JPS5846318B2 - ２−ケト−ｌ−グロン酸の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は微生物を利用して２−ケト−ルーグロン酸を
製造する方法に関する。

２−ケト−ルーグロン酸はアスコルビン酸（ビタミンＣ
）の製造における両値ある中間体である。

２−ケ）−Ｌ−グロン酸を塩基の存在下に加熱すること
によってアスコルビン酸に転化する方法は周知である。

たとえば、米国特許第３９６３５７４号、第３９２２１
９４号および第３９５９０７６号に示されているように
、限られた数の微生物のみが２・５−フケ１−−−Ｄ−
グルコン酸を還元して２−ケト−ルーグロン酸を形成す
るのに有効なことが当業者に知られている。

シトロバクタ−（Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ ）属の微生
物は以前はこの反応に有効であることが示されたことが
なかった。

本発明者等＆ｉ、２−ケト−ルーグロン酸またはその塩
を良好な収率で製造する方法はシトロバクタ−属の微生
物あるいはその変異株を２・５−フケ） −Ｄ−グルコ
ン酸またはその塩の存在下に水性栄養培地中で培養する
ことによって提供されることを発見した。

発酵は約２５〜約３５℃の温度で、もつとも好ましくは
約２５℃〜〆３０℃で約５．５〜７．５のｐＨ範囲で行
なうのが好ましい。

好ましい２・５−ジケト−Ｄ−グルコン酸塩は２・５−
ジケト−Ｄ−グルコン酸ナトリウムおよび２５−ジケト
−Ｄ−グルコン酸カルシウムである。

上記微生物はシトロバクタ−・フレウンジ（Ｃ１ｔｒｏ
ｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ）およびシトロノ
くクター°ジベルスス（Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｄ
ｉｖｅｒｓｕｓ ）であり、この発明に使用するのに好
ましい菌株はシトロバクタ−・フレウンジ（Ｃ１ｔｒｏ
ｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ ）ＡＴＣＣＡ６７５０
および１．０７８７である。

この発明に有用な微生物はシトロバクタ−属の２−ヶ）
−Ｌ−グロン酸生産菌株である。

多数のシトロバクタ一種が知られ、それらの菌株はＡＴ
ＣＣ（アメリカン タイプ カルチャー コレクション
）等の寄託機関から分譲されている。

たとえば、ＡＴＣＣはシトロバクタ−・フレウンジ（Ｃ
１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ） ＡＴ
ＣＣＡ ８０９０６７５０．８４５４．１０７８７．１
１１０２゜１１６０６．１１８１１および１４１３５な
らびにシトロバクタ−・ジベルスス（Ｃｉ ｔｒｏｂａ
ｃｔｅｒｄｉｖｅｒｓｕｓ ）ＡＴ ＣＣ４２７０２６
，２７０２７゜２７０２８および２７１５６である。

ＡＴＣＣカタログ第１３版によると、シトロバクタ−・
フレウジ（Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉ
ｉ ）およびシトロノ〈クター°ジベルスス（Ｃｉ ｔ
ｒｏｂａｃｔｅｒ ｄｉｖｅｒｓｕｓ ）のいくつか
の寄託菌株は以前は他の属および他の種に帰属するもの
として分類されている。

かくしてたとえばシトロバクタ−・フレウンジ （Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ）
ＡＴ ＣＣＡ６７５０はシトロバクター−インテルメジ
ウム （Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ
） およびエシェリキア・インテルメジウム（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉａｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｍ ）とも記載されて
いる。

本明細書においてはそのような分類はシトロバクタ−・
フレウンジおよびシトロバクタ−・ジベルスス菌株とし
て行なった。

このようにこの発明に有用な微生物はシトロバクタ−属
という標準分類基準に属するものである。

この属に関してはバージイズ・マニュアル・オフ・デタ
ーミネイティブ・ミクロバオロジー（Ｂｅｒｇｙｓ Ｍ
ａｎｎａｌ ｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ） （８版）（ザウィリアム
＆ ウイルキンス カンパニー（Ｔｈｅ Ｗｉｌｌｉａ
ｍ ＆ Ｗｉｌｌａｎｓ Ｃｏｍｐａｎｙ ）およびア
メリカン・タイプ・カルチャー・カタログ（Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃａ１ｔｕｒｅ Ｃａｔｏｌｏｇｕ
ｅ ）（第１３版）ならびにそれらに引用されている文
献に記載されている。

この発明によれば、２−ケ１−Ｌ−グロン酸の生産を上
記微生物に限定して行うことを意図していない。

これらの微生物をＸ線または紫外線照射し、ナイトロジ
エンアスタードのような薬品で処理することによって生
じる変異株も使用する。

そのような変異株も本発明の範囲に含まれる。

この発明の微生物の菌株の２−ケ） −Ｌ −）’ロン
酸生産能力は微生物を２・５−フケｌ−−Ｄ−グルコン
酸またはその塩の存在下水性栄養培地中で本明細書の記
載に従って培養することによって容易に決定できる。

上記シトロバクタ−（Ｃｉ ｔｒｏｂａｃｔｅｒ ）菌
株は２５−フケ） −Ｄ−グルコン酸またはその塩の存
在下にグルコース、ソルビトール、フラクトース、蔗糖
、グリセリン等の炭素源を含有する水性栄養培地中で培
養される。

グルコースは望ましくはグルコース−水和物（セレロー
ス）の形で使用すれば好適炭素源となる。

従来からの発酵方法によれば、栄養培地は窒素、カリウ
ム、リンおよびマグネシウム源をも含む。

本明細書中の水性栄養培地とは所望ならばさらに他の栄
養元素源を含んでもよい上記栄養素を含有する培地を意
味する。

炭素源は一般に約０．５ないし１５？／！Ｊツトルの濃
度で存在するであろう。

窒素は尿素又は硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、
リン酸アンモニウム等の無機窒素源を各々約０．１〜２
Ｐ／１，１ツトルの濃度で供給できる。

カリウム、マグネシウムおよびリンはリン酸カリウム、
リン酸アンモニウム、硫酸マグネシウム等の塩を一般に
発酵培地１リットル当り約０．１〜約２ゲの量で供給で
きる。

上記栄養素の濃度は臨界的ではなく、栄養培地の組成に
かなりの変化が可能である。

他の適当な培地は当業者に明らかであろう。

この発明の方法は特定の上記培地の使用に限定されるべ
きものではない。

従来の発酵方法によれば、シトロバクタ−菌株は一般に
上述の栄養素を含有し、望ましくは酵母エキスまたはペ
プトンのような栄養素を追加しである水性種母培地にま
ず導入する。

次いで微生物を約１〜３日、好ましくは約２５〜３５℃
、もっと好ましくは約２５〜３０℃で約５〜７．５のｐ
Ｈで培養する。

シトロバクター菌株を含有する種母培地の適当量、たと
えば約１〜１０容量／容量％を２・５−フケ）−Ｄ−グ
ルコン酸の還元に使用される水性栄養培地に導入する。

２ ・５−フケ）−Ｄ−グルコン酸は接種物を添加する
ときすでに上記水性栄養培地中に存在していてもよいが
、いく分後、たとえば約８〜３６時間インキュベーショ
ンをした後で添加した方がよい。

２・５−フケ）−Ｄ−グルコン酸は遊離塩またはその塩
、たとえばそのアルカリ金属塩またはアルカリ土金属塩
として添加してもよい。

好適塩は２・５−ジケト−Ｄ−グルコン酸ナトリウムお
よびカルシウムである。

２５−フケ）−Ｄ−グルコン酸またはその塩は当業者に
周知の発酵方法、たとえば米国特許第３７９０４４４号
に記載の方法によって製造できる。

２・５−フケ）−Ｄ−グルコン酸発酵ブロスをシトロバ
クタ−菌株を含有する水性栄養溶液に加えることができ
る。

別法として、２・５−ジケト−Ｄ−グルコン酸またはそ
の塩を発酵ブロスより単離し、栄養培地を含有するシト
ロバクタ−に加えることができる。

好ましくは、２・５−フケ）−Ｄ−グルコン酸出発材料
をベルギー特許第８７２０９５号および１９７９年９月
２８日に出願された係属中の出願第７９６６５号に記載
されているようにグルコース含有培地中でアセトバクタ
ー・セリヌス（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ Ｃｅｒｉｎｕ
ｓ Ｘ’好気培養することによって生成する２・５−フ
ケ）−Ｄ−グルコン酸含有発酵ブロスのアリコツトとし
て添加できる。

そのような発酵ブロスは約５〜約２０重量／容量％の２
・５−フケ）−Ｄ−グルコン酸またはその塩を含有す
るであろう。

そして充分量のブロスをシトロバクタ−（Ｃ１ｔｒｏｂ
ａｃｔｅｒ ）栄養培地に加えて２・５−フケ）−Ｄ−
グルコン酸またはその塩の初期濃度を約１．０ないし１
０重量／容量％にする。

別法としては、単離した２・５−フケ）−Ｄ−グルコン
酸またはその塩をシトロバクタ−（Ｃｉ ｔｒｏｂａｃ
ｔｅｒ ）発酵培地に加えて２・５−ジケト−Ｄ−グル
コン酸の上記濃度を遠戚することもできる。

２ ・５−ジケト−Ｄ−グルコン酸含有栄養培地中での
シトロバクタ−（Ｃｉ ｔｒｏｂａｃｔｅｒ ）菌株の
発酵は約２５℃ないし約３５℃、好ましくは約２５℃な
いし′３０℃で行なわれる。

発酵の間、培地のｐＨは酸又は塩基の添加により約５．
５〜７．５に維持するのが好ましい。

適当な酸は硫酸およびリン酸である。

適当な塩基はアルカリ金属水酸化物、好ましくは水酸化
ナトリウムあるいはアルカリ金属またはアルカリ土金属
の炭酸塩、たとえば炭酸ナトリウムまたは炭酸カルシウ
ムである。

そのような塩をｐＨコントロールのために栄養培地に添
加すると、相当する金属塩、たとえばナトリウム塩また
はカルシウム塩あるいはそれらの混合物の形で得られ、
そのような塩も本発明に含まれることは理解されよう。

所望ならば、さらに２−５−ジケト−Ｄ−グルコン酸ま
たはその塩を発酵の過程で培地に加えて、シトロバクタ
−・フレウンジ（Ｃｉ ｔｒｏｂａｃｔｅｒｆｒｅｕｎ
ｄｉｉ ）によって初期２・５−ジケト−Ｄ−グルコン
酸がいくらか資化された後に反応培地中の所望の２−ケ
）−Ｌ−グロン酸またはその塩の高濃度を得ることがで
きる。

シトロバクタ−・フレウンジを２−ケトーＬグロン酸へ
の転化が実質的に完了するまで培養する。

たとえばシクロバクター・フレウンジ（Ｃ１ｔｒｏｂａ
ｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ） ＡＴ ＣＣ１０，
６７５０を使用して２・５−フケ）−Ｄ−グルコン酸ま
たはその塩の転化を完全に行うには、約３６ないし約７
２時間かかるが、この時間は２・５−ジケトＤ−グルコ
ン酸の初期濃度、発酵温度および他の条件に依存する。

このようにして２・５−フケ１−−Ｄ−グルコン酸出発
化合物の約３０％の収率で２−ケトーＬ−グロン酸が得
られる。

発酵反応の進行は、反応培地中に残留する２・５−ジケ
ト−Ｄ−グルコン酸の濃度および生成した２−ケトーＬ
−グロン酸の濃度をペーパークロマトグラフィー、薄層
クロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィー
を含む周知分析技術によって測定することによって追跡
できる。

次いで２−ケトーＬ−グロン酸を単離し、従来方法を使
用して同定を行なう。

Ｊ、Ｃ，Ｓ、Ｃｈｅｍ、Ｃｏｍｍ、１９７９゜７４０参
照。

上記発酵により生産された２−ケトーＬ−グロン酸また
はその塩を単離し、当業者に周知の方法によって精製で
きる。

たとえば、発酵ブロスを沢過し、２−ケトーＬ−グロン
酸またはそのナトリウムあるいはカルシウム塩を低級ア
ルキルアルコール、特にメタノールあるいはエタノール
のような非溶媒の添加によって沈澱させる。

たとえば凍結乾燥等による溶媒除去等の他の単離方法も
使用できる。

塩の形で単離される場合、遊離２−ケ） −Ｌ −グロ
ン酸は鉱酸たとえば硫酸または塩酸を塩の溶液に添加す
るか陽イオン交換樹脂を使用することによって得ること
ができる。

２−ケトーＬ−グロン酸が遊離酸として単離される場合
、相当する塩は適当なアルカリ金属水酸化物または炭酸
塩あるいはアルカリ土金属炭酸塩との反応によって容易
に製造される。

下記例によって本発明を説明するが、本発明はこれに限
定されない。

例１ ｐＨ７，０を有する下記発酵培地を調製した：ソルビト
ール ３ ？／ｌ酵母エキス
２ ？／ｌ：ペプトン ２
？／１ＫＨ２ＰＯ４１９７７３ Ｍｇ５０４．７ Ｈ２Ｏ０，２ｆｌ／７３この種母培地
１００ｍ１を含む３００ｍ１フラスコに栄養寒天斜面培
養したシトロバクタ−・フレウンジ（Ｃ１ｔｒｏｂａｃ
ｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ） ＡＴ ＣＣ１６６７
５０の菌体（１０１ｎｌの滅菌水性懸濁液のうちの１
ｍｌｌ ）を接種した。

これらの菌体を２８℃の温度で２４時間培養し、その間
フラスコをロータリーシェーカーの上に置いて攪拌した
。

下記発酵培地１００ｍ１（ｐＨ６，７）を３００ｍ１７
ラスコに入れた： セレロース （ＮＨ４）２ＨＰＯ４ Ｈ２ＰＯ４ ＭｇＳＯ４，７Ｈ２０ てんさい糖みつ グリシン ２ ？／７３ １ ？／１ １ グ／ｌ Ｏ，５グ／１ ２ ？／７３ ０、２ ？／７３ これに上記２４時間種母培養物５容量／容量％を接種し
、２２時間ロータリーシェーカ上で振とうし、ｐＨが約
５となったとき、１５〜２０重量／容量％の２・５−フ
ケ）−Ｄ−グルコン酸ナトリウムを含有し、アセトバク
ター・セリスス（Ａ ｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒ
ｉｎｕｓ ）菌株ＩＦ’０３２６３をグルコース含有培
地中で２８℃で５０時間発酵させてつくった発酵ブロス
１５Ｔｌｌをシトロバクタ−・フレウンジ（Ｃ１ｔｒｏ
ｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ）培養物に加え、
水酸化ナトリウムの添加によってｐＨを６．５に調節す
る。

発酵を２８℃で続行し、ｐＨを２４時間毎に６．５に再
調節する。

５２時間後、２・５−ジケトグルコン酸塩は本質的に消
費され、２・５−フケ）−Ｄ−グルコン酸塩（出発化合
物）にもとづいて約３０％の収率で２−ケトーＬ−グロ
ン酸ナトリウムが得られた。

例２ 例１の方法をＡＴＣＣ／１６６７５０菌株の代りに下記
菌株を使用して繰返しても２−ケ）−Ｌ−グロン酸が生
成した（以下ＡＴＣＣ番号の後のカッコ内に２−ケ）−
Ｌ−グロン酸の収率（％）を示す。

）ニジトロバクター・フレウンジ（Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔ
ｅｒｆｒｅｕｎｄｉｉ ）ＡＴＣＣ８０９０（１５％）
；８４５４（１５％）；１０７８７（２５％）；１１１
０２（２５％）；１１６０６ （２５％）；１１８１１
（５％）；および１４１３５（１５％）；シトロバクタ
−・ジベルスス（Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒｄｉｖｅｒｓ
ｕｓ）ＡＴＣＣ２７０２６（１５％）；２７０２７（１
５％）；２７０２８（１５％）；および２７１５６（１
５％）； 例３ 例１に記載された種母培地をシトロバクタ−・フレウン
ジ（Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ）
Ａ Ｔ ＣＣ６７５０の菌体（１０ｍｌの滅菌水性懸
濁液のうちの１ｍ１）で接種した。

そしてこれらの菌体を２８℃で２０時間培養した。

例１の発酵培地１８００ｍｌを４リツトルの攪拌ポット
に入れ、上述の種母培地２０時間培養物５容量／容量％
を接種した。

これを０°のピッチを有するプロペラにより１７５０回
転／分で攪拌しながらかつ１容量／容量／分で培地に通
気しながら２８℃で８時間培養した。

８時間培養後、例１の２・５−フケ）−Ｄ−グルコン酸
ナトリウム１５〜２０重量／容量％を含有する発酵ブロ
ス２００ｒＩｌｌを加えた。

ｐＨを水酸化ナトリウムの添加により６，５に調節し、
通気速度を０．３容量／容量７分に低下させた。

２４時間毎にｐＨを６．５に調節しながら発酵を２８℃
で続行した。

４８時間後、２・５−フケ）−Ｄ−グルコン酸塩は本質
的に消費しつくされ、該２・５−ジケト−Ｄ−グルコン
酸出発化合物にもとづいて約２５％の収率で２−ケトー
Ｌ−グロン酸ナトリウムを得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １２・５−フケ１−−Ｄ−グルコン酸またはその塩の存
   在下に水性栄養培地中でシトロバクタ−（Ｃ１ｔｒｏｂ
   ａｃｔｅｒ ）属の２−ケトールーグロン酸生産微生物
   を培養することからなる２−ケトーＬグロン酸またはそ
   の塩を生産する方法。 ２ 微生物がシトロバクタ−・フレウンジ（Ｃｉｔｒｏ
   ｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ）またはシト０バ
   クター°ジベルスス（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｄｉ
   ｖｅｒｓｕｓ）の菌株であることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ３２ ・５−ジケト−Ｄ−グルコン酸塩が２・５−ジケ
   ト−Ｄ−グルコン酸ナトリウムである特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ４２・５−フケ１−−Ｄ−グルコン酸塩が２・５ジケト
   −Ｄ−グルコン酸カルシウムである特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ５ 培養がｐＨ約５，５ないし約７．５で行なわれる特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 培養が約２５℃ないし約３５℃で行なわれる特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 γ 菌株カシトロバクター・フレウンジ （Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ Ｘ
   Ａ Ｔ ＣＣＡ６７５０ ）である特許請求の範囲第２
   項記載の方法。 ８ 菌株がシトロバクタ−・フレウンジ （Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ ）
   （ＡＴ ＣＣ／１６１０７８７ ）である特許請求の範
   囲第２項記載の方法。