JPH0856659A - リビトール脱水素酵素とその製造方法並びに用途 - Google Patents
リビトール脱水素酵素とその製造方法並びに用途Info
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- JPH0856659A JPH0856659A JP6218155A JP21815594A JPH0856659A JP H0856659 A JPH0856659 A JP H0856659A JP 6218155 A JP6218155 A JP 6218155A JP 21815594 A JP21815594 A JP 21815594A JP H0856659 A JPH0856659 A JP H0856659A
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- ketose
- ribitol
- ribitol dehydrogenase
- dehydrogenase
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 基質特異性の低い酵素の利用により、多種類
の希少糖質を提供する。 【構成】 新規リビトール脱水素酵素と、該酵素を産生
するエンテロバクター属に属する微生物を用いる該酵素
の製造方法及び該酵素を用いる糖アルコールとケトース
との変換方法、並びに、該酵素を用いる糖アルコール又
はケトースの製造方法を主な構成とする。
の希少糖質を提供する。 【構成】 新規リビトール脱水素酵素と、該酵素を産生
するエンテロバクター属に属する微生物を用いる該酵素
の製造方法及び該酵素を用いる糖アルコールとケトース
との変換方法、並びに、該酵素を用いる糖アルコール又
はケトースの製造方法を主な構成とする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、リビトール脱水素酵素
とその製造方法並びに用途に関し、更に詳細には、リビ
トールをＮＡＤ+共存下でＤ−リブロースに酸化し、Ｄ
−リブロースをＮＡＤＨ共存下でリビトールに還元する
リビトール脱水素酵素とその製造方法、それを産生する
微生物、並びに該酵素又は該酵素活性を有する微生物を
用いるケトース又は糖アルコールの製造方法に関する。
とその製造方法並びに用途に関し、更に詳細には、リビ
トールをＮＡＤ+共存下でＤ−リブロースに酸化し、Ｄ
−リブロースをＮＡＤＨ共存下でリビトールに還元する
リビトール脱水素酵素とその製造方法、それを産生する
微生物、並びに該酵素又は該酵素活性を有する微生物を
用いるケトース又は糖アルコールの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、生化学工業が発達し、糖質化学の
分野においても、従来、殆ど必要としなかった各種希少
糖質の需要が起こりつつあり、これら糖質の安定な製造
方法の確立が望まれている。これら糖質の製造方法は、
有機化学的手法によっても行うことができるが、一般的
には、その製造条件が苛酷で目的糖質の収率が低く、工
業的生産方法としては不適である。一方、生化学的手段
としては、酵素による糖質変換方法が行われている。し
かしながら、酵素は、一般に基質特異性が高く、目的糖
質毎に特定の酵素を用意しなければならない。従って、
多種類の糖質を製造するためには多種類の酵素を必要と
し、これら多種類の糖質の工業的な安定供給を困難にし
ている。また、比較的基質特異性の低い酵素としてポリ
オール脱水素酵素やリビトール脱水素酵素などが知られ
ており［エンザイム ノメンクレイチャー（ＥＮＺＹＭ
Ｅ ＮＯＭＥＮＣＬＡＴＵＲＥ）、１９９２年、アカデ
ミック・プレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
Ｉｎｃ．）参照］、これら酵素の利用も考えられる。し
かしながら、従来知られているこれら酵素はその産生量
が低すぎたり、至適温度や温度安定性が低すぎたり、更
には、至適ｐＨとｐＨ安定性がかけ離れていたりするな
どの欠点を有しており、これら酵素を工業的に利用する
ことは極めて困難であり、多種類の糖質の工業的な供給
を困難にしている。
分野においても、従来、殆ど必要としなかった各種希少
糖質の需要が起こりつつあり、これら糖質の安定な製造
方法の確立が望まれている。これら糖質の製造方法は、
有機化学的手法によっても行うことができるが、一般的
には、その製造条件が苛酷で目的糖質の収率が低く、工
業的生産方法としては不適である。一方、生化学的手段
としては、酵素による糖質変換方法が行われている。し
かしながら、酵素は、一般に基質特異性が高く、目的糖
質毎に特定の酵素を用意しなければならない。従って、
多種類の糖質を製造するためには多種類の酵素を必要と
し、これら多種類の糖質の工業的な安定供給を困難にし
ている。また、比較的基質特異性の低い酵素としてポリ
オール脱水素酵素やリビトール脱水素酵素などが知られ
ており［エンザイム ノメンクレイチャー（ＥＮＺＹＭ
Ｅ ＮＯＭＥＮＣＬＡＴＵＲＥ）、１９９２年、アカデ
ミック・プレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，
Ｉｎｃ．）参照］、これら酵素の利用も考えられる。し
かしながら、従来知られているこれら酵素はその産生量
が低すぎたり、至適温度や温度安定性が低すぎたり、更
には、至適ｐＨとｐＨ安定性がかけ離れていたりするな
どの欠点を有しており、これら酵素を工業的に利用する
ことは極めて困難であり、多種類の糖質の工業的な供給
を困難にしている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】工業的に糖質を製造す
る上で、できるだけ少ない種類の酵素の利用により、で
きるだけ多種類の糖質を製造する方法の確立が強く望ま
れる。
る上で、できるだけ少ない種類の酵素の利用により、で
きるだけ多種類の糖質を製造する方法の確立が強く望ま
れる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者等は上記課題を
解決するために、できるだけ多種類の糖質に作用する酵
素、とりわけ、リビトール脱水素酵素に着目して、その
酵素を産生する微生物を広く検索した。その結果、香川
県木田郡三木町の土壌から分離したエンテロバクター
（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規な微生物
２２１ｅ株は、多種類の糖質に作用する新規リビトール
脱水素酵素を産生すること、その産生量の多いこと、更
には、至適温度、温度安定性が比較的高く、しかも至適
ｐＨとｐＨ安定性がほぼ一致しており、本酵素を工業的
に利用する上で極めて有利であることを見出し、加え
て、本リビトール脱水素酵素又は本酵素活性を有する微
生物を、基質である糖アルコール又はケトースを含有す
る溶液に作用させることにより、多種類の希少糖質が容
易に製造しうることなどを見出し、本発明を完成した。
解決するために、できるだけ多種類の糖質に作用する酵
素、とりわけ、リビトール脱水素酵素に着目して、その
酵素を産生する微生物を広く検索した。その結果、香川
県木田郡三木町の土壌から分離したエンテロバクター
（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する新規な微生物
２２１ｅ株は、多種類の糖質に作用する新規リビトール
脱水素酵素を産生すること、その産生量の多いこと、更
には、至適温度、温度安定性が比較的高く、しかも至適
ｐＨとｐＨ安定性がほぼ一致しており、本酵素を工業的
に利用する上で極めて有利であることを見出し、加え
て、本リビトール脱水素酵素又は本酵素活性を有する微
生物を、基質である糖アルコール又はケトースを含有す
る溶液に作用させることにより、多種類の希少糖質が容
易に製造しうることなどを見出し、本発明を完成した。
【０００５】以下、本発明のエンテロバクター属に属す
る微生物２２１ｅの同定試験結果を示す。なお、同定試
験は、『微生物の分類と同定』（長谷川武治編、学会出
版センター、１９８５年）に準拠して行った。
る微生物２２１ｅの同定試験結果を示す。なお、同定試
験は、『微生物の分類と同定』（長谷川武治編、学会出
版センター、１９８５年）に準拠して行った。
【０００６】
【エンテロバクター・アグロメランス ２２１ｅ株の同
定試験結果】
定試験結果】
（１）肉汁寒天培養、２７℃：通常、０．６乃至１．１
×１．６乃至２．５μｍの桿菌。単独。運動性なし。無
胞子。非抗酸性。グラム陰性。 （２）ポリペプトン寒天培養、２７℃：通常、０．６乃
至１．１×１．６乃至２．５μｍの桿菌。単独。周毛に
よる運動性あり。無胞子。非抗酸性。グラム陰性。
×１．６乃至２．５μｍの桿菌。単独。運動性なし。無
胞子。非抗酸性。グラム陰性。 （２）ポリペプトン寒天培養、２７℃：通常、０．６乃
至１．１×１．６乃至２．５μｍの桿菌。単独。周毛に
よる運動性あり。無胞子。非抗酸性。グラム陰性。
（１）肉汁寒天平板培養、２７℃ 形状 ：円形 大きさは２４時間で
０．１ｍｍ。４日で０．１乃至０．２ｍｍ。 周縁 ：全縁 隆起 ：半レンズ状 光沢 ：鈍光 表面 ：平滑 色調 ：不透明、うすい黄 （２）ポリペプトン平板寒天培養、２７℃ 形状 ：円形 大きさは２４時間で
０．１ｍｍ。４日で０．５乃至２．５ｍｍ。 周縁 ：全縁 隆起 ：半レンズ状 光沢 ：鈍光 表面 ：平滑 色調 ：不透明、うすい黄
０．１ｍｍ。４日で０．１乃至０．２ｍｍ。 周縁 ：全縁 隆起 ：半レンズ状 光沢 ：鈍光 表面 ：平滑 色調 ：不透明、うすい黄 （２）ポリペプトン平板寒天培養、２７℃ 形状 ：円形 大きさは２４時間で
０．１ｍｍ。４日で０．５乃至２．５ｍｍ。 周縁 ：全縁 隆起 ：半レンズ状 光沢 ：鈍光 表面 ：平滑 色調 ：不透明、うすい黄
（１）硝酸塩の還元性 ：陽性 （２）メチルレッド試験 ：陰性 （３）ＶＰ試験 ：陽性 （４）インドールの生成 ：陰性 （５）硫化水素の生成 ：陰性 （６）澱粉の分解 ：陰性 （７）クエン酸の利用 ：陽性 （８）マロン酸の利用 ：陽性 （９）Ｔｗｅｅｎ８０の分解 ：陰性 （１０）ウレアーゼ ：陽性 （１１）細胞外ＤＮａｓｅ ：陰性 （１２）オキシダーゼ ：陰性 （１３）カタラーゼ ：陽性 （１４）生育の範囲 ：ｐＨ５乃至８、温度
４乃至４０℃。 （１５）酸素に対する態度 ：通性嫌気性、好気的
条件の方が生育良好。 （１６）糖からの酸の生成 Ｄ−グルコース ：陽性 Ｄ−マンノース ：陽性 Ｌ−アラビノース ：陽性 Ｄ−キシロース ：陽性 Ｌ−ラムノース ：陽性 マルトース ：陽性 スクロース ：陽性 セロビオース ：陰性 ラクトース ：陽性 ラフィノース ：陽性 ズルチトール ：陽性 Ｄ−ソルビトール ：陽性 Ｄ−マンニトール ：陽性 アドニトール ：陽性 グリセロール ：陰性 ミオ−イノシトール ：陽性 α−メチル−Ｄ−グルコース：陰性 （１７）Ｏ−Ｆ試験 ：発酵 （１８）Ｄ−グルコースからのガスの生成：陽性 （１９）アミノ酸の脱炭酸試験 ：Ｌ−リジン、Ｌ−ア
ルギニン、オルニチン、いずれに対しても陰性。 （２０）ゼラチンの分解 ：陰性 （２１）シアン化カリウム試験 ：陽性 （２２）ＤＮＡのＧ−Ｃ含量 ：５３．４％
４乃至４０℃。 （１５）酸素に対する態度 ：通性嫌気性、好気的
条件の方が生育良好。 （１６）糖からの酸の生成 Ｄ−グルコース ：陽性 Ｄ−マンノース ：陽性 Ｌ−アラビノース ：陽性 Ｄ−キシロース ：陽性 Ｌ−ラムノース ：陽性 マルトース ：陽性 スクロース ：陽性 セロビオース ：陰性 ラクトース ：陽性 ラフィノース ：陽性 ズルチトール ：陽性 Ｄ−ソルビトール ：陽性 Ｄ−マンニトール ：陽性 アドニトール ：陽性 グリセロール ：陰性 ミオ−イノシトール ：陽性 α−メチル−Ｄ−グルコース：陰性 （１７）Ｏ−Ｆ試験 ：発酵 （１８）Ｄ−グルコースからのガスの生成：陽性 （１９）アミノ酸の脱炭酸試験 ：Ｌ−リジン、Ｌ−ア
ルギニン、オルニチン、いずれに対しても陰性。 （２０）ゼラチンの分解 ：陰性 （２１）シアン化カリウム試験 ：陽性 （２２）ＤＮＡのＧ−Ｃ含量 ：５３．４％
【０００７】以上の菌学的性質に基づいて、『バージー
ズ・マニュアル・オブ・デターミネーティブ・バクテリ
オロジー（Ｂｅｒｇｅｙ´ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄ
ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ）』、第９版（１９９４年）を参考にして、公知菌と
の異同を検討した。その結果、本菌は、エンテロバクタ
ー・アグロメランスに属する菌株であることが判明し
た。
ズ・マニュアル・オブ・デターミネーティブ・バクテリ
オロジー（Ｂｅｒｇｅｙ´ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄ
ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ
ｙ）』、第９版（１９９４年）を参考にして、公知菌と
の異同を検討した。その結果、本菌は、エンテロバクタ
ー・アグロメランスに属する菌株であることが判明し
た。
【０００８】これらの結果から、本発明者等は、本微生
物をエンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏ
ｂａｃｔｅｒ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）２２１ｅと命
名し、平成６年６月１６日付けで、茨城県つくば市東１
丁目１番３号にある通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所、特許微生物寄託センターに寄託し、受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−４７００として受託された。
物をエンテロバクター・アグロメランス（Ｅｎｔｅｒｏ
ｂａｃｔｅｒ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）２２１ｅと命
名し、平成６年６月１６日付けで、茨城県つくば市東１
丁目１番３号にある通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所、特許微生物寄託センターに寄託し、受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−４７００として受託された。
【０００９】本発明では、上記菌株のみならず、エンテ
ロバクター属に属し、リビトール脱水素酵素産生能を有
する他の菌株やこれらの変異株なども適宜使用すること
ができる。本発明の微生物の培養に用いる培地は微生物
が生育でき、本発明のリビトール脱水素酵素を産生する
ものであればよく、合成培地及び天然培地のいずれでも
よい。炭素源としては、例えば、アルドース、ケトー
ス、糖アルコール、グリセロールなどから選ばれる１種
又は２種以上が適宜選ばれる。窒素源としては、例え
ば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物、及
び、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼ
イン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素
含有物が用いられる。また、無機成分としては、例え
ば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナト
リウム塩、リン酸塩などが適宜用いられる。培養条件
は、微生物が生育し、本発明の酵素を産生する温度が適
しており、通常、約４乃至４０℃、望ましくは、約２０
乃至３５℃、ｐＨ約５乃至９、望ましくは、約６乃至
８．５から選ばれる条件で好気的に行われる。
ロバクター属に属し、リビトール脱水素酵素産生能を有
する他の菌株やこれらの変異株なども適宜使用すること
ができる。本発明の微生物の培養に用いる培地は微生物
が生育でき、本発明のリビトール脱水素酵素を産生する
ものであればよく、合成培地及び天然培地のいずれでも
よい。炭素源としては、例えば、アルドース、ケトー
ス、糖アルコール、グリセロールなどから選ばれる１種
又は２種以上が適宜選ばれる。窒素源としては、例え
ば、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒素化合物、及
び、例えば、尿素、コーン・スティープ・リカー、カゼ
イン、ペプトン、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素
含有物が用いられる。また、無機成分としては、例え
ば、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナト
リウム塩、リン酸塩などが適宜用いられる。培養条件
は、微生物が生育し、本発明の酵素を産生する温度が適
しており、通常、約４乃至４０℃、望ましくは、約２０
乃至３５℃、ｐＨ約５乃至９、望ましくは、約６乃至
８．５から選ばれる条件で好気的に行われる。
【００１０】このようにして、微生物を培養した後、得
られる培養物から本発明の酵素を回収する。本酵素活性
は、主に菌体に認められ、菌体を酵素剤として利用して
もよく、また、培養物全体を酵素剤として用いることも
できる。菌体内酵素は、通常の手段を用いて菌体から抽
出し、粗酵素として用いることができる。粗酵素は、そ
のまま用いることもできるが、常法に従って、更に精製
することもできる。例えば、菌体磨砕抽出液をポリエチ
レングリコール分画、イオン交換クロマトグラフィー、
疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー
などを組合わせて電気泳動的に単一な酵素を得ることが
できる。
られる培養物から本発明の酵素を回収する。本酵素活性
は、主に菌体に認められ、菌体を酵素剤として利用して
もよく、また、培養物全体を酵素剤として用いることも
できる。菌体内酵素は、通常の手段を用いて菌体から抽
出し、粗酵素として用いることができる。粗酵素は、そ
のまま用いることもできるが、常法に従って、更に精製
することもできる。例えば、菌体磨砕抽出液をポリエチ
レングリコール分画、イオン交換クロマトグラフィー、
疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー
などを組合わせて電気泳動的に単一な酵素を得ることが
できる。
【００１１】本発明のリビトール脱水素酵素の活性は次
のようにして測定する。０．０５Ｍグリシン・水酸化ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ９．０）０．７ｍｌ、０．１Ｍリ
ビトール０．１ｍｌ、０．２５Ｍ ＮＡＤ+０．１ｍｌ
及び酵素液を加えて全容を１．０ｍｌとし、３０℃を保
って分光光度計で測定した。酵素活性１単位は、生成す
るＮＡＤＨを３４０ｎｍにおける吸光度として測定し、
１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを生成するに要する酵素
量とした。
のようにして測定する。０．０５Ｍグリシン・水酸化ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ９．０）０．７ｍｌ、０．１Ｍリ
ビトール０．１ｍｌ、０．２５Ｍ ＮＡＤ+０．１ｍｌ
及び酵素液を加えて全容を１．０ｍｌとし、３０℃を保
って分光光度計で測定した。酵素活性１単位は、生成す
るＮＡＤＨを３４０ｎｍにおける吸光度として測定し、
１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＨを生成するに要する酵素
量とした。
【００１２】本発明のリビトール脱水素酵素は、基質と
して、リビトールをはじめ、第２位の炭素に結合するア
ルコール基（Ｈ−Ｃ−ＯＨ）がＤ−グリセロ配位を有す
る多種の糖アルコールとその糖アルコール基の代わりに
ケト基（Ｃ＝Ｏ）を有している多種のケトースとの間の
変換反応に利用できる。従って、１種の酵素で多種の糖
質を産生できることとなり、工業的に極めて有利であ
る。
して、リビトールをはじめ、第２位の炭素に結合するア
ルコール基（Ｈ−Ｃ−ＯＨ）がＤ−グリセロ配位を有す
る多種の糖アルコールとその糖アルコール基の代わりに
ケト基（Ｃ＝Ｏ）を有している多種のケトースとの間の
変換反応に利用できる。従って、１種の酵素で多種の糖
質を産生できることとなり、工業的に極めて有利であ
る。
【００１３】本発明のリビトール脱水素酵素は、必ずし
も高度に精製して用いる必要はなく、例えば、本リビト
ール脱水素酵素活性を有する微生物を用いることは、工
業的に糖質変換反応する上で好都合である。すなわち、
高度に精製されたリビトール脱水素酵素を用いる糖質変
換反応では、反応液に、基質の糖質に加えて、補酵素と
して、高価なＮＡＤ+又はＮＡＤＨの添加を必須とする
が、該酵素活性を有する微生物を用いる場合には、微生
物自体がＮＡＤ+又はＮＡＤＨを生合成及び再生する系
を有しており、これらを有効に利用できるので、該補酵
素の添加を必要とせず、極めて有利である。
も高度に精製して用いる必要はなく、例えば、本リビト
ール脱水素酵素活性を有する微生物を用いることは、工
業的に糖質変換反応する上で好都合である。すなわち、
高度に精製されたリビトール脱水素酵素を用いる糖質変
換反応では、反応液に、基質の糖質に加えて、補酵素と
して、高価なＮＡＤ+又はＮＡＤＨの添加を必須とする
が、該酵素活性を有する微生物を用いる場合には、微生
物自体がＮＡＤ+又はＮＡＤＨを生合成及び再生する系
を有しており、これらを有効に利用できるので、該補酵
素の添加を必要とせず、極めて有利である。
【００１４】反応条件は、糖アルコールからケトースへ
の反応には、高度に精製されたリビトール脱水素酵素で
は、ＮＡＤ+を必要とし、該酵素活性を有する微生物で
は、好気的条件、例えば、酸素、空気などを通気撹拌す
ればよい。ケトースから糖アルコールへの反応には、高
度に精製されたリビトール脱水素酵素では、ＮＡＤＨを
必要とし、該酵素活性を有する微生物では、嫌気的条
件、例えば、窒素、不活性ガスなどの環境に保てばよ
い。また、リビトール脱水素酵素、又は、リビトール脱
水素酵素活性を有する微生物を用いて、糖アルコールか
らケトースへの変換、又は、ケトースから糖アルコール
への変換をさせるには、リビトール脱水素酵素ととも
に、これと共役反応する酸化還元酵素、例えば、アルコ
ール脱水素酵素、乳酸脱水素酵素などを該酸化還元酵素
の基質共存下で作用させるか、又は、リビトール脱水素
酵素とともにこれと共役反応する酸化還元酵素を保有す
る微生物をその酸化還元酵素の基質共存下で作用させれ
ば、該変換反応を著しく促進することができる。この
際、酸化還元酵素のための基質としては、糖アルコール
からケトースへの変換の場合には、酸化型基質、例え
ば、アセトアルデヒド、ピルビン酸などを共存させるの
が好ましく、ケトースから糖アルコールへの変換の場合
には、還元型基質、例えば、エタノール、乳酸などの共
存が好ましい。また、微生物をトルエン処理したり、公
知の方法で固定化したりして用いることも随意である。
反応温度は、酵素が失活しない温度、例えば、４乃至５
０℃、望ましくは１０乃至４０℃で反応すればよい。反
応時間は、酵素反応の進行具合により適宜選択すればよ
く、通常、基質固形物グラム当たり約０．１乃至１００
単位の酵素使用量で、０．１乃至１００時間程度であ
る。
の反応には、高度に精製されたリビトール脱水素酵素で
は、ＮＡＤ+を必要とし、該酵素活性を有する微生物で
は、好気的条件、例えば、酸素、空気などを通気撹拌す
ればよい。ケトースから糖アルコールへの反応には、高
度に精製されたリビトール脱水素酵素では、ＮＡＤＨを
必要とし、該酵素活性を有する微生物では、嫌気的条
件、例えば、窒素、不活性ガスなどの環境に保てばよ
い。また、リビトール脱水素酵素、又は、リビトール脱
水素酵素活性を有する微生物を用いて、糖アルコールか
らケトースへの変換、又は、ケトースから糖アルコール
への変換をさせるには、リビトール脱水素酵素ととも
に、これと共役反応する酸化還元酵素、例えば、アルコ
ール脱水素酵素、乳酸脱水素酵素などを該酸化還元酵素
の基質共存下で作用させるか、又は、リビトール脱水素
酵素とともにこれと共役反応する酸化還元酵素を保有す
る微生物をその酸化還元酵素の基質共存下で作用させれ
ば、該変換反応を著しく促進することができる。この
際、酸化還元酵素のための基質としては、糖アルコール
からケトースへの変換の場合には、酸化型基質、例え
ば、アセトアルデヒド、ピルビン酸などを共存させるの
が好ましく、ケトースから糖アルコールへの変換の場合
には、還元型基質、例えば、エタノール、乳酸などの共
存が好ましい。また、微生物をトルエン処理したり、公
知の方法で固定化したりして用いることも随意である。
反応温度は、酵素が失活しない温度、例えば、４乃至５
０℃、望ましくは１０乃至４０℃で反応すればよい。反
応時間は、酵素反応の進行具合により適宜選択すればよ
く、通常、基質固形物グラム当たり約０．１乃至１００
単位の酵素使用量で、０．１乃至１００時間程度であ
る。
【００１５】このようにして得られる反応液には、通
常、糖アルコールとケトースの両者を含有している。反
応液は、常法により、濾過、遠心分離などして不溶物を
除去した後、活性炭で脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹
脂で脱塩し、濃縮し、シラップ状製品にすることも、乾
燥して粉末状製品にすることも、更には、結晶性糖質を
結晶製品に仕上げることも随意である。必要ならば、更
に高度な精製をすることも随意である。例えば、イオン
交換カラムクロマトグラフィーによる分画、活性炭カラ
ムクロマトグラフィーによる分画、シリカゲルカラムク
ロマトグラフィーによる分画、アルカリ処理によるケト
ースの分解除去などの方法で高純度の糖質を得ることも
容易である。このようにして得られる各種糖質は、試薬
はもとより、甘味料、品質改良剤などとして食品工業
に、原材料、中間体などとして医薬品工業、化学工業な
ど多くの用途に有利に利用できる。以下、実験で本発明
を詳細に説明する。
常、糖アルコールとケトースの両者を含有している。反
応液は、常法により、濾過、遠心分離などして不溶物を
除去した後、活性炭で脱色、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹
脂で脱塩し、濃縮し、シラップ状製品にすることも、乾
燥して粉末状製品にすることも、更には、結晶性糖質を
結晶製品に仕上げることも随意である。必要ならば、更
に高度な精製をすることも随意である。例えば、イオン
交換カラムクロマトグラフィーによる分画、活性炭カラ
ムクロマトグラフィーによる分画、シリカゲルカラムク
ロマトグラフィーによる分画、アルカリ処理によるケト
ースの分解除去などの方法で高純度の糖質を得ることも
容易である。このようにして得られる各種糖質は、試薬
はもとより、甘味料、品質改良剤などとして食品工業
に、原材料、中間体などとして医薬品工業、化学工業な
ど多くの用途に有利に利用できる。以下、実験で本発明
を詳細に説明する。
【００１６】
【実験１ エンテロバクター・アグロメランス ２２１
ｅからのリビトール脱水素酵素の製造】エリスリトール
２．０ｗ／ｖ％、酵母エキス０．５ｗ／ｖ％、ポリペプ
トン０．５ｗ／ｖ％、食塩０．５ｗ／ｖ％及び水からな
る液体培地をｐＨ７．０に調整した。この培地を５００
ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレ
ーブで１２０℃、２０分間滅菌し、冷却して、エンテロ
バクター・アグロメランス ２２１ｅ（ＦＥＲＭ ＢＰ
−４７００）を接種し、３０℃で２４時間振盪培養し
た。培養液を遠心分離して、菌体を培地１ｌ当たり約５
ｇを採取し、これを、０．０５Ｍグリシン・水酸化ナト
リウム緩衝液（ｐＨ１０．０）共存下で、常法に従っ
て、アルミナ粉末とともに磨砕し、遠心分離して上清
（粗酵素液）７５ｍｌを得た。本液は、活性量１，７７
６単位、比活性１．９単位／ｍｇ蛋白質であった。
ｅからのリビトール脱水素酵素の製造】エリスリトール
２．０ｗ／ｖ％、酵母エキス０．５ｗ／ｖ％、ポリペプ
トン０．５ｗ／ｖ％、食塩０．５ｗ／ｖ％及び水からな
る液体培地をｐＨ７．０に調整した。この培地を５００
ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌずつ入れ、オートクレ
ーブで１２０℃、２０分間滅菌し、冷却して、エンテロ
バクター・アグロメランス ２２１ｅ（ＦＥＲＭ ＢＰ
−４７００）を接種し、３０℃で２４時間振盪培養し
た。培養液を遠心分離して、菌体を培地１ｌ当たり約５
ｇを採取し、これを、０．０５Ｍグリシン・水酸化ナト
リウム緩衝液（ｐＨ１０．０）共存下で、常法に従っ
て、アルミナ粉末とともに磨砕し、遠心分離して上清
（粗酵素液）７５ｍｌを得た。本液は、活性量１，７７
６単位、比活性１．９単位／ｍｇ蛋白質であった。
【００１７】
【実験２ リビトール脱水素酵素の精製】
【実験２−１ ポリエチレングリコール分画】実験１で
得た粗酵素液を、氷冷し、これに０．０３Ｍ塩化マンガ
ンを添加し、１５分間撹拌し、次いで、ポリエチレング
リコールを終末１２．５ｗ／ｗ％になるように加え、撹
拌溶解し、生じた不溶物を遠心分離して除去した。得ら
れた上清にポリエチレングリコールを終末１５ｗ／ｗ％
になるように加え、撹拌溶解し、生じた不溶物を遠心分
離し、沈澱物を採取した。
得た粗酵素液を、氷冷し、これに０．０３Ｍ塩化マンガ
ンを添加し、１５分間撹拌し、次いで、ポリエチレング
リコールを終末１２．５ｗ／ｗ％になるように加え、撹
拌溶解し、生じた不溶物を遠心分離して除去した。得ら
れた上清にポリエチレングリコールを終末１５ｗ／ｗ％
になるように加え、撹拌溶解し、生じた不溶物を遠心分
離し、沈澱物を採取した。
【００１８】
【実験２−２ イオン交換クロマトグラフィー】実験２
−１で得た沈澱物を０．０５Ｍグリシン・水酸化ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ１０．０）に溶解し、不溶物を遠心分
離して除去し、上清２０ｍｌを得た。本上清を弱塩基性
陰イオン交換樹脂（東ソー製、商品名『ＤＥＡＥ−トヨ
パール６５０Ｍ』）を充填したカラムにかけて本酵素を
吸着させ、次いで、塩化カリウムによる０．０８乃至
０．１５Ｍの濃度勾配で溶出し、リビトール脱水素酵素
活性画分を採取した。
−１で得た沈澱物を０．０５Ｍグリシン・水酸化ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ１０．０）に溶解し、不溶物を遠心分
離して除去し、上清２０ｍｌを得た。本上清を弱塩基性
陰イオン交換樹脂（東ソー製、商品名『ＤＥＡＥ−トヨ
パール６５０Ｍ』）を充填したカラムにかけて本酵素を
吸着させ、次いで、塩化カリウムによる０．０８乃至
０．１５Ｍの濃度勾配で溶出し、リビトール脱水素酵素
活性画分を採取した。
【００１９】
【実験２−３ 疎水カラムクロマトグラフィー】実験２
−２で得られた活性画分に硫安を濃度１．５Ｍになるよ
うに添加し、これを疎水性樹脂（東ソー製、商品名『フ
ェニル トヨパール ６５０Ｍ』）を充填したカラムに
かけて本酵素を吸着させ、次いで、硫安による１．５乃
至０Ｍの濃度勾配で溶出し、リビトール脱水素酵素活性
画分を採取した。
−２で得られた活性画分に硫安を濃度１．５Ｍになるよ
うに添加し、これを疎水性樹脂（東ソー製、商品名『フ
ェニル トヨパール ６５０Ｍ』）を充填したカラムに
かけて本酵素を吸着させ、次いで、硫安による１．５乃
至０Ｍの濃度勾配で溶出し、リビトール脱水素酵素活性
画分を採取した。
【００２０】
【実験２−４ ゲル濾過クロマトグラフィー】実験２−
３で得た活性画分を濃縮し、これをビーズ状デキストラ
ンゲル（ファルマシア社製、商品名『セファデックス
Ｇ−１５０』）を充填したカラムにかけ、０．０５Ｍグ
リシン・水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）で溶
出し、リビトール脱水素酵素活性画分を採取した。上述
の各精製工程における酵素活性量、比活性、収率を表１
に示す。
３で得た活性画分を濃縮し、これをビーズ状デキストラ
ンゲル（ファルマシア社製、商品名『セファデックス
Ｇ−１５０』）を充填したカラムにかけ、０．０５Ｍグ
リシン・水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０．０）で溶
出し、リビトール脱水素酵素活性画分を採取した。上述
の各精製工程における酵素活性量、比活性、収率を表１
に示す。
【００２１】
【表１】
【００２２】表１の工程でゲル濾過溶出液として得られ
た精製酵素標品をポリアクリルアミドゲルディスク電気
泳動法で純度を検定したところ、単一バンドであること
が確認され、電気泳動的に極めて高純度の酵素標品であ
ることが判明した。
た精製酵素標品をポリアクリルアミドゲルディスク電気
泳動法で純度を検定したところ、単一バンドであること
が確認され、電気泳動的に極めて高純度の酵素標品であ
ることが判明した。
【００２３】
【実験３ リビトール脱水素酵素の性質】実験２の方法
で得た精製リビトール脱水素酵素を用いて、その理化学
的性質を調べた。
で得た精製リビトール脱水素酵素を用いて、その理化学
的性質を調べた。
【００２４】
【実験３−１ 作用】活性測定法に準じて、ＮＡＤ+共
存下でリビトールに作用させるとＤ−リブロースを生成
し、ＮＡＤＨ共存下でＤ−リブロースに作用させるとリ
ビトールを生成する。
存下でリビトールに作用させるとＤ−リブロースを生成
し、ＮＡＤＨ共存下でＤ−リブロースに作用させるとリ
ビトールを生成する。
【００２５】
【実験３−２ 基質特異性】活性測定法に準じて、各種
糖アルコールを基質に活性を測定した。リビトールを１
００とした時の各種糖アルコールに対する相対活性を表
２に示す。
糖アルコールを基質に活性を測定した。リビトールを１
００とした時の各種糖アルコールに対する相対活性を表
２に示す。
【００２６】
【表２】
【００２７】表２の結果からも明らかなように、リビト
ールに対して最も高い活性を示した。他にアリトール、
Ｌ−アラビトール、Ｌ−マンニトール、キシリトール、
Ｌ−ソルビトール、Ｌ−タリトール、Ｌ−イディトー
ル、Ｄ−ソルビトール、ガラクチトール及びエリスリト
ールに活性を示した。これらの糖アルコールに作用する
反応様式について検討した結果、それらの反応様式は共
通しており、その一例としてリビトールの場合を示すと
化１のとおりである。
ールに対して最も高い活性を示した。他にアリトール、
Ｌ−アラビトール、Ｌ−マンニトール、キシリトール、
Ｌ−ソルビトール、Ｌ−タリトール、Ｌ−イディトー
ル、Ｄ−ソルビトール、ガラクチトール及びエリスリト
ールに活性を示した。これらの糖アルコールに作用する
反応様式について検討した結果、それらの反応様式は共
通しており、その一例としてリビトールの場合を示すと
化１のとおりである。
【００２８】
【化１】
【００２９】化１から明らかなように、本発明のリビト
ール脱水素酵素は、第２位の炭素に結合するアルコール
基（Ｈ−Ｃ−ＯＨ）がＤ−グリセロの配位を持つ糖アル
コールに作用する。第２位の炭素に結合するアルコール
基がＬ−グリセロの配位を持つＤ−イディトール、Ｄ−
マンニトール及びＤ−タリトールには活性を示さない。
これらの基質から生産されるケトースをイオン交換カラ
ムクロマトグラフィーによって単離し、高速液体クロマ
トグラフィーによって確認した結果を表３にまとめた。
ール脱水素酵素は、第２位の炭素に結合するアルコール
基（Ｈ−Ｃ−ＯＨ）がＤ−グリセロの配位を持つ糖アル
コールに作用する。第２位の炭素に結合するアルコール
基がＬ−グリセロの配位を持つＤ−イディトール、Ｄ−
マンニトール及びＤ−タリトールには活性を示さない。
これらの基質から生産されるケトースをイオン交換カラ
ムクロマトグラフィーによって単離し、高速液体クロマ
トグラフィーによって確認した結果を表３にまとめた。
【００３０】
【表３】
【００３１】次に、これら基質のうち、主な糖アルコー
ルに対するＫｍ値を求めた。結果は表４に示す。
ルに対するＫｍ値を求めた。結果は表４に示す。
【００３２】
【表４】
【００３３】表４の結果から明らかなように、リビトー
ルに対する親和性が最も高く、そのＫｍ値は３２．２ｍ
Ｍである。なお、補酵素は、ＮＡＤ+を要求し、ＮＡＤ
Ｐ+を要求しない。
ルに対する親和性が最も高く、そのＫｍ値は３２．２ｍ
Ｍである。なお、補酵素は、ＮＡＤ+を要求し、ＮＡＤ
Ｐ+を要求しない。
【００３４】
【実験３−３ 分子量】 （１） ＳＤＳ−ＰＡＧＥで約２０，０００乃至３０，
０００ダルトンを示す。 （２） ゲル濾過法で約７１，０００乃至８１，０００
ダルトンを示す。ゲル濾過法の結果が、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅの結果の約３倍になることから、リビトール脱水素酵
素は、３量体で存在していることが推察される。
０００ダルトンを示す。 （２） ゲル濾過法で約７１，０００乃至８１，０００
ダルトンを示す。ゲル濾過法の結果が、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅの結果の約３倍になることから、リビトール脱水素酵
素は、３量体で存在していることが推察される。
【００３５】
【実験３−４ 等電点】アガロースプレートを用いる等
電点電気泳動法で、ｐＩ約４．４乃至５．４を示す。
電点電気泳動法で、ｐＩ約４．４乃至５．４を示す。
【００３６】
【実験３−５ 活性阻害】活性測定法に準じて調べた。
１ｍＭ Ｃａ2+では活性を阻害せず、１ｍＭ Ａｇ2+で
は活性を阻害する。
１ｍＭ Ｃａ2+では活性を阻害せず、１ｍＭ Ａｇ2+で
は活性を阻害する。
【００３７】
【実験３−６ 至適温度】活性測定法に準じて調べた。
結果は、図１に示すように、ｐＨ１０、１分間反応で、
約５０乃至６０℃が至適である。
結果は、図１に示すように、ｐＨ１０、１分間反応で、
約５０乃至６０℃が至適である。
【００３８】
【実験３−７ 至適ｐＨ】活性測定法に準じて調べた。
結果は、図２に示すように、３０℃、１分間反応で、ｐ
Ｈ約９乃至１０が至適である。図中、●はクエン酸塩緩
衝液、□はマレイン酸塩緩衝液、■はトリス・塩酸緩衝
液、○はグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液を示す。
結果は、図２に示すように、３０℃、１分間反応で、ｐ
Ｈ約９乃至１０が至適である。図中、●はクエン酸塩緩
衝液、□はマレイン酸塩緩衝液、■はトリス・塩酸緩衝
液、○はグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液を示す。
【００３９】
【実験３−８ 温度安定性】活性測定法に準じて調べ
た。結果は、図３に示すように、ｐＨ１０、１０分間保
持で、３０℃付近まで安定である。
た。結果は、図３に示すように、ｐＨ１０、１０分間保
持で、３０℃付近まで安定である。
【００４０】
【実験３−９ ｐＨ安定性】活性測定法に準じて調べ
た。結果は、図４に示すように、４℃、２４時間保持
で、ｐＨ約９乃至１１が安定である。図中、●はクエン
酸塩緩衝液、□はマレイン酸塩緩衝液、■はトリス・塩
酸緩衝液、○はグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液を示
す。
た。結果は、図４に示すように、４℃、２４時間保持
で、ｐＨ約９乃至１１が安定である。図中、●はクエン
酸塩緩衝液、□はマレイン酸塩緩衝液、■はトリス・塩
酸緩衝液、○はグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液を示
す。
【００４１】以上の結果から、本発明のリビトール脱水
素酵素は、至適温度、温度安定性が比較的高く、しかも
至適ｐＨ、ｐＨ安定性がほぼ一致しており、工業的に利
用する上で極めて有利である。以下、本発明の実施例を
述べる。
素酵素は、至適温度、温度安定性が比較的高く、しかも
至適ｐＨ、ｐＨ安定性がほぼ一致しており、工業的に利
用する上で極めて有利である。以下、本発明の実施例を
述べる。
【００４２】
【実施例１ リビトール脱水素酵素の製造】実験１の方
法に準じて、炭素源として、糖アルコール、グリセロー
ルなどを用いて液体培地を調製し、５００ｍｌ容三角フ
ラスコに１００ｍｌずつ入れ、実験１と同様に、加熱滅
菌し、冷却し、これにエンテロバクター・アグロメラン
ス２２１ｅ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７００）を植菌し、３
０℃、２４時間培養してリビトール脱水素酵素を製造し
た。培養終了後、実験１と同様に集菌し、菌体を磨砕
し、遠心分離して上清のリビトール脱水素酵素活性を測
定し、培地１００ｍｌ当たりの酵素生産量（単位）を求
めた。結果は表５に示した。
法に準じて、炭素源として、糖アルコール、グリセロー
ルなどを用いて液体培地を調製し、５００ｍｌ容三角フ
ラスコに１００ｍｌずつ入れ、実験１と同様に、加熱滅
菌し、冷却し、これにエンテロバクター・アグロメラン
ス２２１ｅ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７００）を植菌し、３
０℃、２４時間培養してリビトール脱水素酵素を製造し
た。培養終了後、実験１と同様に集菌し、菌体を磨砕
し、遠心分離して上清のリビトール脱水素酵素活性を測
定し、培地１００ｍｌ当たりの酵素生産量（単位）を求
めた。結果は表５に示した。
【００４３】
【表５】
【００４４】表５の結果から明らかなように、本発明の
リビトール脱水素酵素は、炭素源として、リビトールだ
けでなく、エリスリトール、Ｌ−アラビトール、グリセ
ロールを用いてもよく産生される。とりわけ、エリスリ
トールを用いる場合がよく産生される。
リビトール脱水素酵素は、炭素源として、リビトールだ
けでなく、エリスリトール、Ｌ−アラビトール、グリセ
ロールを用いてもよく産生される。とりわけ、エリスリ
トールを用いる場合がよく産生される。
【００４５】
【実施例２ 糖アルコールからケトースの製造】精製リ
ビトール脱水素酵素を用いて、糖アルコールからケトー
スを製造した。０．０１Ｍ糖アルコール溶液１０ｍｌに
０．２Ｍ ＮＡＤ+１０ｍｌを混合し、ｐＨ約９乃至１
０に維持しつつ、これに実験２の方法で調製した精製リ
ビトール脱水素酵素５０単位を加えて３０℃で１０時間
反応させ、９０℃に加熱して酵素を失活させた。この反
応液を高速液体クロマトグラフィーで分析した。原料の
糖アルコールに対するケトースの生成率は、いずれも約
５０乃至７０％であった。原料の糖アルコールと生産物
のケトースとの関係は表３と同じである。
ビトール脱水素酵素を用いて、糖アルコールからケトー
スを製造した。０．０１Ｍ糖アルコール溶液１０ｍｌに
０．２Ｍ ＮＡＤ+１０ｍｌを混合し、ｐＨ約９乃至１
０に維持しつつ、これに実験２の方法で調製した精製リ
ビトール脱水素酵素５０単位を加えて３０℃で１０時間
反応させ、９０℃に加熱して酵素を失活させた。この反
応液を高速液体クロマトグラフィーで分析した。原料の
糖アルコールに対するケトースの生成率は、いずれも約
５０乃至７０％であった。原料の糖アルコールと生産物
のケトースとの関係は表３と同じである。
【００４６】
【実施例３ 糖アルコールからケトースの製造】精製リ
ビトール脱水素酵素と乳酸脱水素酵素の共役反応を用い
て糖アルコールからケトースを製造した。０．０５Ｍ糖
アルコール、１ｍＭ ＮＡＤ+、０．０８Ｍピルビン酸
ソーダを含む０．１Ｍグリシン・水酸化ナトリウム緩衝
液（ｐＨ９．０）１０ｍｌに市販乳酸脱水素酵素１００
単位及び実験２の方法で調製したリビトール脱水素酵素
２０単位を添加して３０℃で５時間反応させ、９０℃に
加熱して酵素を失活させた。この反応液を高速液体クロ
マトグラフィーで分析した。生産されたケトース生成率
はいずれも９０％以上であった。原料の糖アルコールと
生産物のケトースとの関係は表３と同じである。
ビトール脱水素酵素と乳酸脱水素酵素の共役反応を用い
て糖アルコールからケトースを製造した。０．０５Ｍ糖
アルコール、１ｍＭ ＮＡＤ+、０．０８Ｍピルビン酸
ソーダを含む０．１Ｍグリシン・水酸化ナトリウム緩衝
液（ｐＨ９．０）１０ｍｌに市販乳酸脱水素酵素１００
単位及び実験２の方法で調製したリビトール脱水素酵素
２０単位を添加して３０℃で５時間反応させ、９０℃に
加熱して酵素を失活させた。この反応液を高速液体クロ
マトグラフィーで分析した。生産されたケトース生成率
はいずれも９０％以上であった。原料の糖アルコールと
生産物のケトースとの関係は表３と同じである。
【００４７】
【実施例４ ケトースから糖アルコールの製造】精製リ
ビトール脱水素酵素を用いてケトースから糖アルコール
を製造した。０．０１Ｍケトース溶液１０ｍｌに０．２
Ｍ ＮＡＤＨ１０ｍｌを混合し、ｐＨ約９乃至１０に維
持しつつ、これに実験２の方法で調製した精製リビトー
ル脱水素酵素５０単位を加えて３０℃で１０時間反応さ
せ、９０℃に加熱して酵素を失活させた。得られる反応
液を高速液体クロマトグラフィーで分析した。原料のケ
トースに対する糖アルコール生成率は、いずれも約８０
％以上であった。原料のケトースと生産物の糖アルコー
ルとの関係を表６にまとめた。
ビトール脱水素酵素を用いてケトースから糖アルコール
を製造した。０．０１Ｍケトース溶液１０ｍｌに０．２
Ｍ ＮＡＤＨ１０ｍｌを混合し、ｐＨ約９乃至１０に維
持しつつ、これに実験２の方法で調製した精製リビトー
ル脱水素酵素５０単位を加えて３０℃で１０時間反応さ
せ、９０℃に加熱して酵素を失活させた。得られる反応
液を高速液体クロマトグラフィーで分析した。原料のケ
トースに対する糖アルコール生成率は、いずれも約８０
％以上であった。原料のケトースと生産物の糖アルコー
ルとの関係を表６にまとめた。
【００４８】
【表６】
【００４９】
【実施例５ ヘキシトールからケトヘキソースの製造】
実験１の方法で調製したリビトール脱水素酵素活性を有
する微生物を用いてヘキシトールからケトヘキソースを
製造した。０．１Ｍヘキシトール溶液１００ｍｌを５０
０ｍｌ容三角フラスコにとり、ｐＨ約９乃至１０に維持
しつつ、これに実験１の方法で得たリビトール脱水素酵
素活性を有するエンテロバクター・アグロメランスの洗
浄菌体５ｇを加え、３０℃で１０時間振盪して好気的条
件に保って反応させた。得られる反応液を遠心分離して
不溶物を除去し、上清を高速液体クロマトグラフィーで
分析した。原料のヘキシトールに対するケトヘキソース
の生成率は、いずれも約９０％以上であった。原料のヘ
キシトールと生産物のケトヘキソースとの関係を表７に
まとめた。
実験１の方法で調製したリビトール脱水素酵素活性を有
する微生物を用いてヘキシトールからケトヘキソースを
製造した。０．１Ｍヘキシトール溶液１００ｍｌを５０
０ｍｌ容三角フラスコにとり、ｐＨ約９乃至１０に維持
しつつ、これに実験１の方法で得たリビトール脱水素酵
素活性を有するエンテロバクター・アグロメランスの洗
浄菌体５ｇを加え、３０℃で１０時間振盪して好気的条
件に保って反応させた。得られる反応液を遠心分離して
不溶物を除去し、上清を高速液体クロマトグラフィーで
分析した。原料のヘキシトールに対するケトヘキソース
の生成率は、いずれも約９０％以上であった。原料のヘ
キシトールと生産物のケトヘキソースとの関係を表７に
まとめた。
【００５０】
【表７】
【００５１】
【実施例６ ケトヘキソースからヘキシトールの製造】
実験１の方法で調製したリビトール脱水素酵素活性を有
する微生物を用いて、ケトヘキソースからヘキシトール
を製造した。０．１Ｍケトヘキソース溶液１００ｍｌを
５００ｍｌ容三角フラスコにとり、ｐＨ約９乃至１０に
維持しつつ、これに実験１の方法で得たリビトール脱水
素酵素活性を有するエンテロバクター・アグロメランス
の洗浄菌体５ｇを加え、３０℃で１０時間、窒素ガスを
通気した嫌気的条件に保って反応させた。得られる反応
液を遠心分離して不溶物を除去し、上清を高速液体クロ
マトグラフィーで分析した。原料のケトヘキソースに対
するケトヘキシトールの生成率は、いずれも約９０％以
上であった。原料のケトヘキソースと生産物のヘキシト
ールとの関係を表８にまとめた。
実験１の方法で調製したリビトール脱水素酵素活性を有
する微生物を用いて、ケトヘキソースからヘキシトール
を製造した。０．１Ｍケトヘキソース溶液１００ｍｌを
５００ｍｌ容三角フラスコにとり、ｐＨ約９乃至１０に
維持しつつ、これに実験１の方法で得たリビトール脱水
素酵素活性を有するエンテロバクター・アグロメランス
の洗浄菌体５ｇを加え、３０℃で１０時間、窒素ガスを
通気した嫌気的条件に保って反応させた。得られる反応
液を遠心分離して不溶物を除去し、上清を高速液体クロ
マトグラフィーで分析した。原料のケトヘキソースに対
するケトヘキシトールの生成率は、いずれも約９０％以
上であった。原料のケトヘキソースと生産物のヘキシト
ールとの関係を表８にまとめた。
【００５２】
【表８】
【００５３】
【実施例７ ケトヘキソースからヘキシトールの製造】
実験１の方法で調製したリビトール脱水素酵素活性を有
する微生物のトルエン処理菌体を用いて、本菌の有する
アルコール脱水素酵素と共役反応させることによりケト
ヘキソースからヘキシトールを製造した。実験１の方法
で用いたリビトール脱水素酵素活性を有するエンテロバ
クター・アグロメランスの洗浄菌体５ｇを含む１００ｍ
ｌの水溶液にトルエン５ｍｌ添加し、３０℃にて１０分
間振盪しトルエン処理を行った後、遠心分離により水で
洗浄し、トルエン処理菌体を得た。０．１Ｍケトヘキソ
ース溶液１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコにと
り、ＮＡＤ+及びエタノールを最終濃度がそれぞれ０．
５ｍＭ及び５％となるように加え、ｐＨ約９乃至１０に
維持しつつ、これに前述のトルエン処理菌体５ｇを加
え、３０℃で１０時間反応させた。得られる反応液を遠
心分離して不溶物を除去し、上清を高速液体クロマトグ
ラフィーで分析した。原料のケトヘキソースに対するヘ
キシトールの生成率は、いずれも約９０％以上であっ
た。原料のケトヘキソースと生産物のヘキシトールとの
関係は表８と同じである。
実験１の方法で調製したリビトール脱水素酵素活性を有
する微生物のトルエン処理菌体を用いて、本菌の有する
アルコール脱水素酵素と共役反応させることによりケト
ヘキソースからヘキシトールを製造した。実験１の方法
で用いたリビトール脱水素酵素活性を有するエンテロバ
クター・アグロメランスの洗浄菌体５ｇを含む１００ｍ
ｌの水溶液にトルエン５ｍｌ添加し、３０℃にて１０分
間振盪しトルエン処理を行った後、遠心分離により水で
洗浄し、トルエン処理菌体を得た。０．１Ｍケトヘキソ
ース溶液１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコにと
り、ＮＡＤ+及びエタノールを最終濃度がそれぞれ０．
５ｍＭ及び５％となるように加え、ｐＨ約９乃至１０に
維持しつつ、これに前述のトルエン処理菌体５ｇを加
え、３０℃で１０時間反応させた。得られる反応液を遠
心分離して不溶物を除去し、上清を高速液体クロマトグ
ラフィーで分析した。原料のケトヘキソースに対するヘ
キシトールの生成率は、いずれも約９０％以上であっ
た。原料のケトヘキソースと生産物のヘキシトールとの
関係は表８と同じである。
【００５４】
【実施例８ Ｌ−タガトースの製造】実施例５の方法に
準じて、０．１Ｍ Ｌ−タリトール１ｌにリビトール脱
水素酵素活性を有する微生物の洗浄菌体２５ｇを加え、
好気的条件下で３０℃、１６時間反応させ、Ｌ−タリト
ールをＬ−タガトースに変換させた。次いで、反応液を
遠心分離して不溶物を除去し、この上清を常法に従っ
て、活性炭で脱色し、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂で脱
塩精製し、更に濃縮し、無水エタノールを加えて、Ｌ−
タガトースの結晶を、晶出させ、これを濾別して採取
し、更にこれを少量の水に溶解、再結して高純度のＬ−
タガトースの結晶を得た。本Ｌ−タガトース結晶のＬ−
タリトールに対する収率は、約８５％であった。本品
は、甘味料、品質改良剤、保湿剤などとして食品、化粧
品、医薬品などに有利に利用できる。
準じて、０．１Ｍ Ｌ−タリトール１ｌにリビトール脱
水素酵素活性を有する微生物の洗浄菌体２５ｇを加え、
好気的条件下で３０℃、１６時間反応させ、Ｌ−タリト
ールをＬ−タガトースに変換させた。次いで、反応液を
遠心分離して不溶物を除去し、この上清を常法に従っ
て、活性炭で脱色し、Ｈ型、ＯＨ型イオン交換樹脂で脱
塩精製し、更に濃縮し、無水エタノールを加えて、Ｌ−
タガトースの結晶を、晶出させ、これを濾別して採取
し、更にこれを少量の水に溶解、再結して高純度のＬ−
タガトースの結晶を得た。本Ｌ−タガトース結晶のＬ−
タリトールに対する収率は、約８５％であった。本品
は、甘味料、品質改良剤、保湿剤などとして食品、化粧
品、医薬品などに有利に利用できる。
【００５５】
【発明の効果】上記から明らかなように、本発明のリビ
トール脱水素酵素は、多種の糖質変換に有利に利用さ
れ、しかも、必ずしも高度に精製して作用させる必要も
なく、希少糖質の工業生産に有利に利用することができ
る。本発明によって、従来極めて入手困難であった多種
類の希少糖質を容易に提供できることとなり、それが与
える影響は、食品、化粧品、医薬品、化学工業など多方
面に及ぶことが期待され、その工業的意義は極めて大き
い。
トール脱水素酵素は、多種の糖質変換に有利に利用さ
れ、しかも、必ずしも高度に精製して作用させる必要も
なく、希少糖質の工業生産に有利に利用することができ
る。本発明によって、従来極めて入手困難であった多種
類の希少糖質を容易に提供できることとなり、それが与
える影響は、食品、化粧品、医薬品、化学工業など多方
面に及ぶことが期待され、その工業的意義は極めて大き
い。
【図１】エンテロバクター・アグロメランス由来のリビ
トール脱水素酵素の活性に及ぼす温度の影響を示す図で
ある。
トール脱水素酵素の活性に及ぼす温度の影響を示す図で
ある。
【図２】エンテロバクター・アグロメランス由来のリビ
トール脱水素酵素の活性に及ぼすｐＨの影響を示す図で
ある。
トール脱水素酵素の活性に及ぼすｐＨの影響を示す図で
ある。
【図３】エンテロバクター・アグロメランス由来のリビ
トール脱水素酵素の温度安定性を示す図である。
トール脱水素酵素の温度安定性を示す図である。
【図４】エンテロバクター・アグロメランス由来のリビ
トール脱水素酵素のｐＨ安定性を示す図である。
トール脱水素酵素のｐＨ安定性を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (14)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するリビトール
脱水素酵素。 （１） 作用 ＮＡＤ+共存下でリビトールに作用させるとＤ−リブロ
ースを生成し、ＮＡＤＨ共存下でＤ−リブロースに作用
させるとリビトールを生成する。 （２） 基質特異性 基質特異性は低く、リビトールのみならず、アリトー
ル、Ｌ−アラビトール、Ｌ−マンニトール、キシリトー
ル、Ｌ−ソルビトール、Ｌ−タリトール、Ｌ−イディト
ール、Ｄ−ソルビトール、ガラクチトール及びエリスリ
トールの糖アルコールにも作用する。これら糖アルコー
ルは、ＮＡＤ+共存下で、その第２位の炭素のアルコー
ル基がケト基に酸化されケトースになる。 （３） 分子量 ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、約２０，０００乃至３０，０００
ダルトンを示す。ゲル濾過法で、約７１，０００乃至８
１，０００ダルトンを示す。 （４） 等電点 等電点電気泳動法で、ｐＩ約４．４乃至５．４を示す。 （５） 活性阻害 １ｍＭ Ｃａ2+では活性を阻害せず、１ｍＭ Ａｇ2+で
は活性を阻害する。 （６） 至適温度 ｐＨ１０、１分間反応で、約５０乃至６０℃を示す。 （７） 至適ｐＨ ３０℃、１分間反応で、ｐＨ約９乃至１０を示す。 （８） 温度安定性 ｐＨ１０、１０分間保持で、３０℃付近まで安定。 （９） ｐＨ安定性 ４℃、２４時間保持で、ｐＨ約９乃至１１を示す。 - 【請求項２】 リビトール脱水素酵素が、エンテロバク
ター属に属する微生物由来の酵素である請求項１記載の
リビトール脱水素酵素。 - 【請求項３】 リビトール脱水素酵素産生能を有するエ
ンテロバクター属に属する微生物を培養し、培養物から
請求項１記載のリビトール脱水素酵素を採取することを
特徴とするリビトール脱水素酵素の製造方法。 - 【請求項４】 微生物が、エンテロバクター・アグロメ
ランス ２２１ｅ（ＦＥＲＭ ＢＰ−４７００）である
請求項３記載のリビトール脱水素酵素の製造方法。 - 【請求項５】 リビトール脱水素酵素産生能を有するエ
ンテロバクター・アグロメランス ２２１ｅ（ＦＥＲＭ
ＢＰ−４７００）。 - 【請求項６】 糖アルコール含有溶液に、ＮＡＤ+共存
下で請求項１又は２記載のリビトール脱水素酵素を作用
させて、該糖アルコールを酸化してケトースを生成させ
るか、又はケトース含有溶液にＮＡＤＨ共存下で該リビ
トール脱水素酵素を作用させて、該ケトースを還元して
糖アルコールを生成させることを特徴とする糖アルコー
ルとケトースとの変換方法。 - 【請求項７】 糖アルコール含有溶液に、ＮＡＤ+共存
下で請求項１又は２記載のリビトール脱水素酵素を作用
させて、該糖アルコールを酸化してケトースを生成させ
るに際し、他の酸化還元酵素とその酸化型基質を共存さ
せるか、又は、ケトース含有溶液にＮＡＤＨ共存下で該
リビトール脱水素酵素を作用させて該ケトースを還元し
て糖アルコールを生成させるに際し、他の酸化還元酵素
とその還元型基質を共存させて、リビトール脱水素酵素
と他の酸化還元酵素とを共役反応させることを特徴とす
る糖アルコールとケトースとの変換方法。 - 【請求項８】 糖アルコール含有溶液に、好気的条件下
で、請求項１又は２記載のリビトール脱水素酵素活性を
有する微生物を接触せしめ、該糖アルコールを酸化して
ケトースを生成させるか、又はケトース含有溶液に、嫌
気的条件下で、該リビートル脱水素酵素活性を有する微
生物を接触せしめ、該ケトースを還元して糖アルコール
を生成させることを特徴とする糖アルコールとケトース
との変換方法。 - 【請求項９】 糖アルコール含有溶液に、請求項１又は
２記載のリビトール脱水素酵素活性を有する微生物を接
触せしめ、該糖アルコールを酸化してケトースを生成さ
せるに際し、該微生物が保有する他の酸化還元酵素のた
めの酸化型基質を共存させるか、又は、ケトース含有溶
液に該リビトール脱水素酵素活性を有する微生物を接触
せしめ、該ケトースを還元して糖アルコールを生成させ
るに際し、該微生物が保有する他の酸化還元酵素のため
の還元型基質を共存させて、リビトール脱水素酵素と他
の酸化還元酵素とを共役反応させることを特徴とする糖
アルコールとケトースとの変換方法。 - 【請求項１０】 糖アルコールが、リビトール、アリト
ール、Ｌ−アラビトール、Ｌ−マンニトール、キシリト
ール、Ｌ−ソルビトール、Ｌ−タリトール、Ｌ−イディ
トール、Ｄ−ソルビトール、ガラクチトール及びエリス
リトールから選ばれる糖アルコールであることを特徴と
する請求項６、７、８又は９記載の糖アルコールとケト
ースとの変換方法。 - 【請求項１１】 糖アルコール含有溶液に、ＮＡＤ+共
存下で、請求項１又は２記載のリビトール脱水素酵素を
作用させるか、又は、好気的条件下で該リビトール脱水
素酵素活性を有する微生物を接触せしめ、該糖アルコー
ルを酸化して生成するケトースを採取することを特徴と
するケトースの製造方法。 - 【請求項１２】 糖アルコールが、リビトール、アリト
ール、Ｌ−アラビトール、Ｌ−マンニトール、キシリト
ール、Ｌ−ソルビトール、Ｌ−タリトール、Ｌ−イディ
トール、Ｄ−ソルビトール、ガラクチトール及びエリス
リトールから選ばれる糖アルコールであることを特徴と
する請求項１１記載のケトースの製造方法。 - 【請求項１３】 ケトース含有溶液に、ＮＡＤＨ共存下
で、請求項１又は２記載のリビトール脱水素酵素を作用
させるか、又は、嫌気的条件下で該リビトール脱水素酵
素活性を有する微生物を接触せしめ、該ケトースを還元
して生成する糖アルコールを採取することを特徴とする
糖アルコールの製造方法。 - 【請求項１４】 糖アルコールが、リビトール、アリト
ール、Ｌ−アラビトール、Ｌ−マンニトール、キシリト
ール、Ｌ−ソルビトール、Ｌ−タリトール、Ｌ−イディ
トール、Ｄ−ソルビトール、ガラクチトール及びエリス
リトールから選ばれる糖アルコールであることを特徴と
する請求項１３記載の糖アルコールの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6218155A JPH0856659A (ja) | 1994-08-20 | 1994-08-20 | リビトール脱水素酵素とその製造方法並びに用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6218155A JPH0856659A (ja) | 1994-08-20 | 1994-08-20 | リビトール脱水素酵素とその製造方法並びに用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0856659A true JPH0856659A (ja) | 1996-03-05 |
Family
ID=16715506
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6218155A Pending JPH0856659A (ja) | 1994-08-20 | 1994-08-20 | リビトール脱水素酵素とその製造方法並びに用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0856659A (ja) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2762011A1 (fr) * | 1997-04-11 | 1998-10-16 | Roquette Freres | Procede de preparation de ribitol par voie fermentaire et souche de microorganismes mise en oeuvre dans ce procede |
| EP1083234A4 (en) * | 1998-05-27 | 2004-09-29 | Mitsubishi Chem Corp | METHOD FOR PRODUCING L-RIBOSE. |
| US7137903B2 (en) | 2004-04-21 | 2006-11-21 | Acushnet Company | Transitioning hollow golf clubs |
| WO2008062780A1 (en) | 2006-11-20 | 2008-05-29 | National University Corporation Kagawa University | Deoxyketohexose isomerase and method for producing deoxyketohexose and derivative thereof using the same |
| WO2008062570A1 (fr) | 2006-11-20 | 2008-05-29 | National University Corporation Kagawa University | Micro-organisme capable de produire une désoxy polyol déshydrogénase et utilisation de celui-ci |
| US7942760B2 (en) | 2004-04-21 | 2011-05-17 | Cobra Golf Incorporated | Transitioning hollow golf clubs |
| WO2014171636A1 (ko) * | 2013-04-17 | 2014-10-23 | 건국대학교 산학협력단 | 신규 리비톨 탈수소화효소 및 이를 이용한 ｌ－리불로스의 생산방법 |
| KR102276305B1 (ko) | 2020-02-07 | 2021-07-12 | 대구대학교 산학협력단 | 신규 리비톨 탈수소효소 및 이를 이용한 d-리불로스 제조방법 |
| WO2022181610A1 (ja) * | 2021-02-26 | 2022-09-01 | 国立大学法人香川大学 | アリトールからｄ－アルロースを製造する微生物およびそれを用いるｄ－アルロースの製造方法 |
| WO2023063337A1 (ja) * | 2021-10-12 | 2023-04-20 | 国立大学法人香川大学 | 実質上純粋なｄ－タリトールまたはアリトールの製造方法 |
-
1994
- 1994-08-20 JP JP6218155A patent/JPH0856659A/ja active Pending
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| WO2008062570A1 (fr) | 2006-11-20 | 2008-05-29 | National University Corporation Kagawa University | Micro-organisme capable de produire une désoxy polyol déshydrogénase et utilisation de celui-ci |
| JP5344466B2 (ja) * | 2006-11-20 | 2013-11-20 | 国立大学法人 香川大学 | デオキシポリオール脱水素酵素産生能を有する微生物およびその利用 |
| KR101348327B1 (ko) * | 2006-11-20 | 2014-01-08 | 고쿠리츠다이가쿠호우징 카가와다이가쿠 | 데옥시폴리올 탈수소효소 생산능을 가진 미생물 및 그 이용 방법 |
| WO2014171636A1 (ko) * | 2013-04-17 | 2014-10-23 | 건국대학교 산학협력단 | 신규 리비톨 탈수소화효소 및 이를 이용한 ｌ－리불로스의 생산방법 |
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| WO2023063337A1 (ja) * | 2021-10-12 | 2023-04-20 | 国立大学法人香川大学 | 実質上純粋なｄ－タリトールまたはアリトールの製造方法 |
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