JPS60118186A - ２・５−ジケト−ｄ−グルコン酸リダクタ−ゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、２・ｊ−ジケト−Ｄ−グルコン酸リダクター
ゼ（、ｌ　−ｊ；　−ｄｉｋｅｔｏ　−Ｄ　−ｇｌｕｅ
ｏｎｉｃ　ａｃｉｔｌｒｅｄｕｃｔａｓｅ　、以後、２
５ＤＫＧ−Ｒａｓｅと略す）に関する。

すなわち本酵素は、２・ｊ−ジケト−Ｄ−グルコン酸（
以後２．５−ＤＫＧと略す）を還元型ニコチンアミド・
アデニン・ジヌクレオチド・リン酸（以後ＮＡＤＰＨと
略す）存在下に還元し、ビタミンＣの前駆物質である２
−ケトーＬ−グロン酸（２−ｋｅｔｏ−Ｌ−ｇｕｌｏｎ
ｉｃ　ａｃｉｄ、以後２Ｋ　Ｌ　Ｇと略す）を生成する
作用を有する。

本発明者らは、多くの、２ＫＬＧ生産１２１株の２．３
′ＤＫＧを還元する酵素を研究してきたところ、コリネ
バクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｃｒｉｕｍ）に属
する２ＫＬＧ生産菌株より得た２　！；　Ｄ　Ｋ　Ｇ　
−Ｒａ５ｃがＮＡＤＰＨ存在下に （ｉ）２５ＤＫＧを２ＫＬＧに還元しかつ。

（ｉ）ｊ−ケト−ローフラクトース（以後ｊ−ＫＦと略
す）をＬ−ツルポーズ（Ｌ　−５ｏｒｂｏｓｅ）に還元
する 性質を有することを見い出した。また、この今まで知ら
れていない作用を有する（この両件用を併せ有する）新
規酵素を単離精製することに成功し。

本発明を完成した。

すなわち本発明の目的は２次の物理化学的性質を有する
２３ＤＫＧ−Ｒａｓｅを提供することにある。

（イ）酵素作用： ＮＡＤＰＨを補酵素として。

（ｉ）２５ＤＫＧ又はその塩を２ＫＬＧ又はその塩に還
元する。

（ｉｉ）５ＫＦをＬ−ツルポーズに還元する。

（ロ）基質特異性： ２！；ＤＫＧおよびｊＫＦに対し特異性を示す。

（但し、この２基質化共通の、５位のケト基の保有、と
いう特徴を共にするｊ−ケト−ローグルコン酸を還元せ
ず、また末端アルコール基に隣接するケト基を有するＤ
−フラクトースやＬ−ツルポーズなどのケト−スや、２
位がケト基である。２ＫＬＧやニーケト−Ｄ−グルコン
酸に対しても還元作用を示さない）（ハ）至適ｐＨ：　
ｐＴ（乙〜７ に）ｐＨ安定性：　ｐＩ（ｊ〜７ （ホ）分子量：　２９０００±２０θθ（へ）等電点：
　ｐＨＩＡｇ±０３ 本酵素は、コリネバクテリウム属に属する２ＫＬＧ生産
菌株の菌体を破砕し、その破砕液よりマ（１コリネバク
テリウム・スピーシーズＮ１１．２０Ａ−７７（Ｃｏｒ
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ０階、ｌθＡ−７７、
Ａ’ｌ’ＣＣ３１０９θ、ＦＥＲＭ−Ｐ２７７θ）おＪ
二びこの菌体より造成した変異株（たとえばｊ〜ケ１−
−Ｄ−グルコン酸代謝欠損変異株、ＦＥＲＭ−ｎｐｌｏ
ｚ）が挙げられるが、コリネバクテリウム、・スピーシ
ーズｍＴ／３（ＡＴＣＣ３／θざワ）やコリネバクテリ
ウム・スピーシーズＮＩＩＫ／θ乙（ＡＴＣＣ３１０１
＃）およびこれらの菌株から造成される変異株も同様に
酵素源として用いられる。（２０Ａ−７７株、Ｔ＼／３
株およびＫｌｏＡ株の菌学的性状は、特公昭！乙−／！
ざ７７号公報に、またＦＥＲＭ−ＢＰ／θを株の親株λ
θＡ−７７株からの誘導変異法は特開昭ｊＫ−／乙２２
９乙号公報に詳述されている。） これらの、２ＫＬＧ生産菌株に本発明の２．５−ＤＫＧ
−Ｒａｓｅ　を生産させるための生育培地に特別な制限
はない。たとえば／〜３チのＤ−グルコースや蔗糖等の
糖やグルコン酸、グリセリン等の有機酸を炭素源として
用い、ｏｓ−ｓｓのポリペプトンやコーン・ステイープ
・リカーを窒素源として加え、リン酸塩、マグネシウム
塩その他生前に必要なビタミン類や微量の金属塩を加え
た培地を用いる。この培地に前記の、２ＫＬＧ生産菌を
植菌し。

２ｊ〜３５℃で７５〜３θ時間培養し生育させる。

生育後の培養液から菌体内酵素を抽出するための方法と
しては、たとえば次のようなものが挙げられる。すなわ
ち、先づ培養液より遠心分離等の方法で菌体を集め、水
又は生理食塩水、あるいは適当なｐＩ（を有する緩衝液
で洗菌する。洗菌された菌体を適当なｐＩ（を有する緩
衝液に懸濁し、超音波。

フレンチプレスあるいは酵素（リゾチーノ・）等の処理
により菌体を破砕して菌体内酵素を・含む菌体の破砕液
とする。この破砕液から、遠心分離等により未破砕菌体
や破砕菌体残渣を取り除き、」二液液（粗酵素液）を得
る。この粗酵素液に硫酸アンモニウムを加えて塩析する
。（３０〜７θヂ飽ｆｌ’１両分）。

この塩析物を酵素が失活しない適当な緩衝液に溶解し、
透析処理を施し硫酸アンモニウムをのぞいた後、この酵
素液をイオン交換クロマ１−グラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー等の精製処理を行うことにより単
一に精製された２３■）Ｋ　Ｇ　−Ｒａ５ｅを得る。

この精製された２ｊＤＫＧ−Ｒａｓａの物理化学的な性
状を詳述すれば次のとおりである。

（１）　作用： ２、ｊＤＫＧ＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋→、２ＫＬＧ−１−Ｎ
ＡＤＴ””３ＫＦ十ＮＡＤＰＨ十Ｈ＋→Ｌ−ツルポーズ
十Ｎ　Ａ　Ｄ　７）−’−上記反応における水素供与体
としては、　ＮＡＤＰＨが用いられる。ＮＡＤＨ（還元
型ニコチンアミド、ジヌクレオチド）を水素供与体とし
て用いた場合、その反応速度は、ＮＡＤＰＨを用いた場
合の反応速度の２５θ分の７以下である。

（２）基質特異性： ２３ＤＫＧおよび５ＫＦに特異性を示す。

この２基質と類似（５位にケト基を有する）のｊ−’７
ｌ−Ｄ−グルコン酸は還元されず、末端アルコールに隣
接するケト基を有するＤ−フラクトースやＬ−ソルボー
ス等などのケトースや２位がケト基である。２ＫＬＧや
ニーケト−Ｄ−グルコン酸に対しても還元作用を示さな
い。

ＮＡＤＰあるいは、ＮＡＤ存在下に、２ＫＬＧあるいは
Ｌ−ツルポーズを加えても２５ＤＫＧあるいは３ＫＦの
生成は、全くあるいはほとんど認められない。

（３）至適ｐＨ：　ｐＨ６〜７ （４）　ｐＨ安定性：ｐＨ３；〜７ （ｐｉ〜ｊはＯＨＭジメチルグルタル酸緩衝液ｐＨ乙〜
７は、０／Ｍグツド（ＰＴＰＥＳ）緩衝汀ｋ。

ｐＦ５５’−９は、０／Ｍトリス・塩酸緩衝液中にて。

２．８”０．３０分処理し残存活性を測定）。ｐＨ３〜
７では７υ係以上残存活性が認められたがｐＴＩグ以下
１ｇ以上では３０％以下の残存活性しか認められなかっ
た。

（５）酵素活性の測定法 θ／ｍＭＮＡＤＰＨおよび３．３　ｍＭのＣａ−２３Ｄ
ＫＧを含むθ／Ｍ）！Ｊス緩衝液（ｐＴ（７）に酵素液
を加え３υ°Ｃで反応させ、ＮＡＤＰＨの酸化を３’ｌ
θｎｍの吸光値の減少から測定する。酵素活性の／　ｕ
ｎｉｔは、７分間にＮ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈ／　７ｚｍｏｌ
ｃを酸化させる酵素活性と定義する。

（６）作用温度の範囲：２３−４３′Ｃ（７）ｐＨ，温
度による失活の条件： ｐＨり以下およびｐＨに以上で、２ざ°Ｃ，２時間放置
すると９６チ以上失活する。

（８）阻害、活性化および安定化： 蓚酸塩により阻害され、グリセロアルデヒドによりわず
かに阻害される。Ｍｎ　お、］：びＭＨを加えても顕著
には活性化されない。高濃度のグリセリン（３υ〜ｊθ
％）やシュークロース（７Ｍ）により安定化される。

（９）分子量：２？θθθ±２０００ （Ｓ　Ｄ　Ｓポリアクリル−アミドゲル電気泳動法およ
びゲル濾過法による測定） ００　等電点：ｐＨ４４ｇ±０３ （等電点電気泳動法により測定） ０υ　酵素の読値：ユ２±ｉ　ｊ；　ｍＭ　（基質、２
５−ＤＫＧ。

０　／　Ｍ　）　ＩＪ　ス緩衝液（Ｉｌｌｏ）、温度３
ｏ°ｃ’）本発明の２５ＤＫＧ−Ｒａｓｅは上記酵素作
用を発揮する用途に使用可能である。すなわち、補酵素
ＮＡＤＰＨの存在下に２．ｊＤＫＧまたはｊ−ケができ
る。、２５ＤＫＧの場合を例にとると９反応は通常２３
−’７３；℃、ｐＨ６〜７．で行う。反応に際しての基
質２．．５−ＤＫＧのモル濃度は、水素供与体であるＮ
ＡＤＰＨのモル濃度とほぼ等しく、酵素反応の常識によ
って定められるが、２θ〜Ｉ。

ｍＭ程度が適当とされる。また酵素濃度はθ３−〜孜θ
ｕｎｉｔ／が／程度が適当である。また反応に際して、
酵素を適当な担体に固定化して用いることもできる。こ
れらの固定化は、酵素に関して知られている一般的方法
が使用可能である。たとえば。

官能基を有する樹脂の膜１粒などに直接あるいは二官能
基を有する橋状体たとえばグルクルアルデヒドなどを介
して結合させる。

前記酵素反応の時間はとくに制限する必要がないが、３
υ°Ｃにおける反応の場合６０〜／、２υ分間で基質中
の２ＪＤＫＧの９θチ以」二が、２ＫＬＧに還元されう
る。以下１本発明を実施例によりさらに詳細に説明する
。

実施例／ （１）菌の培養 （ｉ）種培地： Ｄ−グルコース　ｌθ　チ イーストーエキストラクト（Ｄｉｆｃｏ）　θ１２バク
ト・ペプトン（Ｄｉｆ’ｃｏ）　θｊ　チＮａＮＯ３θ
／　チ ＫＩＥ（、ＰＯ，θ／　チ Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ，２０００２’Ｉｙ ｐｌθ 上記組成の培地乙θゴをｓｏθゴ容のフラスコに入れ／
２０’Ｃ，／３分間蒸気滅菌した。

（ｉ）　生育用培地： Ｄ−グルコース　λθ　チ コーン・ステイープ・リカー　３θ　チイースト・エキ
ストラクト　ｏ／　％ ＮａＮＯ３Ｃ３チ 幻ちＰＯｌｌ　θθ乙チ Ｈ７２ 上記組成の培地２θｌを３θノ容ジヤー・ファーメンタ
−に入れ、消泡剤（ポリプロピレングリコールｐ−２θ
θθ）夕θ−を加えて、／２θｏｃ。

２０分間滅菌した。

（ｍ）　培養方法 コリネバクテリウム・スピーシーズｌｌ＆Ｌ２θＡ　−
７７の変異株（ＦＥＲＭ−ＢＰｌｏｆ）を１０本の種培
地に／白金耳ずつ植菌し、２．♂’Ｃ，，／ｌｒ時間、
ロータリー振盪機（振幅７／ＭＪＢ、２７θｒ　１１ｍ
）で培養した。７０本の種培養液を生育用培地に植菌し
９通気量θ５ｖｖｍ、攪拌ｐ　Ｑ　Ｑ　ｒ　ｐ　ｍ　。

２１０Ｃにて２２時間培養した。（ＯＤ＝／？）（２）
酵素の抽出 （１）で得た培養液から、遠心分離（シャープレス遠心
機、１ｏｏｏｏａ　、ｉｏ分）によって１２１を隼め、
θ／Ｍ）’Ｊス緩衝液（以後トリス緩衝液は′ｒＢと略
す。又特記しないかぎりｐＴ＋はＺθである）で洗菌し
た。この洗菌体をＯＤ＝／３θになる。）：うにθ／Ｍ
ＴＢに懸濁し超音波Ｃ１ＡＱｖｍ日・×７分／ｌ０ｔｓ
ｌ＞にて菌を破砕した。菌の破砕液から遠心分ｍ（／！
；０ＯＯＧ　、３θ分）により未破砕の菌体および菌体
残渣をとりのぞき約７７！の」−澄液を得た。（蛋白質
−７θ３り／渭／　、　２３゛Ｉ）　ＫＧ−Ｒａ５ｅ　
−θ乙３　ｕｎｉｔ　／ｍｅ　）。

（３）酵素の精製（以下の操作はすべてグ°Ｃ以下で行
った） （ｉ）硫酸アンモニウム（硫安）分画 上記（２）で得た上澄液に３０％飽和になるように硫安
を加え塩析物を遠心分離（１０θ００Ｇ、１０分）によ
り取りのぞき、上澄液にさらに７０チ飽和になるように
硫安を加えた。約１時間氷冷した後遠心分離（１０θＯ
ＯＧ　、／θ分）にて析出した蛋白質を集めた。この蛋
白質をコθＯｗｌのθ／ＭＴＢに溶解しθθ、２ＭＴＢ
に対し／夜透析した。

６）　イオン交換クロマトグラフィー 上記（ｉ）で得た透析液Ｃ２３０ｔｘｔ、蛋白質／３．
６１１９／＋ｌ）をＤＥＡＥ−セファロースＣＩ、−乙
Ｂ（ファーマシアファインケミカルス製）カラムに充填
し下記の条件でクロマトグラフィーを行った。

カラム：／、乙×３θα１．平衡化液：θθ、２ＭＴＢ
。

溶出液−θθ２ＭＴＢ　Ｃ２ｏｏゴ）−θ１５ＭＮａＣ
ｌ／　ＱＱ２ＭＴＢ　（３θ０ｍ１）−〇２３ＭＮａＣ
ｌ／θθ、２ＭＴＢ（，２θθｍｌ　）　。

溶出液をｊｒｌずつのフラクションにとり分け。

各フラクションの酵素活性を後記（５）　−（ｉｉ）で
記載する方法でＣａ−，２ｊＤＫＧ及び、５−ＫＦを基
質として測定した。この結果、Ｃ２、！；　Ｍ　ＮａＣ
１／θθ２ＭＴＢで溶出された約１０ｍ１の溶出液に９
両基質に対する酵素活性が認められた。この溶出液に７
０チ飽和になるように硫安を加え蛋白質を塩析し。

塩析物を３０ｔｒｒｌのθ／Ｍ’ｌ’Ｂに溶解し、００
２ＭＴＢに対し弘”Ｃ、／夜透析した。

に）　アフイニテイ・クロマトグラフィー上記（３）−
（ｌｉ）で得られた透析液を、０θ、２ＭＴＴ＋であら
かじめ平衡化されたアミコン・マトリックスゲルレツド
Ａ（アミコン　ファーイースト　リミテッド製）カラム
に充填し９次の条件でクロマトグラフィーを行った。カ
ラム：ｌ乙×／９α。

洗浄液：θｔｌ　Ｍ　Ｎ＋ａＣ１／θθ２ＭＴＢ（／７
θθに／）、溶出液：Ｃ３−Ｍ　Ｎａ（１’Ｊ　／θθ
、！ＭＴＢ（りｊθｔｔｔｌ　）　−０７ＭＮａＣ］　
７’θ０２ＭＴＢ　（／ｊＯｄ）−／ＭＮａＣＪ／　（
２Ｃ２ＭＴＢ　（３００ｍ１）。

（３）−（ｍ”）同様、溶出された各フラクション（各
ｊゴ）の酵素活性を測定した結果０７Ｍ−／ＭＮａＣＩ
１００２ＭＴＢで溶出された７とフラクションに２５Ｄ
ＫＧおよび、５−ＫＦの両基質に対する酵素活性を認め
た。

約９０ｍ１の溶出液にθ０２ＭＴ’Ｒ，１２タ河ｌを加
えＮａＣＩ濃度を低下させ、再度アミコン　マトリック
スゲル　レッドＡ　カラム（ｌりＸ　／　３　備）に充
填し０２ＭＮａＣ］　／（２ｏ、２ＭＴＢ　／２０ｔｘ
ｌ”’Ｑ洗浄したのちＯｊｍＭＮＡＤＰＨと０２ＭＮａ
Ｃ］を含む０θ、２ＭＴＢ／Ｉθゴで溶出した。各ｊＭ
ｌずつ溶出液を取り分は各フラクションの酵素活性を上
記同様に測定した。この結果θ５ｍＭＮＡＤＰＨおよび
０２ＭＮａＣ］　を含むθθ、２ＭＴＢでの７０　ｍｌ
溶出区分を中心に高い酵素活性を有するフラクション（
約３５　ｍｌ　）が得られた。

（ｉｖ）酵素の濃縮とＮＡＤＰＨの除去上記０で得られ
た溶出液に３θチ飽和になるように硫安を加え、あらか
じめ３θチ飽和硫安を含ｂ００２ＭＴＢで平衡化しであ
るフェニルセファロースｃｒ、−４Ｂ（ファーマシア・
ファインケミカルズ製）のカラム（ｏ？ｘ３（１７＋１
）に充填した。

このカラムを３θチ飽和硫安を含むθθ、２Ｍ’ｌ’Ｂ
で洗浄し３グθｎｍの吸光値を測定して完全にＮＡＤＰ
Ｈを洗い除いたのち、０θ、２ＭＴＢで酵素を溶出しＩ
ｘｌずつ分画した。このフラクションの酵素活性を測定
したところ、１１ｔフラクシヨンに高い酵素活性が認め
られた。この１１本のフラクションの液を集め精製酵素
液とし、以後の測定に用いた。この溶液は、夕１７　ｕ
ｎｉｔｓ　／Ｈ１の２ｊ；　Ｄ　Ｋ　Ｇ　−Ｒａｓｅ活
性を示し、かつ０！；ＩＮ！／＊ｔの蛋白質を含むもの
であった。

（４）精製酵素液の純度 上記（３）で得た精製酵素液の２〜ｓｐｐ　を５ＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（分離ゲル二／θチア
クリルアミド、泳動条件：４ｔｏｍｈ、ｉＨｒ、室温）
により分析したところ、２９θθＱ　二ｌ：２０θθの
分子量に相当する位置に１ｌｉ−なバンドとして泳動し
た。

さらにゲル濾過（セファデックスＣ−／θθ）により分
析したところ分子量２？θθＯ±２０θθに相当する溶
出区分に酵素活性が認められた。

この酵素液５ｔｔｔを等電点電気泳動 （ゲル：ポリアクリルアミド；泳動条件（イ）　：　ｐ
ｌＴ１イ・ンターバル２．夕へ・ｊ；陽電極液＝０／Ｍ
Ｈ，Ｓｏ、　、陰電極液θ／　Ｍ　ＮａＱＪ（、乙Ｗ、
２７θθｖｒｒ。

泳動条件（ロ）：ｐＨインターバル久θ〜６．Ｓ、陽電
極液＝００１１ＭＤＬ−グルタミン酸、陰電極液θ２Ｍ
ＮａＯＨ，２！；Ｗ　、２６θθＶＨ，温度ｌ♂〜２θ
°Ｃ） で測定したところｐＨＩＡ　ＩＩ±０２の位置に単一な
バンドとして泳動した。以上の事実よりこの精製酵素液
は、、２５ＤＫＧ−Ｒａｓｅのみを含む酵素液であるこ
とを確認した。

（５）酵素の物理化学的性質の測定 （ｉ）酵素反応 ２！；ｐｍｏｌｅｓ　（７）基質（Ｃａ−２３ＤＫＧ又
はｊＫＦ）および１３　μｍｏｌｅｓのＮＡＤＰＨを含
むＯ／Ｍ＋−リス緩衝液（ｐＨ７）Ｊ、θ肩ｌに（３）
で得られた精製酵素液１ｏｉｔｔを加え、３０℃で６θ
分反応させた。反応後９反応液をペーパークロマトグラ
フィー（展開剤：フェノール：ギ酸：水＝７．！；　：
　＋＝２ｊ１発色剤ニアニリンー水素−フタル酸溶液）
およびガスクロマトグラフィー（カラム：ＳＥ−！コ、
キャリアーガス：ヘリウム、サンプルコトリメチルシリ
ル化誘導体）で分析した。両クロマトグラフィーによる
分析の結果より２５ＤＫＧ力）らは２ＫＬＧのみが生成
し、５ＫＦからはＬ−゛ノルボースのみが生成した。第
１表にガスクロマトグラフィーで生成物を定量分析した
結果を示す。

第　ｌ　表 、５−ＫＦ　Ｌ−ツルポーズ　７９３ｔす／篇ｔ（ｌｉ
）　基質特異性 ユベットに入れ、（３）で得られた酵素液を、ｌ〜ｊ〆
加え３０°Ｃに保温し、０７Ｍの各基質溶液をθ／Ｍｌ
加えた。３　％　Ｏｎｍの吸光値の減少を経時的に測定
し、７分当りの吸光値の減少量Ｊ：り各基質に対する反
応性を測定した。その結果を第２表に示す。

第　λ　表 ２３；−Ｒａｓｅの基質特異性 基　質　精製酵素液／ｌｔｌ当りの活性Ｃａ−２ｊＤＫ
Ｇ　３１７　ｕｎｉｔｓｊＫＦ　９ＩＩ。

！−ケトーグルコン酸（Ｋ塩）　Ｏ Ｄ−フラクトース　θ Ｌ−ツルポーズ　θ ２−ケトーＤ−グルコン酸（Ｃａ塩）　０Ｎａ−，２Ｋ
ＬＧ　θ 上表より明らかなように本発明の酵素は、２！；ＤＫＧ
　、ｊ；ＫＦには高い活性を示すが、ｊ−ケトーＤ−グ
ルコン酸、Ｄ−フラクトース、Ｌ−ツルポーズ、２−ケ
ト−Ｄ−グルコン酸、２ＫＬＧに対しては還元活性を示
さないことが確認された。

０リ　補酵素（水素＼供与体）について（５）−６）の
反応系のＮＡＤＰＨをＮＡＤＨにかえて基質Ｃａ−２５
ＤＫＧおよび３ＫＦに対する２ＳＤ　Ｋ　Ｇ　−Ｒａ５
ｅの酵素活性を測定した。

その結果を第３表に示した。

第　３　表 上表に示すようにＣａ−、ｌ　ｊ；　Ｄ　Ｋ　Ｇに対し
てＮＡＤＰＨを水素供与体としたとき、精製酵素液／ｍ
ｌ当りｊｉ７ｕｎｉｔの活性を示したがＮＡＤＴＴを用
いるとＱ　Ｑ　ｌ＋ｎｉｔ以下の活性しか示さなかった
。同様に、５−ＫＦを基質とした場合、　Ｎ　Ａ　Ｄ　
Ｐ　Ｈを水素供勺体としたとき９１１．ｕｎｉｔであツ
タ活性は、ＮＡＤＴＴを用いるとＱ　２ｕｎｉ　を以下
の活性しか示さなかった。

０→　至適ｐＩ（ ２３；−ＤＫＧ−Ｒａｓｅの反応速度とｐＴＴ　）関係
を知るため（５）　−（ｉｉ）で示した反応系の緩衝液
を次の緩衝液にかえて酵素活性を測定した。

ｐ）Ｉ　ＩＡｏ〜孜θ：θ／Ｍ３．３−ジメチルグルク
ル酸緩衝液、　ｐＨ４θ〜Ｚθは０７Ｍグツド緩衝液（
ＰＩＦＥＳ：ピペラジンーＮ、Ｎ’−ビス−（２−エタ
ンスルホン酸）’）、ＰＨ７θ〜９θは０７Ｍトリス緩
衝液。

Ｃａ□、２ｊＤＫＧおよび、５ＫＦを基質としたときの
各々のｐＨでの酵素活性の測定結果を次の第を表に示す
。

第７表 酵素活性は、精製酵素液１ｔｇｌ当りの活性（ｕｎｉｔ
）を示す。

上表で明らかなようにこの酵素はｐｌＩ６〜７で最も酵
素活性が高かった。

（ｖ）作用温度 Ｃａ−２３ＤＫＧを基質とする（５）−（ｉｉ）の反応
系の温度を７５〜５０°Ｃまでかえて反応速度を測定し
た。その結果を次の第５表に示す。

第　ｓ　表 酵素活性、Ｃａ−，２夕ＤＫＧを基質とし、ｐｌｉ７で
の精製酵素液／ｄ当りの酵素活性量 上表で明らかなように１本発明酵素はｔθ℃までは温度
の上昇とともに、その酵素活性が増加するが、４ｊ”Ｃ
以上では温度の上昇とともに酵素活性が低下するもので
あることが確認された。

ｉｉ）　Ｋｍ値の測定 （５）−（ｉ）に記載した方法におけるＣａ−，２５Ｄ
ＫＧの溶液の濃度を００／Ｍ〜θ２！；Ｍまでかえ各々
の還元反応速度を測定し、　２ｊｆＤＩＣＧに対する読
値をめた。その結果読値はｌ♂±ｌｏｒｒＩＭであった
。

実施例コ （１）菌の培養 （リ　生育用培地 Ｄ−グルコース　ｌＯチ コーンＪステイープ・リカー　ｌＯチ イーストーｘキストラクト（Ｄｉｆｃｏ）　０２　％ポ
リペプトン（Ｄｉｒｃｏ）　０　！；　％ＫＩ（２ＰＯ
，θ／　チ Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ１０θθ２チ ｐＨ７θ。培地７２ｋを２０１容ジヤー・ファーメンタ
−に入れ、／２０”Ｃ，２０分滅菌した。

（ｉ）　培養 実施例／−（１）に記載した種培地、培養方法で。

コリネバクテリウム・スピーシーズＮａＫ１０乙（）、
ＴＣＣ３１０ざざ、以後に１０乙と略す）およびコリネ
バクテリウム・スピーシーズｍＴ／３（ＡＴＣＣ３１０
どワ、以後Ｔ／３と略す）を各々２木ずつ培養した。こ
の種培養液を各々（ｉ）の培地に植菌し９通気量θ３　
ｖｖｍ　、攪拌速度１１ＱＱｒｐ■ｎ。

２１°Ｃで１１時間培養した。この時の菌量はそれぞれ
次の如くであった。菌株ＮａＫ／Ｑ乙：　ｏＴ）＝／ｌ
ざ、ＮＩＩＴ／３　：　ＯＤ＝／、２．２゜（２）酵素
の抽出 菌株に１０１．およびＴ／３の培養液より実施例／−（
２）に記載した方法で再洗菌し、００２Ｍ　Ｔ　ＢでＯ
Ｄ１！；θの菌体懸濁液を調製しｔこ。この懸濁液をフ
レンチプレス（７θθにりｉｉ）にかけ、菌体を破砕し
た。破砕液は、実施例／７（２）に記載したように、遠
心分離（／ｊＯθθＧ、３０分）により未破砕菌体およ
び菌体残渣をとりのぞいｔ、＝。

その結果次の酵素活性を有する抽出液を得た。

菌株　抽出液量　蛋白質　２５ＤＫＧ−Ｒａｓｅ活性に
／θ乙　ａＯθｍｌ　／　ＯＷ／１ｔｔｌ　２．　／　
ｕｎｉｔｓ／ｇＪＴＩ３　１ＡＯＯｔｔｒｌ　１２Ｗ／
ｍｌ　２．Ｏｕｎｉｔｓ／１ｇｌ実施例／−（３）で記
載した方法により、３θチ〜７θチ硫安飽和塩析区分の
蛋白質を集め００２Ｍ’ＴＢで溶解後、θθ２ＭＴＢに
対し＆’Ｃで／夜透析した。

その結果次の酵素活性を有する酵素液を得た。

菌株酵素液量　蛋白質　２ｊＤＫＧ−Ｒａｓｅ活性に１
０乙　７’１ｔｔｒｌ　（測定せず）　７Ｑ　ｕｎｉｔ
ｓ／ｊ７ＴＩ３　ｇｇ肩１　／ｌ／ＷＩ／ｒｌ　’Ａざ
　聞ｔｔＦ７’ｚｌ（ｉｉ）　イオン交換クロマトグラ
フィー実施例／−（３）−（ｉ）の方法を用いた。その
結果次の酵素活性を有する溶出液を得た。

菌株　酵素液量　蛋白質　２ＪＤＫＧ−ＲａＳａ活性Ｋ
ＩＯ乙　’１９ｍｔ　θ乙ＯＱ／ｍｌ　２．１−　ｕｎ
ｉｔ−’Ｊ’ｓｌＴ／３　！；２ｄ　θタグクン’ｍｌ
　’ＡＩ　＋用ｉトン′震ｌ（→　アフイニテイクロマ
トグラフイー６）で得た溶出液に３０％飽和になるよう
に硫安を加え、先ず実施例／−（３）−（ｉ→に記載し
たフェニル士ファロースカラムクロマトグラフイーによ
り酵素の濃縮と脱塩を前もって行った。濃縮された酵素
液を、実施例／　−（３）−＠）に記載したアミコン・
マトリックスゲルレッドＡカラムによるアフィニティー
クロマトグラフィーを２回行うことにより精製した。そ
の結果９両菌株の、２夕ＤＫＧ−Ｒａｓｅ　ハ、　／　
回目のクロマトグラフィーでは、０７〜／ＭのＮａＣ］
濃度でのフラクションに、２回目のクロマトグラフィー
ではθ５ｍＭＮＡＤＰＩＴフラクションに溶出フラクシ
ョン液は、実施例／−（３）　−（ｉ９で記載した方法
で脱塩、ＮＡＤＰＨの除去および酵素の濃縮を行った。

その結果下記の如くの精製酵素液が得られた。

菌株　酵素液量　蛋白質　２！；ＤＫＧ−Ｒａｓｅ活性
に１０乙　約／ｌｘｌ　０２．！；Ｍｌ／ｍｌ　２３．
１　ｕｎｉｔ％’ａｇ／Ｔ／３　約２＊ｌ　Ｏ／　７　
ＥＶ／ｇｌ　／　！；、　／　ｕｎｉｔｓ／ｍｌ上記の
酵素液（２〜１０ＩＪｌ）を、実施例／　−（４）に記
載したＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動および等
電点電気泳動法により分析した結果。

いずれも単一なバンドとして泳動した。この精製酵素液
を用いて以下の酵素の性質を測定した。　。

（４）酵素の物理化学的性質 酵素の物理化学的性質の測定は、実施例／　−（４）〜
（５）に記載した方法を用いて行った。

（ｉ）分子量 ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により分析
したところ、に／θ６およびＴ／３よりＣ）等電点 等電点電気泳動法により測定した結果に１０ｔの酵素は
、　ｐ）（ｌＡｇ±０２．Ｔ／３の酵素は、声弘ｊ±０
２であった。

０　基質特異性 両酵素、！：　もＣａ−２！；ＤＫＧからＬｔ　ＣＡＬ
−２Ｔ（Ｔ、　Ｇのみが、又５ＫＦからはＬ−ツルポー
ズのみが生成した。ｊ−ケトーＤ−グルコン酸、Ｄ−フ
ラタトース、Ｌ−ツルポーズ、、２ＫＬＧ　、、：ｌ−
ケト−Ｄ−グルコン酸からは何も生成しなかった。

（ｉ→　酵素活性 に／θ乙の酵素はＣａ−２５ＤＫＧに対し、２３ｆ　ｕ
ｎｉ　ｔｓ　／Ｈｌ　（ヲ３；　ｕｎｉｔｓ　／！Ｒ９
ｐｒｏｔｏｉｎ　）　５　Ｔ（Ｆに対し３　Ｊ’：　３
　ｕｎｉｔｓ　／１１　（／　３２ｕｎｉ１．ｓ　／ｌ
ｔｇ　ｐｒｎｌ、ｃｉｎ　）であった。一方Ｔ／３の酵
素はＣａ−２ｊ；　Ｄ　Ｋ　Ｇに対し／　、５：／ｕｎ
ｉｔｓ　／ｌｓｔ　（Ｊ’９ｕｎｉｔｓ　／ｌｓｇ　ｐ
ｒｏｌ、ｒ＋ｉｎ　）　、　５ＫＦに対し３９　ｕｎｉ
ｔｓ　／Ｈｌ（２２９ｕｎｉｔｓ　／ｒｔｒｇ　ｐｒｏ
ｌ、ｃｉｎ　）であった。

（ｖ）補酵素（水素供与体） 両酵素ともＮＡＤＨを補酵素としてＣａ−，２５１）Ｋ
Ｇに対する酵素活性を測定した結果いずれもθ／　ｕｎ
ｉｔ　／Ｈ１以下の活性であった。

ｔｉ＞　至適ｐＨ Ｋ１０乙およびＴ／３からイ尋た。２５　Ｄ　Ｋ　Ｇ　
−Ｒａ８ｆｌ（７）酵素活性（基質Ｃａ−，２，ｔＤＴ
（Ｇ、反応＋７．．１度３θ℃）をｐ■り〜ワの各声で
測定した。その結果を次の第を表に示す。

第　６　表 上表から明らかなように両菌株から得られた２５ＤＫＧ
−Ｒａｓｅの至適声は、いずれも声名〜７であった。

＠）作用温度 に１０７．およびＴ／３から得た２ｊＤＫＧ−Ｒａｓｅ
の酵素活性（ｐＩｏ、基質Ｃａ−２３Ｄ　ＴＣＧ）を種
々の温度で測定した。その結果を次の第７表に示す。

第　７　表 ×　前６表の定義に準じる。

上表から明らかなように両菌株から得られた２夕Ｄ　’
Ｋ　Ｇ　−Ｒａ５ｅは、いずれも弘０°Ｃまで温度の上
昇とともに活性は増加するがｌＩ５°Ｃ以上では、温度
の上昇とともに活性は、低下することが確認された。

（ｖｉ’）　Ｋｍ値 に／ＩｔおよびＴＩ３の精製酵素液を用いて測定した両
酵素の２ｊ；ＤＫＧに対する読値は、゛各々１７±ｌθ
ｍＭ、２．乙±ｉＱｍＭであった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）次の物理化学的性質を有する２・ｊ−ジケト−Ｄ
   −グルコン酸リダクターゼ （イ）酵素作用： ＮＡＤＰＩ（を補酵素として （リス・！−ジケトーＤ−グルコン酸またはその塩を２
   −ケトーＬ−グロン酸またはその塩に還元する。 （ｉｉ）５−ケトーＤ−フラクト−スをＬ−ツルポーズ
   に還元する。 （ロ）基質特異性： ２・ｊ−ジケト−Ｄ−グルコン酸およびｊ−ケト−ロー
   フラクトースに対し特異性を示す。 （ハ）　至適ｐＨ：　ｐＨ６〜７ に）坪安定性：ｐＨ３ｉ〜７ （ホ）分子量：２９θＯｏ±２０００ （へ）等電点：１４１．≠±０３