JP2626692B2

JP2626692B2 - 新規変異株

Info

Publication number: JP2626692B2
Application number: JP21031587A
Authority: JP
Inventors: 堯佐々木; 隆文春見; 圭二貝沼; 博明石塚; 勝雄若生; 嶽川口; 恒郎小田
Original assignee: 農林水産省食品総合研究所長; 日研化学株式会社
Priority date: 1987-08-26
Filing date: 1987-08-26
Publication date: 1997-07-02
Anticipated expiration: 2012-07-02
Also published as: JPS6455176A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、オーレオバシディウム属に属する新規な人
工変異株であるオーレオバシディウムsp.SN−γ96株に
関する。

〔従来の技術〕

微生物を用いてエリスリトールを製造する方法は公知
であり、例えば特開昭60−110295号公報にはモニリエラ
属に属する微生物を用いる方法が記載されており、特開
昭61−31091号公報にはオーレオバシディウム属に属す
る微生物を用いる方法が記載されている。

これらの方法は原料糖からのエリスリトールへの変換
率が高く、微生物の耐糖性も比較的高いという点で優れ
ているが、これらの微生物は培養時に泡の発生が著し
く、消泡剤を多量に使用してもこれを有効に抑えられな
いという欠点があった。なお、上記の特開昭61−110295
号等においてはキサンタンガムなどを用いて泡の抑制を
試みているが効果は必ずしも十分でない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明者らは、エリスリトール生産能の高い工業的利
用可能な菌株について広範な探索を行い、オーレオバシ
ディウムsp.SN−124A株（FERM BP−1429）を見出し、先
に特許を出願した。

このSN−124A株は、エリスリトールへの変換能が非常
に高く、増殖力も非常に旺盛であるという特徴がある
が、耐糖性が十分でなく、その上培養の際の泡の発生も
かなり激しいという欠点があった。

〔課題を解決するための手段〕

そこで、本発明者らは上記オーレオバシディウムsp.S
N−124A株から耐糖性，起泡性の改善された変異株を誘
導、分離するべく種々検討した結果、紫外線照射処理お
ほび突然変異誘起剤による処理を反復して適用した菌株
の中から耐糖性が高く、起泡性のない菌株を分離するこ
とに成功し、本発明に到達した。

即ち、本発明は糖濃度40％（W/V）以上の環境（培
地）で良好な発育と高いエリスリトール産生能を維持す
ることができ、且つ菌体が親水性，非凝集性であり、液
体培地中で好気的に培養するとき泡を実質的に生成しな
い新規変異株、オーレオバシディウムsp.SN−γ96株に
関する。

本発明の変異株は、親株であるオーレオバシディウム
sp.SN−124A株に周知の変異手段、即ち紫外線照射、γ
線照射および突然変異誘起剤による処理を反復適用した
結果得られたものであり、親株であるオーレオバシディ
ウムsp.SN−124A株に較べて耐糖性が高い点，変換率
（収率）が高い点および菌体が親水性に変化している点
で異なっている。

次に、本変異株および本変異株の造成に用いた親株
（野生株）の菌学的性質を示す。

〔Ａ〕オーレオバシディウムsp.SN−124A株（野生株）
の菌学的性質１）培地上の生育状況ａ）顕微鏡的所見栄養細胞の大きさ（＊１）４〜７×４〜15μ 栄養細胞の形状（＊１）菌糸および酵母様の単胞、卵形等の形状を示す。

栄養細胞の増殖方法（＊１）菌糸および酵母様細胞の多極出芽。

菌糸体（＊２）真性菌糸を形成し、先端および側面に全分芽形分
生子を多数生ずる。

（註）＊１ YM寒天培地に27℃、５日間培養。

＊２ポテトグルコース寒天によるスライド培
養。

ｂ）寒天斜面（＊３）生育良好光沢無し色調日数の経過に伴い、白色からうすい黒色のコロニーに変化する。

（註）＊３ YM寒天培地ｃ）液体培養（＊４）表面生育厚い皮膜形成濁度透明沈査大（註）＊４ YM液体培地２）子のう胞子の形成ポテトグルコース寒天培地形成せずコーンミール寒天培地形成せず YM寒天培地形成せずニンジンエキス寒天培地形成せず V₈寒天培地形成せず３）生理学的性質酸素要求性好気的生育温度約40℃まで最適生育温度 35〜37℃ 生育pH 2.5〜9.5 最適生育pH ４〜７ KNO₃資化性（＊５）有り (NH₄)₂SO₄資化性（＊５）有り尿素の分解有りゼラチンの液化無しカロチノイドの生成無し有機酸の生成有りアルブチン無しデンプン様物質の生成無しビタミンの要求性（＊５）有りグルコースの濃度（＊６） 50％生育＋＋ 60％生育＋＋食塩濃度（＊７）２％生育＋＋６％生育− （註）＊５ Wickerhamの合成培地を用いるJ.Lodder
らの方法により判定した。

＊６寒天培地＊７液体培地４）糖の発酵性（＊５）グルコース＋＋ラクトース − ガラクトース − メリビオース − シュクロース＋＋ラフィノース − マルトース＋セロビオース − トレハロース − イヌリン − ５）糖、有機酸等の資化性グルコース＋＋Ｄ−キシロース ± ガラクトース − エリスリトール − Ｄ−アラビノース − Ｌ−アラビノース − Ｄ−リボース＋シュクロース＋Ｌ−ラムノース − マルトース＋エタノール − セロビオース＋サリシン − Ｌ−ソルボース − リビトール − ガラクチトール − グリセリン＋トレハロース − ラクトース − メリビオース − Ｄ−マンニトール＋ラフィノース − メレチトース − α−メチル−Ｄ−グルコシド − イヌリン ± イノシトール − 可溶性デンプン − DL−乳酸 − コハク酸 ± クエン酸 ± 〔Ｂ〕オーレオバシディウムsp.SN−γ96株（変異株）
の菌学的性質オーレオバシディウムsp.SN−γ96株の菌学的性質
は、上記のオーレオバシディウムsp.SN−124A株（野生
株）の菌学的性質のうち、「糖、有機酸等の資化性」に
おいて下記第１表に示すような相違を有すること以外は
親株の菌学的性質と同一である。

上記説明からも明らかなように、本発明の変異株オー
レオバシディウムsp.SN−γ96株は野生株であるオーレ
オバシディウムsp.SN−124A株と極めて類似した菌学的
性質を有する。しかしながら、本変異株は後記試験例に
示すように耐糖性が高いことおよび菌体が親水性で培養
の際に泡を生成しない点で従来のオーレオバシディウム
に属する菌株と相違する。

即ち、オーレオバシディウムsp.SN−124A株（野生
株）は培地のグルコース濃度が33.5％以下の条件では3
7.0〜41.5％の比較的良好なエリスリトールへの変換率
を示すが、グルコース濃度が39.5％以上になると変換率
の急激な低下が認められ、グルコース濃度45％では約16
％に低下する。これに対して、本発明のオーレオバシデ
ィウムsp.SN−γ96株（変異株）は、培地のグルコース
濃度が60％を超えてもエリスリトールへの変換率はほと
んど低下が認められず、グルコース濃度75％でも尚32％
の変換率を維持している。更に、本発明のオーレオバシ
ディウムsp.SN−γ96株は菌体が親水性で培養の際に実
質的に泡の発生が認められない。

本発明者らは、本発明の変異株についての上記の特徴
から、本変異株はオーレオバシディウム属に属する新規
な変異株であると判断し、本変異株をオーレオバシディ
ウムsp.SN−γ96株と命名した。

本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM
BP−1431として寄託されている。

次に、本発明の変異株の培養方法および該変異株を用
いるエリスリトールの製造方法について説明する。尚、
以下の説明中で用いる％は特にことわりのない限り、容
量（W/V）％である。本菌株の培養は炭素源，窒素源，
無機塩類等を含む液体培地を用いて好気的条件下に実施
される。

液体培地の炭素源としてはグルコース，フルクトー
ス，シュクロース等の糖質が使用される。糖質の使用量
（添加量）は培地量の10〜95％、好ましくは20〜70％で
ある。窒素源としては微生物により利用可能な窒素化合
物、例えば酵母エキス，ペプトン，麦芽エキス，カザミ
ノ酸，コーンスチープリカー等が使用される。

無機塩類としては、例えば硫酸第一鉄，塩化カリウ
ム，塩化ナトリウム，リン酸二水素カリウム，水酸化カ
ルシウム等の塩類が使用される。

尚、これらの炭素源，窒素源，無機塩類の他に、更に
必要に応じて、酵母の生育に必要な各種の有機物，無機
物あるいは通常用いられている消泡剤等を添加すること
ができる。

培養は、前記組成の液体培地に本変異株の菌体を直接
接種するか、または別に前培養によって得られる種培養
液を接種して行われる。この種菌培養液の調製は、例え
ば常法により斜面培養した菌をグルコース45.0％、コー
ンスチープリカー6.2％を含むpH4〜６の液体培地に１白
金耳接種して34〜36℃の温度で２〜４日間培養すること
により行われる。

培養温度は微生物が生育しうる範囲内、即ち30〜38℃
で行われるが、好ましくは35〜37℃の範囲である。な
お、培地のpHは４〜９、好ましくは４〜７の範囲で調整
される。

培養期間は使用する培地の種類および炭素源である糖
質の濃度により異なるが、通常４〜８日間程度である。

培養は培地の栄養源が最大限に利用され、かつ培養液
中のエリスリトールの生成量が最高に達した時点で培養
を終了させることができるように、培養液中のエリスリ
トール量をガスクロマトグラフィー，高速液体クロマト
グラフィー等の周知の方法によって測定しながら行うこ
とが望ましい。

培養液中に蓄積されたエリスリトールは、培養終了
後、常法によって培養液中から分離される。即ち、かか
る場合に当該分野において通常使用されている周知の手
段、例えば濾過，遠心分離，イオン交換または吸着クロ
マトグラフィー，溶媒抽出，蒸留，結晶化等の操作が必
要に応じて適宜組み合わせて用いられる。一例を挙げれ
ば、培養液から濾過，遠心分離等によって菌体を除去
し、次いでこの液を活性炭で処理して着色物質などを除
き、更にイオン交換樹脂により脱イオンしたのち、液を
濃縮してシロップとする。次いで、このシロップからエ
リスリトールを結晶化して分離する。

〔実施例〕

次に、本発明を実施例および試験例等により詳しく説
明する。

試験例１（耐糖性試験）酵母エキス2.0％および所定量（22.0〜83.3％）のグ
ルコースを含む液体培地100mlをそれぞれ500ml容の三角
フラスコに入れ、常法により滅菌を行ったのち、オーレ
オバシディウムsp.SN−γ96株（FERM BP−1431）または
同SN−124A株（FERM BP−1429）の斜面培養菌体を接種
し、それぞれ種菌培養を35℃で１〜５日間行う。

次に、所定量（22.0〜83.3％）のグルコースおよび酵
母エキス2.0％を含む液体培地2Lを3L容の発酵槽に入
れ、これに上記の対応する基質濃度の種菌培養液80mlを
加えて培養温度35℃、通気量2.0vvm、回転数（攪拌）10
00rpmの条件でそれぞれの培地のグルコースが完全に消
費されるまで（２〜14日間）培養する。

培養終了後、各培養液中のエリスリトール含量を高速
液体クロマトグラフィーで測定して、第２表の結果を得
た。

試験例２（発泡性，凝集性および親水性試験）酵母エキス1.6％，グルコース40.0％を含む液体培地5
mlを試験管に入れ、常法により滅菌を行う。これにオー
レオバシディウムsp.SN−γ96株（FERM BP−1431）また
は同SN−124A株（FERM BP−1429）の斜面培養菌体を接
種し、30℃で５日間振盪培養して各培養液における泡の
生成状態および培養停止後の菌体の凝集状態を観察し
た。

培養中、SN−γ96株の培養液には発酵による泡の発生
が全くみられず、振盪による泡の生成がわずかにみられ
るのみであった。また、振盪停止後は泡が直ちに消失
し、菌体は培養液中に均一に懸濁した状態になってい
る。一方、SN−124A株の場合は、培養中に激しく生成し
た泡が培養停止後もほとんど消失することなく、その量
は培地量（高さ）の80％にも達しており、この泡は数時
間放置しても消失せず、菌体は凝集して底部および泡の
周辺に分離する。

更に、上記の培養液に培養液と同量のベンゼンを加え
て激しく攪拌後、約30分静置して菌体の状態を観察した
ところ、SN−γ96株の菌体は全て水層にとどまり、ベン
ゼン層への移行が認められなかったのに対して、SN−12
4A株の菌体は全てベンゼン層に移行して水層が透明とな
り、二つの菌体の親水性の相違が明瞭に観察された。

実施例１（変異株の造成）オーレオバシディウムsp.SN−124A株（FERM BP−142
9）をグルコース22.0％，酵母エキス0.5％を含む5.0ml
の液体培地に接種し、温度30℃で２日間振盪培養し、培
養物を得た。

次に、上記で得られた培養物を22.0％グルコース溶液
で100倍に希釈し、シャーレ中でゆるやかに攪拌しなが
ら30cmの距離から15Wの紫外線ランプ（東芝殺菌灯「GL1
5」）を40分間照射した。

終了後、シャーレ中の処理液をグルコース22.0％，酵
母エキス0.5％の寒天1.5％を含む寒天培地に塗布し、30
℃で４日間静置培養して生育した菌株を選抜した。

次に、上記処理で選抜した菌株をグルコース22.0％，
酵母エキス0.5％の液体培地に接種し、30℃で２日間振
盪培養して培養物を得た。

このようにして得た培養物を上記と同様にして希釈し
たのち、上記と同じ条件により再度20分間紫外線照射し
た。

照射後、処理液をグルコーシ33.5％，酵母エキス1.0
％，寒天1.5％を含む寒天培地に塗布し、30℃で４日間
静置培養し、生育した菌株を選抜した。

更に、上記より選抜した菌株をグルコース33.5％，酵
母エキス1.0％を含む液体倍地に接種し、30℃で２日間
振盪培養して培養物を得た。

次に、上記で得られた培養物から遠心分離により菌体
を分離し、更にこの菌体を2Mのグルコースを含む0.2M酢
酸緩衝液（pH5.0）で２回洗浄したのち、１×10⁷cell/m
lとなるように菌体を緩衝液に懸濁し、1mg/ml濃度のＮ
−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンによ
り30℃で30分間処理した。

終了後、常法により菌体を分離し、更に緩衝液で洗浄
したのち、グルコース40.0％，酵母エキス1.0％，寒天
1.5％を含む寒天培地に塗布して30℃で５日間静置培養
し、生育した菌株を選抜した。

次に、上記より選抜した菌株を酵母エキス1.6％，グ
ルコース40.0％からなる液体培地に接種し、30℃で２日
間振盪培養して培養物を得た。次いで、上記で得られた
培養物を１×10⁷cell/mlに希釈したもの3mlをガラス製
の試験管に入れ、18cmの距離からγ線（⁶⁰Co）を200kRa
d照射した。

終了後、処理菌体をグルコース45.0％，酵母エキス1.
6％，寒天1.5％を含む寒天培地に塗布し、30℃で５日間
静置培養して生育した菌体を選抜して変異株オーレオバ
シディウムsp.SN−γ96株（FERM BP−1431）を得た。

参考例１（ａ）種菌培養液の調製グルコース40.0％，酵母エキス1.6％，寒天1.5％から
なる斜面培地にオーレオバシディウムsp.SN−γ96株（F
ERM BP−1431）の菌体を塗布し、35℃で５日間静置培養
した。

次に、グルコース40.0％，酵母エキス1.6％を含む液
体培地（pH4.9）100mlを入れた500ml容量の三角フラス
コに上記斜面培養菌体を１白金耳植菌し、35℃で３日間
培養を行った。更に、この培養液9mlを上記と同様の液
体培地150mlを入れた500ml容量の三角フラスコに接種
し、35℃で３日間振盪培養して培養物を得た。

（ｂ）本培養グルコース40.0％およびコーンスチープリカー6.8％
を含む液体培地（グルコースおよびコーンスチープリカ
ーは予め別々に滅菌したものを使用）15Lを30L容量の発
酵槽に入れ、消泡剤（旭電化KK製「アデカノールLG−10
9」）300ppmを加え、水酸化ナトリウムを用いて培地のp
Hを4.2に調整した。これに上記（ａ）で調製したオーレ
オバシディウムsp.SN−γ96株の種菌培養液900mlを加
え、温度35℃，通気量1.0vvm,回転数400rpmで４日間培
養を行った。

培養終了後、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）に
より培養液の分析を行った結果、グルコースは完全に消
費されており、培養液中のエリスリトール含量は18.9％
（収率47.3％）、グリセリン含量は3.5％（収率8.8％）
であった。

次に、この培養液600mlを採り、遠心分離により菌体
を除去し、更に活性炭による脱色およびイオン交換樹脂
（IRA−140:IR−120＝2:1）による脱塩を行った。次い
で、溶出液を糖濃度50％以上に濃縮したのち、徐冷して
結晶を析出させて分離し、更にこの結晶を水から再結晶
させて多面体様の白色結晶を得た。この結晶の融点は12
1.0℃で、爽やかな甘味を有していた。更に、この結晶
は液体クロマトグラフィー，ガスクロマトグラフィー，
旋光度および核磁気共鳴スペクトルの測定によりエリス
リトール（meso−エリスリトール）と同定された。

参考例２グルコース50％およびコーンスチープリカー6.8％を
含む培地（培地材料は予め別々に滅菌したものを使用）
15Lを容量30Lの発酵槽に入れ、消泡剤300ppmを加え、水
酸化ナトリウムを用いて培地のpHを4.2に調整した。こ
れに参考例１（ａ）の方法に従って調製したオーレオバ
シディウムsp.SN−γ96株の種菌培養液90mlを加え、温
度35℃，通気量1.5vvm,回転数400rpmの条件で６日間培
養を行った。

培養終了後、培養液の分析をしたところ、グルコース
は完全に消費されており、培養液中のエリスリトール含
量は23.3％（収率46.5％）、グリセリン含量は4.5％
（収率9.0％）であった。

参考例３グルコース60.2％、酵母エキス2.0％の液体培地（培
地材料は予め別々に滅菌したものを使用）2Lを3Lの発酵
槽に入れ、消泡剤200ppmを加えた。これに参考例１
（ａ）の方法に従って調製したオーレオバシディウムs
p.SN−γ96株の種菌培養液80mlを加え、温度35℃，通気
量2.5vvm,回転数1000rpmの条件で７日間培養を行った。

培養終了後、培養液の分析をしたところ、グルコース
は完全に消費されており、培養液中のエリスリトール含
量は28.8％（収率47.7％）、グリセリン含量は6.8％
（収率11.3％）であった。

参考例４グルコース75.5％、酵母エキス2.0％を含む液体培地
（培地材料は予め別々に滅菌したものを使用）2Lを容量
3Lの発酵槽に入れ、消泡剤200ppmを加えた。これに参考
例１（ａ）の方法に従って調製したオーレオバシディウ
ムsp.SN−γ96株の種菌培養液80mlを加え、温度35℃，
通気量2.0vvm,回転数1000rpmの条件で11日間培養を行っ
た。

培養終了後、培養液の分析を行ったところ、グルコー
スは完全に消費されており、培養液中のエリスリトール
含量は24.5％（収率32.4％）、グリセリン含量は11.0％
（収率14.3％）であった。

参考例５シュクロース50.0％およびコーンスチープリカー6.8
％を含む培地（培地材料は予め別々に滅菌したものを使
用）5Lを容量7Lの発酵槽に入れ、消泡剤300ppmを加え、
水酸化ナトリウムを用いて培地のpHを4.2に調整した。
これに参考例１（ａ）の方法に従って調製したオーレオ
バシディウムsp,SN−γ96株の種菌培養液300mlを加え、
温度35℃，通気量1.0vvm,回転数800rpmの条件で５日間
培養を行った。

培養終了後、培養液の分析を行った結果、シュクロー
スは完全に消費されており、培養液中のエリスリトール
含量は23.6％（収率47.2％）、グリセリン含量は5.0％
（収率10.0％）であった。

参考例６シュクロース61.0％、酵母エキス2.0％の液体培地
（培地材料は予め別々に滅菌したものを使用）2Lを容量
3Lの発酵槽に入れ、消泡剤200ppmを加えた。これに参考
例１（ａ）の方法に従って調製したオーレオバシディウ
ムsp.SN−γ96株の種菌培養液80mlを加え、温度35℃，
通気量2.0vvm,回転数1000rpmの条件で６日間培養を行っ
た。

培養終了後、培養液の分析をしたところ、シュクロー
スは完全に消費されており、培養液中のエリスリトール
含量は24.6％（収率40.3％）、グリセリン含量は7.8％
（収率12.8％）であった。

参考例７シュクロース93.3％、酵母エキス2.0％の液体培地
（培地材料は予め別々に滅菌したものを使用）2Lを容量
3Lの発酵槽に入れ、消泡剤200ppmを加えた。これに参考
例１（ａ）の方法に従って調製したオーレオバシディウ
ムsp.SN−γ96株の種菌培養液80mlを加え、温度35℃，
通気量2.0vvm,回転数1000rpmの条件で15日間培養を行っ
た。

培養終了後、培養液の分析をしたところ、シュクロー
スは完全に消費されており、培養液中のエリスリトール
含量は21.6％（収率23.0％）、グリセリン含量は4.9％
（収率5.3％）であった。

〔発明の効果〕

本発明の新規突然変異株オーレオバシディウムsp.SN
−γ96株は耐糖性が著しく高く、耐熱性に優れ、エリス
リトール産生能が高く、しかも培養の際に泡を実質的に
生じないので、工業的に使用する上で極めて有用であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者石塚博明茨城県筑波郡谷田部町稲荷前17−12 沼尻アパート208 (72)発明者若生勝雄埼玉県行田市持田５−10−２ (72)発明者川口嶽埼玉県行田市壱里山町21−６ (72)発明者小田恒郎東京都秋川市下代継128 (56)参考文献特開昭60−110295（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−31091（ＪＰ，Ａ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】糖濃度40％（W/V）以上の環境（培地）中
で良好な生育と高いエリスリトール生産能を維持するこ
とができ、且つ菌体（細胞）が親水性、非凝集性であ
り、液体培地中で好気的に培養するとき、泡が実質的に
生成しない新規変異株オーレオバシディウムsp.SN−γ9
6株（FERM BP−1431）。