JPS5926274B2 - 発酵法によるコエンチ−ムq↓1↓0の製造法 - Google Patents

発酵法によるコエンチ−ムq↓1↓0の製造法

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JPS5926274B2
JPS5926274B2 JP53134603A JP13460378A JPS5926274B2 JP S5926274 B2 JPS5926274 B2 JP S5926274B2 JP 53134603 A JP53134603 A JP 53134603A JP 13460378 A JP13460378 A JP 13460378A JP S5926274 B2 JPS5926274 B2 JP S5926274B2
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JP
Japan
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coenzyme
culture
producing
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fermentation
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JP53134603A
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JPS5561797A (en
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和美 荒木
肇 好田
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KH Neochem Co Ltd
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Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、発酵法によるコエンチームQio(以下Co
Q1oと略す)の製造法に関するものであり、更に詳し
くは、ロドシュウドモナス属に属するC o Ql g
生産能を有する微生物のカロチノイド色素生成能欠失あ
るいは低下変異株を栄養培地に培養し、培養物中にCo
Qloを生成蓄積せしめ、該培養物から、CoQtoを
採取することを特徴とするC o Qz oの製造法に
関する。
CoQtoは、広く生物界に分布し、電子伝達系におい
て重要な機能を持つことが知られているが、最近、本物
質が、心不全症、筋ジストロフィー症その他の疾病に対
し、顕著な薬理効果を有することが明らかとなった。
従来、微生物を用いる発酵法によるCoQloの製造法
としては、各種の酵母類を用いる発酵法(特公昭48−
8836号公報、同48−25517号公報、同51−
19034号公報、特開昭52−105288号公報)
あるいは、ロドシュウドモナス〔特公昭47−7954
号公報、同48−21519号公報、Advances
in Lip −1dResearch、6 、10
8(1968)、 Bioc −hem、J、96,6
88(1965)]アルカリゲネス(特公昭36−14
293号公報、特開昭52−44290号公報、同52
−47990号公報、プロテウス(特開昭36−142
93号公報)から各種細菌類を用いる方法が知られてい
る。
しかしながら、これらの方法においてはいずれもCo
Q 1゜生成量が低くこれらの方法はまだ満足すべきも
のではない。
本発明者らは、発酵法によるcOQtoOさらにすぐれ
た製造法について種々検討した経果、ロドシュウドモナ
ス属に属し、CoQ1o生産能を有する微生物のカロチ
ノイド色素生成能欠失あるいは低下変異株を用いてCo
Q、。
を発酵生産するとその親株を用いて発酵生産した場合に
比べて高純度かつ高収率でCoQloが得られることを
見出し本発明を完成した。
以下に本発明の詳細な説明する。
本発明に使用する微生物としては、ロドシュウドモナス
属に属し、CoQ1o生産能を有する微生物のカロチノ
イド色素生成能欠失あるいは低下変異株であれはいずれ
の菌株でもよい。
好適な菌株の1例としてはロドシュウドモナス・スフェ
ロイデス(Rhodopseudomonas 5ph
eroid −es)KY8590(微工研菌寄第46
74号)がアケラれる。
ロドシュウドモナス・スフェロイデスの菌学的性質につ
いては、Rergey’ S Manualof De
terminatine Bacteriology第
8巻33頁に記載がある。
本発明において使用するカロチノイド色素生成能欠失あ
るいは低下変異株の誘導は、通常の変異処理により行わ
れるが、その具体的な方法の一例を次に示す。
イースト・ブイヨン・スラント培地(イーストエキス0
.5 L?/dl、肉エキス1′?/d&ペプトン1
? /d/!、NaC10,5? /d12.寒天2
?/dl、 pH7,2)上で、30℃、24〜48時
間生育させたロドシュウドモナス属に属しCoQ1o生
産能を有する微生物(親株)の菌体を、N−メチル−N
′−ニトロ−N−ニド田ノグアニジン27ng/rnl
ヲ含む0.05M1−リス−マレート緩衝液(pH6,
0)中に、約107〜109菌体/7になるように懸濁
し、室温に、20分間放置する。
その後、3.00Orpm で15分間遠心分離を行い
、同で緩衝液に再び懸濁する。
その懸濁液17を栄養培地(グルコース21/dl、ペ
プトン1グ/dl、イーストエキス1グ/d11NaC
t0.5 /dl 、 pH7,2) 10rrllに
植菌し30℃で一夜培養集菌し、上記緩衝液で洗浄後、
同一緩衝液に懸濁後、同一緩衝液にて適宜希釈して、約
103〜104菌体/7になるよう懸濁する。
上記懸濁液0.1−を完全培地寒天平板(グルコース0
.5グ/dl 、イーストエキス1f/d1.ペプトン
1 t /dl 、 NaCtO,5? /dl 、寒
天2 f /dl 、 pH7,2)上に塗布し、3〜
4日間、30℃で培養後出現した集落のうち、集落の色
が白色、黄色というように明らかに親株と比べて赤色の
色素を生成しないものまたは薄いものをカロチノイド色
素中生能欠失あるいは低下変異株として選択した。
本発明に使用する微生物の培養培地としては、炭素源、
窒素源、無機物、その他栄養物を程よく含有する培地な
らば、合成培地、天然培地のいずれもが使用できる。
培地に使用する炭素源は、使用菌が利用可能なものであ
れば、いずれの種類を用いてもよい。
すなわち、グルコース、フラクトース、シュークローズ
、廃糖蜜、でんぷん、でんぷん加水分解物などの炭水化
物、グリセリン、ソルビトールなどの糖アルコーノーア
スパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アラニン、グリ
シンなどのアミノ酸類、乳酸、ピルビン酸、酢酸、リン
ゴ酸、ギ酸、コハク酸、フマール酸、クエン酸、脂肪酸
などの有機酸、n−パラフィンなどの炭化水素、メタノ
ール。
エタノール、プロパツール、ブタノールなどのアルコー
ル類あるいは、炭酸ガスを単独であるいは組み合せて使
用できる。
使用菌が栄養要求性を示す場合には、その要求性物質が
培地中に添加される。
また、培地あるいは、培養液中に各種の物質、例えば、
アミノ酸類。
該酸関連物質、ビタミン類、有機酸類、脂肪酸類。
アルコール類、ステロール類、その他CoQ1o生合成
前駆物質およびその関連物質を培地に添加することによ
りCoQ1o生成量が増加する場合がある。
培養は振盪培養、通気撹拌培養などの好気的条件下でお
こなわれる。
培養中、培養液のpHは5〜9程度が好適である。
中和剤としては、アンモニア水、水酸化ナトIJウム、
水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸マグネシウ
ム、水酸化カリウム、尿素らが用いられる。
培養期間は通常3〜・7日間で、培養液中および菌体中
の両方にCoQl。
が蓄積するが、大部分は菌体中に蓄静する。
培養物からのCoQloの単離は常法により溶媒抽出そ
の他の操作によっておこなうことができる。
以下に実施例を示す。
実施例 1 グルコース2グ/dl 、ペプトンIL?/dl、酵母
エキ7.1f/di、食塩0.5 f /di(D組成
よりなるp)l 7.2の種培地300−を2を容三角
フラスコに入れて殺菌する。
これに、ロドシュウドモナス・スフェロイデスKY85
90(微工研閑寄第4674号)(カロチノイド色素生
成能欠失変異株)を接種し、30℃、24時間振盪培養
する。
該培養液300rnlを下記の組成の発酵培地3tを含
む5を容ジャー・ファーメンタ−に接種し、600fp
Illの回転数、1分間当り3tの通気、温度30℃の
培養条件下で96時間通気撹拌培養液1を当り51.5
TIgのCo Qt oが生成し、赤色のカロチンイド
色素の併産はみとめられず、僅かに緑色の色の併産がみ
とめられる。
なお、培養にあたっては、24時間目と48時間目に廃
糖蜜をそれぞれ577di (糖濃度換算)フィードす
る。
又同じ条件で、ロドシュウドモナス・スフェロイデスの
野生株KY4113(微工研菌寄第4675号)を培養
した時のCoQloの生産量は、29.7TIg/Lで
、同時に、多数の赤色(カロチノイド)および緑色色素
(バクテリアクロロフィル)の副生がみとめられる。
発酵培地の組成:廃糖蜜5g/dl(糖濃度換算) 、
硫酸アンモニウム0.5 g/dl、リン酸−カリウム
0.05g/dl、リン酸二カリウム005グ/dl
、硫酸マグネシウム・7水塩0.025? /dl 、
イーストエキス1. ?/dl 、炭酸カルシウム2?
/dl、(pHは殺菌前にアンモニア水で7.2に調整
する。
)ついで培養液2tを遠心分離し、乾燥重量として、3
4グに相当する湿菌体を得る。
これを200−の水に懸濁し、メタノール40(7、水
酸化ナトリウム80グ、ピロガロール15グを加え85
℃で45分間還流ケン化後放冷し、1tずつのn−ヘキ
サンを加え2回抽出操作を行う。
n−ヘキサン層を集めてこれを無水芒硝を加えて脱水後
減圧下で濃縮し残渣を407neのアセトンに溶解して
、不溶物をP別除去した後、再び濃縮し、残渣を10−
のアセトンに溶解後、シリカゲルカラムラムに流しベン
ゼ゛ンにて溶出する。
COQI Oを含む画分を集めて濃縮し、残渣を5ml
のエタノールに溶解後冷却することにより、黄色のCo
Ql。
の粗結晶5377!@を得る。
本市から更にエタノールで再結して得た結晶の逆相薄層
クロマトグラフィーのRf値、高速液体クロマトグラフ
ィーのリテンションタイム、融点。
NMRスペクトル、元素分析値、赤外吸収スペクトル、
紫外部吸収スペクトル曲線が、C0Q1oの標品のそれ
らと対応する。
また、ロドシュウドモナス・スフェロイデスの野生株K
Y4113(微工研菌寄第4675号)の培養液を前記
と同様の方法で処理しても、赤色のカロチノイド色素L
Co Ql Oの完全な分離はできず、CoQloの
純粋な結晶は得られない。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1 ロドシュウドモナス属に属し、コエンチームQ1o
    生産能を有する微生物のカロチノイド色素生成能欠失あ
    るいは低下変異株を栄養培地に培養し、培養物中にコエ
    ンチームQ1oを生成蓄積せしめ、該培養物より、コエ
    ンチームQIOを採取することを特徴とする発酵法によ
    るコエンチームQ1oの製造法。
JP53134603A 1978-11-02 1978-11-02 発酵法によるコエンチ−ムq↓1↓0の製造法 Expired JPS5926274B2 (ja)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6147687A (ja) * 1984-08-15 1986-03-08 神鋼電機株式会社 プリント配線板の実装方法

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JPS6147687A (ja) * 1984-08-15 1986-03-08 神鋼電機株式会社 プリント配線板の実装方法

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