CS217986B2 - Method of making the 2-keto-l-gulonic acid - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby 2-keto-L-gulonové kyseliny mikrobiologickou cestou.

2-keto-L-gulo-nová kyselina je cenným meziproduktem pro přípravu kyseliny askorbové (vitamin C), která je základním vitaminem pro výživu člověka. V daném oboru jsou velmi dobře známy způsoby převádění 2-ke;to-L-guloin'ové kyseliny na kyselinu askorbovou, například -záhřev v přítomnosti báze.

V oboru je znám pouze omezený počet mikroorganismů schopných -redukovat 2,5-diketo-D-glukonovou kyselinu na kyselinu 2-keto-L-gulonovou (viz například USA patenty č. 3 963 574, 3 922 194 a 3 959 076). Nebylo - dosud popsáno, že by bylo- možno k této- reakci použít mikroorganismy rodu Citrobacter.

V souhlase -s vynálezem bylo- nyní zjištěno, že je možno připravit 2-keto-L-gulonovou kyselinu nebo její soli v dobrých výtěžcích kultivací -mikroorganismů rodu Citrobacter nebo- jejch mutantů, produkujících 2-keto-L-gulonovou kyselinu, ve vodném živném prostředí v přítomnosti 2,5-di'keto-D-glukonové kyseliny nebo její soli. Fermentace se s výhodou provádí při teplotě zhruba od 25 do' 35 -°C, nejvýhodněji při teplotě cca 25 až 30 °C, -a při hodnotě pH zhruba od 5,5 do 7,5. Výhodnými solemi 2,5-diketo-D-glukonové kyseliny jsou sodná sůl 2,5-diketo-D-glukonové kyseliny a vápenatá sůl 2,5-diketo-D-glukonové kyseliny. Mezi vhodné mikroorganismy náležejí Citrobacter freundii a Citrobacter diversus, přičemž výhodnými kmeny - mikroorganismů pro použití k práci způsobem podle vynálezu jsou Citrobacter freundii ATCC č. 6750 a 10 787.

M ‘ -kroorgainismy použitelnými pro - účely vynálezu jsou 2-keto-L-gulonovou kyselinu produkující kmeny rodu Citrobacter. Rada druhů rodu Citnobacter je známá a jejich kmeny jsou veřejně dostupné ze sbírek kultur, - ako je například americká -sbírka kultur (Američan Type Culture Collection — ATCC). Tak například v americké sbírce kultur jsou uloženy kmeny Citrobacter freundii označené jako ATCC -č. 8090, 6750, 8454, 10 787, 11 102, 11 606, 11 811 a 14 135, a Crt^irob^^cter -diversus, -označené jako ATCC č. 27 026, 27 027, 27 028 -a 27 156. Jak je uvedeno v Američan Culture Collec-tion Catal<oi^iue (13. vydání), bylo několik uložených kmenů Citrobacter freundii a Citrobacter diversus -dříve zařazováno· -k jiným rodům nebo druhům. Tak například Citrobacter freundii ATCC č. 6750 byl rovněž popisován jako Citrobacter intermedium a jako Escherichia intermedium. Pro účely tohoto- vynálezu je -těmto -dřívějším klasifikacím nadřazena identifikace --těchto mikroorganismů jako kmenů Citrobacter freundii a Citrobacter -diversus. Mikroorganismy použitelnými pro účely tohoto vynálezu jsou -tedy ty mikroorganismy, které vyhovují standardnímu klasifikačnímu kritériu pro rod Citrobacter, jak je popsáno například v Bergy’s Manual of Determinative Microbiology (8. vydání) (The William et Wilkins Company) a v Američan Type Culiture Catalogue (13. vydání) a v odkazech citovaných v těchto pracích. Je třeba zdůraznit, že výroba 2-keto-L-gulonové kyseliny způsobem podle vynálezu není omezena pouze na použití zmíněných mikroorganismů. Vynález zahrnuje rovněž použití -mu-fantů získaných z těchto mikroorganismů různými způsoby, jako -ozářením rentgenovými paprsky nebo ultrafialovým zářením, působením -dusíkatých hořčičných látek apod., přičemž tyto mutanty rovněž spadají do rozsahu vynálezu. Schopnost libovolného kmene mikroorganismu produkovat v -souladu s vynálezem - 2-keto-L-gulonovou kyselinu lze snadno zjistit kultivací tohoto mikroorganismu v přítomnosti - - . 2,5-diketo-D-glukonové kyseliny nebo- její soli ve vodném prostředí, v -souhlase -s- popisem a příklady provedení.

Kmen Citrobacter - se kultivuje s přítomnosti 2,5-diketo-D-glukonové kyseliny nebo- její -soli ve -vodném živném prostředí obsahujícím zdroj uhlíku, Jako- glukózu, sorbitol, fruktózu, sacharózu, glycerin apod. Výhodným zdrojem uhlíku je glukóza, účelně ve formě monohydrátu glukózy (cerelóza). V -souhlase s- běžnou fermentační praxí obsahuje živné prostředí rovněž zdroje dusíku, draslíku, fosforu a hořčíku. Výraz „vodné živné prostředí“, používaný v popisné části i v definici předmětu vynálezu, definuje -prostředí obsahující shora popsané živiny, popřípadě společně -s libovolnými dalšími zdroji nutričních prvků. Zdroj uhlíku je v živném prostředí -obecně přítomen v koncentraci -zhruba od 0,5 do- - 15 g/litr, s výhodou zhruba -od 1 do 5 g/litr. Dusík je možno ekonomicky dodat použitím močoviny - nebo anorganických zdrojů dusíku, - jako je síran amonný, - dusičnan amonný, - ' fosforečnan -amonný nebo· podobné -soli, a to vždy v koncentracích - Zhruba od- 0,1 -do 2 g/litr živného - prostředí. Draslík, - hořčík - a fosfor se snadno dodají- -přidáním solí, jako -fosforečnanu draselného, fosforečnanu amonného, síranu hořečnatého! -nebo podobných solí, obecně v množstvích zhruba od 0,1 g do 2 g/litr fermentačního prostředí. Koncentrace shora uvedených živin nehraje rozhodující úlohu - a v tomto ohledu jsou možné značné odchylky ve složení živného- prostředí. Odborníkům jsou pochopitelně známa jiná vhodná prostředí a způsob podle vynálezu není nikterak omezen pouze na použití konkrétního prostředí popsaného- výše nebo uvedeného v příkladech provedení.

V souladu !s běžnou fermentační praxí se kmen Citrobacter obecně nejprve uvede do vodného -očkovacího -prostředí -obsahujícího shora popsané živiny a popřípadě obsahujícího další živiny, jako kvasnicový extrakt nebo pepton. Mikroorganismus se poté kultivuje po· -dobu zhruba 1 -až 3 dnů, -s- výho217986 dou při teplotě zhruba - od 25 do 35 °C, nejvýhodněji od cca 25 do 30 °C, a při pH v rozmezí zhruba od 5 do 7,5.

Vhodný objem, například zhruba 1 až 10 procent (objem/oibjem) výsledného očkovacího prostředí obsahujícího kmen Citrobacter se potom vnese do vodného živného prostředí používaného k redukci 2,5-diketo-D-glukionové kyseliny; 2,5-diketo-D-glukonová kyselina může být ve vodném živném prostředí přítomna již při vnášení inokula nebo; - a to s výhodou, ji lze přidat - až po- určité době, například zhruba po osmihodinové až třicetišestihodinové inkubaci; 2,5-diketo-D-glu-kiOiniovou kyselinu je možno přidávat ve formě volné kyseliny anebo- její soli, například soli -s alkalickým kovem nebo kovem alkalické zeminy. Výhodnými solemi jsou sodná a vápenatá sůl 2,5-diketo-D-glukonové kyseliny; 2,5-diketio-D-glukonovou kyselinu nebo její sůl je možno - získat fermentačními postupy dobře známými v daném oboru (viz například USA patent č. 3 790 444). K vodnému živnému roztoku obsahujícímu kmen Citrobacter je možno přidat příslušný podíl fermentační půdy obsahující 2,5-diketo-D-glukonovou kyselinu.

Alternativně je možno 2,5-diketo-D-glu.konovou kyselinu nebo její sůl z fermentační půdy izolovat a přidat ji k živnému prostředí obsahujícímu kmen Citrobacter. S výhodou se výchozí 2,5-diketQ-D-glukonová kyselina přidává ve formě příslušné části fermentační půdy obsahující 2,5-diketo-D-glukonovou kyselinu, získanou aerobní kultivací Acetobacter cerinus v - prostředí s obsahem glukózy, jak je popsáno v belgickém patentu č. 872 095. Tato fermentační půda obsahuje cca 5 až 20 % (hmotnost/objem)

2,5-diketo-D-glukonové kyseliny nebo její soli, přičemž k živnému prostředí obsahujícímu kmen Citrobacter se má přidat takové množství této půdy, aby se dosáhlo počáteční koncentrace 2,5-diketo-D-glukonové kyseliny nebo její soli v rozmezí zhruba od 1,0 do 10 % (hmotnost/objem).

Alternativně je ' možno k dosažení této koncentrace 2,5-diketo-D-glukoínové kyseliny ve fermentačním prostředí obsahujícím kmen Citrobacter přidávat izolovanou 2,5-diketo-D-glukoniovou kyselinu nebo její sůl. Fermentace kmene Citrobacter v živném prostředí s obsahem 2,5-diketo-D-glukonové kyseliny se provádí při teplotě zhruba od 25 do 35 °C, s výhodou zhruba - od 25 do 30° Celsia. Během fermentace se hodnota pH fermentačního prostředí -s výhodou udržuje v rozmezí zhruba od 5,5 do 7,5, a to -přidáváním kyseliny nebo báze, tak jak to je v tom kterém případě potřebné. Mezi vhodné kyseliny náležejí kyselina sírová a kyselina fosforečná. Mezi vhodné báze náležejí hydroxidy alkalických kovů, s výhodou hydroxid sodný, nebo uhličitany alkalických kovů něho alkalických zemin, jako uhličitan sodný nebo uhličitan vápenatý. Je tře ba poznamenat, že přidávají-li se tyto soli k -živnému prostředí k udržování hodnoty pH, získá -se 2-keto-L-gulonová kyselina ve formě odpovídající soli s kovem, například ve formě soli sodné nebo- vápenaté, nebo ve formě směsi -těchto solí, přičemž vynález pochopitelně zahrnuje i přípravu těchto solí. Během fermentace se směs míchá, například mechanickým míchadlem nebo třepáním reakční nádoby.

Je-li to žádoucí, - lze k dosažení vyšších koncentrací žádané 2-keto-L-gulonové kyseliny nebo její soli v reakčním prostředí přidávat do tohoto prostředí v průběhu fermentace, po spotřebování určité části původně přidané 2,5-diketo-D-glukonové kyseliny mikroorganismem Citrobacter freundii další 2,5-diketo-D-glukonovou kyselinu nebo - její sůl.

Mikroorganismus Citrobacter freundii se kultivuje až - do prakticky úplného ukončení konverze na 2-keto-L-^ulonovou kyselinu. Tak například při použití Citrobacter freundii ATCC č. 6750 je konverze 2,5-diketo-D-glukonové kyseliny nebo- její soli prakticky úplně ukončena během zhruba 36 až 72 hodin, v závislosti na počáteční koncentraci 2,5-diketo-D-glukonové kyseliny, na teplotě fermentace a na jiných podmínkách, přičemž se získá 2-keto-L-gulonová kyselina ve výtěžku cca 30 %, vztaženo na výchozí 2,5-diketo-D-glukonovou kyselinu. Postupfermentační reakce je možno sledovat Stanovováním koncentrace 2,5-diketo-D-glukonové kyseliny zbývající v reakčním prostředí a koncentrace vznikající 2-keto-L-gulonové kyseliny, a to za použití známých analytických metod, včetně papírové chromatografie, chro-matografie na tenké vrstvě a vysokotlaké kapalinové chromatografie. Skutečnost, že produktem je 2-keto-L-guloniOvá kyselina, je potom možno potvrdit izolací a charakterizací za použití běžných metod. V daném případě je možno poukázat například -na J. C. S. Chem. Comm. 1979, 740.

2-keto-L-gulonovou kyselinu nebo její sůl, vyrobenou shora popsanou fermentací, je možno izolovat -a vyčistit známým způsobem. Tak -například je možno fermentační půdu zfiltrovat a Z-keto-L-gulonovou kyselinu nebo -její sodnou nebo vápenatou sůl vysrážet přidáním nerozpouštědla, jako nižšího- alkanolu, zejména methanolu nebo ethanolu. Je možno- použít i další izolační metody, jako odstranění rozpouštědla, například lyofilizací.

Pokud se 2-keto-L-gulon:ová kyselina izoluje ve formě -soli, je možno -odpovídající volnou kyselinu získat přidáním minerální kyseliny, například kyseliny sírové nebo· kyseliny chlorovodíkové, k roztoku soli, nebo použitím kaítexu. Pokud 'se 2-ketio-L-gulonová kyselina izoluje jako volná kyselina, je z ní možno -obvyklým způsobem připravit odpovídající -soli, například reakcí s příslušným hydroxidem nebo uhličitanem al kalického kovu nebo s uhličitanem kovu alkalické zeminy.

Vynález ilustrují dále příklady provedení, jimiž se však rozsah vynálezu v žádném směru neomezuje.

Příklad 1

Připraví se očkovací prostředí o pH 7,0:

sorbitol 3 g/litr kvasnicový extrakt 2 g/litr pepton 2 g/litr dihydrogenfosforečnan draselný 1 g/litr heptahydrát síranu hořečnatého 0,2 g/litr

Do baňky o objemu 300 ml se předloží

100 ml tohoto očkovacího prostředí, které se inokuluje buňkami ·Citrobacter freundii ATCC č. 6750 ze šikmého živného agaru (1 m'l z 10 ml sterilní vodné suspenze). Buňky se kultivují 24 hodiny při teplotě 28 °C, přičemž baňka je umístěna na rotační třepačce.

100 ml fermentačního ' prostředí:

cerelóza manohydrogenfosforečnan amonýý dihydrogenfiosforečnan dr.aselný heptahydrát · síranu hořečnatého· řepná · melasa 2 g/litr glycin .0,2 g/litr o pH 6,7 se vnese do baňky o- objemu 300 ml, inPkuluje ⁽se 5 % . (objem/objem) dvacetičtyřhodinové očkovací kultury popsané výše a 22 hodiny se třepe na rotační třepačce. Po této. době má . prostředí hodnotu pH cca 5. Ke kultuře Citrobacter freundii se- potom přidá 15 ml fermentační . půdy obsahující - 15 - a'ž 20 % (hmotnost/objem) sodné soli 2,5-di'keto-D-glukonátu, připravené padesátiho.díniovou fermentací kmene Acetobacter . cerinus IFO 3263 při teplotě 28 °C v prostředí s obsahem glukózy, a hodnota pH· se přídavkem hydroxidu sodného, upraví na 6,5. Fermentace se potom provádí při teplotě 28 °C, přičemž . hodnota pH se vždy po. 24 hodinách . znovu upraví na 6,5. Po 52 g/litr g/litr g/litr

0,5 g/litr hodinách je 2,5-diketoglukonát prakticky úplně spotřebován, přičemž se získá sodná sůl 2-keto-L-gulonové kyseliny ve výtěžku cca 30 %, vztaženo na výchozí 2,5-diketo-D-glukonát.

Příklad 2

Analogickým postupem jako v příkladu 1 se provede série pokusů, v nichž se namísto kmene ATCC č. 6750 používají kmeny Citrobacter freundii ATCC č. 8090, 8454, 10 787, 11 102, 11 606, 11 811 a 14 135, a Citrobacter diversus ATCC č. 27 026, 27 027, 27 028. a 27 156. Ve všech těchto případech dochází ke vzniku 2-keto-L-gulonové kyseliny.

Příklad 3

Očkovací prostředí popsané v příkladu 1 se inokuluje buňkami Citrobacter freundii ATCC č. 6750 (1 ml z 10 ml sterilní vodné suspenze) a buňky se 20 hodin kultivují při teplotě 28 °C.

1800 ml fermentačního. prostředí popsaného v příkladu 1 se vnese do kotlíku o objemu 4 litry, .opatřeného míchadlem a inokuluje se 5 % (objem/objem) rvacetihoUinové očkovací kultury, načež se 8 hodin kultivuje při teplotě 28 °C za míchání vrtulovým míchadlem o stoupání vrtule 0° při otáčkách 1750/min, a za provzdušno-vání rychlostí 1 objem/objem/min. Po· osmihodinové kultivaci se přidá 200 ml fermentační půdy obsahující 15 až 20 . % . (hmotnost/objem) sodné soli 2,5-diketo-D-glukonové kyseliny, jak je . popsána v příkladu 1. Přidáním hydroxidu sodného se pH upraví na hodnotu 6,5 a rychlost provzdušňování se sníží na 0,3 objemu/objem/min. . Ve fermentaci se dále pokračuje při teplotě 28 °C, přičemž se vždy po 24 . hodinách hodnota pH znovu upraví na 6,5. Po 48 hodinách je 2,5-diketo-D-glukonát prakticky úplně spotřebován, přičemž se získá sodná sůl 2-keto-L-gulonové kyseliny ve výtěžku cca 25 procent, vztaženo na výchozí 2,5-diketo-D-glukonát.

Claims (4)

1. Způsob . výroby 2-keto-L-gulonové kyseliny nebo její soli kultivací mikroorganismu produkujícího 2-keto-L-gulonoviou kyselinu ve vodném živném prostředí v přítomnosti

2,5-diketo-D-glukonové kyseliny nebo její soli, vyznačující se tím, že se použije mikroorganismu rodu . Citrobacter.

2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že . se . jako mikroorganismu použije

VYNÁLEZU kmene Citrobacter freundii nebo Citrobacter diversus.

3. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že se jako mikroorganismu použije kmene Citrobacter freundii ATCC č. 6750.

4. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že se jako mikroorganismus použije kmene Citrobacter freundii ATCC č. 10 787.