일간 배양한 다음, 각 배양액중의 에리스리톨 존재여부를 HPLC 및 GC-MASS 로 검사하여 에리스리톨 생성능이 가장 높은 콜로니를 선별함으로써 본 발명이 목적하는 에리스리톨 생산균주를 획득하였다.

상기 방법으로 수득한 본 발명에 따른 균주는 크기가 일반효모의 표준인 5㎛ 정도로서 현미경 관찰을 통하여 둥군 모양인 것을 알 수 있다. 또한, 아가 배지에 도말하는 경우 둥글고 매끄러운 콜로니를 형성하는데, 처음에는 투명하게 보이다가 점차 하얗게 변해가며, 그후 시간이 더 경과하면 연한 갈색으로 변하고 점점 그 농도가 진해진다.

한편, 일부 세포에서 출아(budding)현상이 관찰되는 것으로 보아 본 발명의 균주는 출아법으로 번식함을 알 수 있으며, 그 이외에 다음과 같은 균주 특성을 나타낸다.

1) 효모 맥아당 한천(Yeast malt agar)배지에서 크림색 콜로니를 형성하고 시간이 경과하면 갈색의 콜로니로 변한다.

2) 생리학적 성질

생육온도 : 25 내지 35℃

최적생육온도 : 26 내지 30℃

생육_PH : 2.5 내지 8.0

최적_PH : 4.0 내지 6.5(약산성)

퀴논(Quinone type) : Q-9(major), Q-8(minor)

지방산(Fatty acid type) : C18:1, C16:1, C16:0

우레아제(Urease)생성 : 없음

아르기닌 다이하이드롤라제(Arginine digydrolase) 생성 : 없음

젤라틴 가수분해(gelatin hydrolysis) : 없음

DBB(디아조늄 B 블루) 염색 : 음성

3) 당의 발효성

상기 나타낸 특성을 공지균주들과의 특성과 비교한 결과, 본 발명의 균주는 생리학적 성질면에서 칸디다 속의 칸디다 리포리티카 균주와 가장 유사한 것으로 동정되었다. 그러나, 본 발명의 균주는 칸디다 리포리티카 균주와도 상이한 몇가지 특징을 보이는데, 예를들어 칸디다 리코리티카 균주의 경우 탄수원으로서 알칸계 탄화수소를 사용하여야 하는데 반해 본 발명에 따른 균주는 탄소원으로서 포도당, 설탕, 과당을 사용할 수 있다는 점에서 차이를 보이고 있다.

그러나, 호기성 효모에 속하는 다른 균주들에 비해 상기의 공지균주와 가장 높은 유사성을 보이므로 본 발명에 따른 균주는 칸디다 속의 신규한 균주인 것으로 판단하였으며, 이에 따라 본 발명자들은 이 균주를 칸디다 JH110 으로 명명하고 1996년 5월 23일자도 한국종균협회에 KFCC-10900 의 수탁번호로 기탁을 완료하였다.

본 발명에 따른 고역가 균주의 배양에 사용할 수 있는 탄소원으로는 포도당, 설탕, 과당 등을 언급할 수 있고, 유기 및 무기 질소원으로는 분말효모, 펩톤, 카자미노산, 요소 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 균주의 생육가능한 온도는 25내지 35℃이며, 최적의 생육온도는 26내지 30℃범위이다. 또한, 배양 가능한H는 2.5내지 8.0으로서 광범위하며, 바람직하게는 4.0 내지 6.5 의 약산성부근에서 최적의 생육상태를 나타낸다. 본 발명의 균주를 5내지 6일간 통기교반하면서 배양하면 에리스리톨이 생성되는데, 그 이상으로 배양기간을 늘려도 생성되는 에리스리톨의 양에는 별다른 차이가 없으며 배양액중에는 주로 에리스리톨이 생성되고 글리세롤과 같은 그밖의 당알콜류는 거의 생성되지 않는다.

이와 같이 당알콜류를 부생하지 않을 뿐아니라 제품중에 잔류되어서는 안되는 알칸계 탄화수소를 기질로 이용하지 않고 소량 잔류해도 무방한 포도당 등을 기질로 이용하므로 본 발명의 균주를 이용하여 제조된 에리스리톨은 정제후의 식품안전성 면에서 탁월한 효과를 나타내며, 또한, 통상의 방법을 통해 충분히 용이하게 정제가능하다. 즉, 본 발명의 균주를 이용하여 제조된 에리스리톨은 예를들어 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고, 활성탄으로 탈색시킨 후 이온교환수지(SK-1B : SA20AP = 2 : 1)로 탈염시키고 농축시킨 다음 5℃에서 보존하는 과정을 통해 결정상태로 얻어질 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위를 이들 실시예로 한정해서는 안된다.

[실시예 1]

[칸디다 JH110 균주의 순수분리]

포도당(Showa) 400g/L, 효모추출물(Difco) 10g/L의 조성을 갖는 배지가 30㎖ 들어있는 500㎖ 배플(baffled) 풀라스크에 소비(벌집)를 0.5g/ℓ 농도로 첨가하고 200rpm의 교반속도로 30℃에서 24시간동안 배양하였다. 배양액을 증류수로 10배 희석하고 아가배지(조성 : 포도당(Showa) 200g/L, 효모추출물 (Difco) 10g/L, 아가((Difco) 20g/L)에 도말(spreading)한 다음, 30℃에서 48시간동안 배양하여 콜로니를 수득하였다. 각각의 콜로니는 다른 페트리 디쉬에 스트리킹(streaking)하여 보관하였다.

상기에서 수득한 각각의 콜로니를 5㎖ 시험관에 들어있는 발효배지 (조성 : 포도당(Showa) 100g/L, 효모추출물 (Difco) 10g/L)에 1백금니로 접종한 다음, 200 rpm 의 교반속도로 30℃에서 5일간 배양하였다. 배양액을 원심분리(10000rpm, 5분)하여 세포를 제거한 후, 여과하였다. 각각의 여액에 대하여 에리스리톨 존재여부를 HPLC 및 GC-MASS로 검사함으로써 에리스리톨 생성능이 가장 높은 콜로니를 선별하여 수득한 다음, 이 균주를 칸디다 JH110 으로 명명하고 1996년 5월 23일 자도 한국종균협회에 KFCC10900의 수탁번호로 기탁하였다.

[실시예 2]

[칸디다 JH110 균주를 이용한 포도당으로부터의 에리스리톨의 제조]

포도당 30%(w/v), 분말효모 1.5%(w/v), 카자미노산 2%(w/v)가 함유된 배지 50㎖를 500㎖ 용량의 삼각플라스크에 가하고 여기에 실시예1에서 수득한 칸디다 JG110 균주 1백금니를 접종하고 72시간동안 배양하여 종배양액을 제조하였다.

상기 종배양시의 배지와 동일한 배지 2ℓ를 5ℓ 용량의 발효조에 넣고 소포제로서 실리콘 오일(상표명 : neonine)을 1000ppm으로 가한 후 121℃, 1.2기압에서 15분간 살균하였다. 여기에 종배양액 100㎖를 접종하고 통기량 2vvm, 26℃, 700rpm의 조건에서 7일간 배양하였다. 배양완료후 소모된 포도당을 기준으로한 에리스리톨의 수율은 20%였고 그밖의 당알콜류는 생성되지 않았다.

실시예3 : 칸디다 JH110 균주를 이용한 설탕으로부터의 에리스리톨의 제조

설탕 30%(w/v), 분말효모 1.5%(w/v), 카자미노산 2%(w/v)가 함유된 2ℓ 배지를 5ℓ 용량이 발효조에 넣고 소포제로서 실리콘 오일(상표명 : neonine)을 1000ppm으로 가한 후 121℃, 1.2기압에서 15분간 살균하였다. 여기에 실시예2에서 제조한 종배양액 100㎖를 접종하고 통기량 2vvm, 26℃, 700rpm의 조건에서 7일간 배양하였다. 배양완료후 소모된 설탕을 기준으로한 에리스리톨의 수율은 20%였고 그밖의 당알콜류는 생성되지 않았다. 따라서, 기질로 포도당을 사용하든 설탕을 사용하든 에리스리톨의 제조수율에는 별 차이가 없음을 확인하였다.

Claims (6)

1. 에리스리톨 생성능을 갖는 칸디다(Candida) JH110 균주 (기탁번호 : KFCC-10900).
2. 제1항에 따른 균주를 액체배지에서 호기적으로 배양함을 특징으로하여 에리스리톨을 제조하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 액체배지중의 탄소원으로 포도당, 과당 및 설탕중에서 선택된 1종 이상을 사용하는 방법.
4. 제2항에 있어서, 액체배지중의 질소원으로 분말효모, 펩톤, 카자미노산 및 요소 중에서 선택된 1종 이상을 사용하는 방법.
5. 제2항 내지 4항중의 어느 한 항에 있어서, 25내지 35℃의 온도 및_PH 2.0 내지 8.0에서 5내지 6일간 교반하면서 배양하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 26내지 30℃의 온도 및_PH 4.0 내지 6.5에서 배양하는 방법.