JPH0716428B2

JPH0716428B2 - Ｌ−アミノ酸の製造法

Info

Publication number: JPH0716428B2
Application number: JP61244055A
Authority: JP
Inventors: 泰久浅野; 章子仲沢; 果生里遠藤; 憲次平井; 長徳沼尾
Original assignee: Sagami Chemical Research Institute (Sagami CRI)
Current assignee: Sagami Chemical Research Institute (Sagami CRI)
Priority date: 1985-12-05
Filing date: 1986-10-16
Publication date: 1995-03-01
Anticipated expiration: 2010-03-01
Also published as: JPS62244386A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明はα−ケトカルボン酸を基質としてＬ−アミノ酸
を製造する方法に関する。

〔従来の技術〕

従来から微生物や酵素の働きによりα−ケトカルボン酸
を基質としてＬ−アミノ酸を製造する試みがなされてい
る。例えば、微生物菌体にα−ケトグルタール酸および
各種のアミノ酸を添加してＬ−グルタミン酸を蓄積せし
める方法（片桐ら、アミノ酸核酸、２、18（1960）〕、
フェニルピルビン酸を含む反応液にＬ−グルタミン酸や
Ｌ−アスパラギン酸を添加し、Ｌ−フェニルアラニンを
得る方法〔朝井ら、アミノ酸核酸、２、114（196
0）〕、15インドールピルビン酸を含む反応液にＬ−グ
ルタミン酸やＬ−アスパラギン酸を添加してＬ−トリプ
トファンを合成する方法等がある〔アイダら、ジャーナ
ル・オブ・ジェネラル・アンド・アプライド・マイクロ
バイオロジー〔Journal of General and Applied Micro
biology）、４、200（1958）〕。

特開昭60−164493には、種々の微生物をフェニルピルビ
ン酸及びアミノ基供与体と共に培養するか、又は該微生
物の菌体もしくはその処理物をフェニルピルビン酸及び
アミノ基供与体に作用せしめることによってＬ−フェニ
ルアラニンを製造する方法が記載されている。しかしな
がらこの明細書には、この方法においていかなる酵素が
関与するかについてはなんら言及されていない。またこ
の方法においてはアミノ基供与体としてアミノ酸が使用
されている。

上記の方法はいずれも目的アミノ酸のアミノ基供与体と
して他のアミノ酸が使用されており、アンモニウムイオ
ンを用いる本発明とは基本的に異り、関与する酵素も異
る。また、これらの方法はアミノ基供与体としてアミノ
酸を使用するため目的アミノ酸が高価なものとなるとい
う難点を有する。

特開昭60−43391には、α−ケト酸をその対応するＬ−
アミノ酸に転換することができる微生物を培養し、この
過程でα−ケト酸を培養物に供給してこれをＬ−アミノ
酸に転換せしめることによりＬ−アミノ酸を製造する方
法が記載されている。この明細書には反応機構が示唆さ
れているが、それによれば、α−ケト酸から目的Ｌ−ア
ミノ酸を生成せしめる場合のアミノ基供与体としてＬ−
グルタメートが使われ、従ってこの反応はアノミ基転換
酵素により行われる。また、この明細書中に開示されて
いる微生物はブレビバクテリウム（Brevibacterium）、
コリネバクテリウム（Corynebacterium）及び大腸菌の
みである。

特開昭59−198972にはＬ−フェニルアラニンデヒドロゲ
ナーゼ及びこの酵素を利用するＬ−α−アミノカルボン
酸の製造方法が記載されている。しかしながらこの公開
された明細書に記載されているＬ−フェニルアラニンデ
ヒドロゲナーゼはブレビバクテリウム（Brevibacteriu
m）属細菌により生産されたものであり、この明細書に
はスポロサルシナ（Sporosarcina）属細菌及びバシルス
（Bacilluc）属細菌が同様の酵素を生産することは全く
示唆されていない。

特開昭60−160890には、種々の微生物を、エネルギー
源、無機アンモニウム化合物又は尿素、及び酵素の存在
下で、フェニルピルビン酸と共に培養するか、あるいは
微生物の培養物又はその処理物を、エネルギー源、無機
アンモニウム化合物又は尿素、及び酸素の存在下で、フ
ェニルピルビン酸に作用せしめることによりＬ−フェニ
ルアラニンを製造する方法が記載されている。しかしな
がら、この明細書には、上記の過程でいかなる酵素が関
与するかは全く示唆されておらず、反応系にエネルギー
源、及び酸素の両者が必要であることから、多数のエネ
ルギー供給系酵素が関与する、発酵的方法であると予想
される。また、この明細書にはスポロサルシナ属細菌に
ついてはなんら記載されていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って、本発明は、本発明者等が見出した新規酵素であ
るバシルス（Bacilluc）属又はスポロサルシナ（Sporos
arcina）属細菌由来のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素
を用いて酵素的方法により、あるいはスポロサルシナ属
細菌を用いる方法によりＬ−アミノ酸を製造する方法を
提供しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕本発明者等はすでにバシルス属又はスポロサルシナ属細
菌が生産するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素及びその
製造方法、並びに該酵素を使用するＬ−フェニルアラニ
ンの製造方法の発明を完成している（特願昭60−08029
3、及び特願昭60−127118）。これらの酵素の基質特異
性を酸化的脱アミノ化について測定した場合、スポロサ
ルシナ属細菌により生産される酵素はＬ−フェニルアラ
ニン以外のＬ−アミノ酸にはきわめてわずかしか反応せ
ず、またバシルス属細菌により生産される酵素はＬ−フ
ェニルアラニン及びＬ−チロシン以外のＬ−アミノ酸に
は極めてわずかしか反応しない。しかしながら、本発明
者等は、これらの酵素の基質特異性をさらに詳細に検討
した結果、これらの酵素は還元的アミノ化反応について
は相当に広い基質特異性を有することを見出し、この知
見に基いてこの発明を完成した。

従って、この発明は、バシルス（Bacillus）属細菌又は
スポロサルシナ（Sporosarcina）属細菌によって生産さ
れるＬ−フェニルアラニン脱水素酵素又は酵素含有物の
存在下で、次の式（Ｉ）（式中、R₁は水素又はメチル基であり、R₂は置換基を有
する場合がある炭素原子数１〜４個の直鎖もしくは分岐
鎖のアルキル基、又は置換基を有する場合がある芳香族
基である）で表わされるα−ケトカルボン酸、アンモニウムイオン
及びNADHを反応せしめることにより、次の式（II）（式中Ｒは前記の意味を有する）で表わされるＬ−アミノ酸を生成せしめ、このアミノ酸
を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法、
並びにスポロサルシナ属に属する細菌の培養物、菌体又
は菌体処理物をアンモニウムイオン及びエネルギー源の
存在下で式（Ｉ）のα−ケトカルボン酸と反応せしめる
ことにより式（II）のＬ−アミノ酸を生成せしめ、これ
を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法を
提供するものである。

本発明において使用することができる微生物としては、
スポロサルシナ属又はバシルス属に属する細菌を挙げる
ことができる。

スポロサルシナ属に属する微生物としては、スポロサル
シナ・ウレアエを挙げることができる。具体的な菌株と
して、例えばスポロサルシナ・ウレアエIFO 12698、及
びスポロサルシナ・ウレアエIFO 12699（ATCC 6473）、
並びにスポロサルシナ・ウレアエSCRC−RO4を挙げるこ
とができる。前記の保存菌はそれぞれ前記寄託番号のも
とにIFO又はATCCから自由に入手することができ、また
スポロサルシナ・ウレアエSCRC−RO4は工業技術院微生
物工業技術研究所に微工研菌寄第8178号（FERM P−817
8）として寄託され、微工研条寄第1012号（FERM BP−10
12）としてブタペスト条約に基く国際寄託に移管され
た。このSCRC−RO4株は、好気性で運動性及び胞子形成
能を有し、グラム陽性の２連〜４連の球菌であること等
から、バージイズ・マニュアル・オブ・ディターミネイ
ティブ・バクテリオロジー（Bergey′s Manual of Dete
r−minative Bacteriology）第８版、1974年の分類基準
に従って同定されたものであり、その詳細な菌学的性質
は特願昭60−080293明細書に記載されている。

バシルスに属する微生物としては、例えばバシルス・ア
ルベイ（Bacillus alvei）IFO 3343;バシルス・チアミ
ノリティカス（Bacillus thiaminolyticus）IAM 1034、
微工研菌寄第8528号（FERM P−8528）；バシルス・バデ
ィウス（Basillus badius）IAM 11059（ATCC 14574）微
工研菌寄第8259号（FERM P−8529）；バシルス・スフェ
リカスIFO 12622;バシルス・スフェリカス（Bacillus s
phaericus）IAM 1228、微工研菌寄第8527号（FERM P−8
527）を挙げることができる。

これらはいずれもIFOカタログ、ATCCカタログ、又はJFC
Cカタログに記載されており、容易に入手することがで
きる。また、本発明者等が最近土壌より分離した新菌株
バシルスsp.SCRC−R53b、バシルスsp.SCRC−R79a、バシ
ルスsp.SCRC−101A、及びバシルスsp.SCRC−114Dを挙げ
ることができる。これらの菌株の菌学的性質は非常に近
似しており、これらの代表株としてバシルスsp.SCRC−R
79aが工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第8
179号（FERM P−8179）として寄託され、微工研条寄第1
013号（FERM BP−1013）としてブタペスト条約に基く国
際寄託に移管された。またバシルスsp.SCRC−114Dが微
工研条寄第1011号としてブタペスト条約に基き国際寄託
されている。SCRC−R53b、SCRC−R79a、SCRC−101A、及
びSCRC−114D株はいずれもグラム陽性の桿菌で内生胞子
を形成し、カタラーゼの生成が認められることからバシ
ルス属に属するものと同定された。これらの菌株の詳細
な菌学的性質は特願昭60−080293号明細書に記載されて
いる。

なお、これらの菌に変異を生じさせて一層生産性の高い
菌株を得ることもできる。また、これらの菌株の細胞中
に存在するＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の生産に関
与する遺伝子を切り出し、これを適切なベクター例えば
プラスミドに挿入し、このベクターを用いて適当な宿
主、例えばエッシェリッヒャ・コリ（Eshcerichia col
i）や酵母のごとき異種宿主、又はバシルス属菌株もし
くはスポロサルシナ属菌株のごとき同種宿主を形質転換
することにより、本発明の方法においてＬ−フェニルア
ラニン脱水素酵素生産株を人為的に創成することもでき
る。

本発明の方法において使用するＬ−フェニルアラニン脱
水素酵素は例えば次の性質を有する。

A.スポロサルシナ・ウレアエSCRC−RO4により生産され
る酵素（１）作用：次式に示す反応を触媒する。

Ｌ−フェニルアラニン＋NAD⁺＋H₂O フェニルピルビン酸＋NADH＋NH₃＋H⁺ （２）基質特異性：本酵素は酸化的脱アミノ化について
測定した場合Ｌ−フェニルアラニン以外のＬ−アミノ酸
には極めてわずかにしか反応しない。

（３）至適pH:酸化的脱アミノ化反応ではpH10.5付近が
至適であり、還元的アミノ化反応では9.0付近が至適で
ある。

（４）pH安定性：各pHの緩衝液（0.05M）中30℃にて１
時間保温した後の残存活性を酸化的脱アミノ化について
測定した場合、pH9付近において安定である。

（５）至適温度:40℃付近における活性が最大である。

（６）温度安定性:0.1Mグリシン−NaOH緩衝液（pH9.0）
中、各温度において10分間処理した後の残存活性を酸化
的脱アミノ化反応について測定したところ、42℃におい
て活性の半分を失う。

（７）吸収スペクトル:278nmに極大吸収、283nm付近に
肩を有する。可視部の吸収は認められない。

（８）金属イオン、阻害剤の影響：銀、水銀等の金属イ
オン、およびPCMB、Ｎ−エチルマレイミド5,5′−ジチ
オ−ビス（２−ニトロ安息香酸）等のSH阻害剤によって
活性が阻害される。

（９）等電点：アンホラインを用いる焦点電気泳動によ
り測定した場合5.3〜5.4である。

（10）分子量：高速液体クロマトグラフィー（TSK 3000
SW）により約290,000と算出される。

（11）サブユニットの分子量:SDS−ポリアクリルアミド
ゲルディスク電気泳動により約38,000〜39,000と算出さ
れる。

B.バシルスsp.SCRC−R79aにより生産される酵素（１）作用：次式に示す反応を触媒する。

Ｌ−フェニルアラニン＋NAD⁺＋H₂O フェニルピルビン酸＋NADH＋NH₃＋H⁺ （２）基質特異性：本酵素は酸化的脱アミノ化について
測定した場合、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン
以外のＬ−アミノ酸には極めてわずかにしか反応しな
い。

（３）至適pH:酸化的脱アミノ化反応ではpH10.6〜11.3
付近が至適であり、還元的アミノ化反応ではpH9.8〜10.
8付近が至適である。

（４）pH安定性：各pHの緩衝液（0.05M）中30℃にて１
時間保温した後の残存活性を酸化的脱アミノ化について
測定した場合、pH4〜11.3の範囲で安定であり、特にpH9
〜11の範囲で安定であった。

（５）至適温度:50℃付近における活性が最大である。

（６）温度安定性:0.1Mグリシン−NaOH緩衝液（pH9.
0）、及び0.1Mグリシン−KCl−KOH緩衝液（pH11.0）
中、各温度において10分間処理した後の残存活性を酸化
的脱アミノ化反応について測定する場合、pH9.0におい
ては57℃で活性が半減し、pH11.0においては48℃で活性
が半減する。

（８）金属イオン、阻害剤の影響：銀、水銀等の金属イ
オン、およびPCMBによって活性が阻害される。

（９）等電点：アンホラインを用いる焦点電気泳動によ
り測定した場合4.3〜4.4である。

酵素の力価の測定法は大島ら〔ザ・ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー〔Journal of Biologica
l Chemistry）253,5719（1978）の方法に準じで行な
い、25℃におけるNADHの増加を340nmの吸光度の増加と
して計測し、１分間当り１マイクロモルのNADHを増加せ
しめる酵素量を１単位とする。

本発明で用いる微生物を培養しようとする場合、微生物
が増殖しＬ−フェニルアラニン脱水素酵素を生産し得る
もの、又はα−ケトカルボン酸のＬ−アミノ酸への変換
を行うことができるものであればいずれの培地でもよ
い。詳しくは、この培地は、窒素源として例えば酵母エ
キス、ペプトン、肉エキス等の１種類又は複数種類を含
有する。また、この培地には必要に応じて炭素源として
グルコース、澱粉、グリセリン等を加えることができ
る。この培地には無機塩類、例えばリン酸二カリウム、
塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等を加えることが好
ましい。

培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いて行っても
よいが、液体培地を用い、振とう培養、通気、撹拌培養
等により好気的条件下で培養を行うのが好ましい。培養
温度は菌が成育する温度範囲内であればいずれの温度で
も良いが、好ましくは25〜45℃である。pH6〜11、好ま
しくは７〜10の範囲である。培養時間は好ましくは６〜
48時間である。

得られた培養物からＬ−フェニルアラニン脱水素酵素を
採取する場合、精製法として通常の酵素精製法を用いる
ことが出来る。遠心分離等によって菌体を集め、超音波
処理、ダイノミル等の機械的方法によって菌体を破砕す
る。細胞片などの固形物を遠心分離などによって除き、
粗酵素を得、さらにこれを硫酸プロタミン又は硫酸スト
レプトマイシンを加えて処理を行い、塩析、有機溶媒沈
澱、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を行い、さらに
硫酸アンモニウム等の塩やポリエチレングリコール等の
添加により結晶化等の公知の方法によって均一の結晶酵
素標品を単離することができる。

本発明のＬ−アミノ酸の製造方法においては、スポロサ
ルシナ属細菌又はバシルス属細菌によって生産されるＬ
−フェニルアラニン脱水素酵素の存在下でα−ケトカル
ボン酸、NADH及びアンモニウムイオンを反応せしめるこ
とによりＬ−アミノ酸を生成せしめ、該Ｌ−アミノ酸を
採取する。

前記のα−ケトカルボン酸としては、例えばフェニルピ
ルピン酸、４−ヒドロキシフェニルピルビン酸、２−フ
ルオロフェニルピルビン酸、３−フルオロフェニルピル
ビン酸、４−フルオロフェニルピルビン酸、3,4−ジフ
ルオロフェニルピルビン酸、２−クロロフェニルピルビ
ン酸、３−クロロフェニルピルビン酸、４−クロロフェ
ニルピルビン酸、3,4−ジクロロフェニルピルビン酸、
４−メチルフェニルピルビン酸、４−ビニルフェニルピ
ルビン酸、４−メトキシフェニルピルビン酸、3,4−ジ
メキシフェニルピルビン酸、2,3,4−トリメトキシフェ
ニルピルビン酸、４−ニトロフェニルピルビン酸、４−
ジ（２−クロロエチル）アミノ−フェニルピルビン酸、
インドールピルビン酸、α−ケト−γ−メチルチオ酪
酸、α−ケト−γ−エチルチオ酪酸、α−ケトカプロン
酸、α−ケトイソカプロン酸、DL−α−ケト−β−メチ
ル吉草酸、α−ケト吉草酸、α−ケトイソ吉草酸、α−
ケト酪酸、３−（β−ナフチル）ピルビン酸、3,4−ジ
メチルフェニルピルビン酸、３−メトキシフェニルピル
ビン酸、α−ケト−γ−トリフルオロメチル酪酸等が挙
げられる。従って、これらのα−ケトカルボン酸を基質
として使用した場合、それぞれ、Ｌ−フェニルアラニ
ン、Ｌ−チロシン、２−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニ
ン、３−フルオロ−Ｌ−フェニルアラニン、４−フルオ
ロ−Ｌ−フェニルアラニン、3,4−ジフルオロ−Ｌ−フ
ェニルアラニン、２−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、
３−クロロ−Ｌ−フェニルアラニン、４−クロロ−Ｌ−
フェニルアラニン、3,4−ジクロロ−Ｌ−フェニルアラ
ニン、４−メチル−Ｌ−フェニルアラニン、４−ビニル
−Ｌ−フェニルアラニン、４−メトキシ−Ｌ−フェニル
アラニン、3,4−ジメトキシ−Ｌ−フェニルアラニン、
2,3,4−トリメトキシ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ニ
トロ−Ｌ−フェニルアラニン、４−ジ（２−クロロエチ
ル）アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファ
ン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−エチオニン、Ｌ−ノルロイシ
ン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ノルバリ
ン、Ｌ−バリン、α−アミノ−Ｌ−酪酸、３−（β−ナ
フチル）−Ｌ−アラニン、3,4−ジメチル−Ｌ−フェニ
ルアラニン、３−メトキシ−Ｌ−フェニルアラニン、α
−アミノ−γ−トリフルオロメチル−Ｌ−酪酸等が製造
される。

この方法において使用されるＬ−フェニルアラニン脱水
素酵素の使用形態は特に限定されない。例えば、精製さ
れた酵素を使用することができるのは無論のこと、細胞
を含有する培養液、培養生菌体、アセトン等によって脱
水処理された乾燥菌体、菌体破砕物、種々の段階まで精
製された部分精製酵素標品等の酵素含有物を使用するこ
とができる。さらにこれらの酵素又は酵素含有物を常法
に従って固定化したものを使用することもできる。工業
的な実施に当っては生菌体、アセトン処理菌体、固定化
菌体等を用いるのが有利である。

反応液中のＬ−フェニルアラニン脱水素酵素を含有する
微生物の培養液、菌体、菌体処理物あるいは酵素の量は
基質であるα−ケトカルボン酸又はその塩の濃度等によ
って異なり特に限定されないが、通常10〜10,000単位／
とするのが便利である。

基質としてα−ケトカルボン酸又はその塩、例えばナト
リウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩等を
使用することができる。α−ケトカルボン酸又はその塩
の添加量は、反応液中の前記酵素の濃度等により異なり
特に限定されないが、１〜500g/とするのが便利であ
る。低濃度で使用する場合には遊離酸の形で使用するこ
とができるが、比較的高濃度で使用する場合には塩の形
で使用するのがpH調製の観点から好ましい。例えば各種
のα−ケトカルボン酸のナトリウム塩は高濃度では完全
には溶解しないが、反応液中に未溶解のナトリウム塩が
存在していても差しつかえない。また、α−ケトカルボ
ン酸のアンモニウム塩又はα−ケトカルボン酸をアンモ
ニアで中和したものを使用することもでき、この場合こ
のアンモニウム塩はα−ケトカルボン酸の給源であると
同時に後に記載するアンモニウムイオンの給源としても
機能する。α−ケトカルボン酸又はその塩はバッチ式反
応においては反応開始時に一度に添加することもでき、
又反応の進行と共に複数回に分割して、もしくは連続的
に添加することもできる。

アンモニウムイオンの給源としてはアンモニウム塩、例
えば塩化アンモニウム又は硫酸アンモニウムの形で使用
するのが便利である。また、アンモニアガス又は水酸化
アンモニウム水溶液を、反応液のpHを所定値に維持しな
がら反応の進行と共に連続的に導入することも可能であ
る。前記のようにα−ケトカルボン酸のアンモニウム塩
を使用する場合にはこの物質がアンモニウムイオンの給
源としても機能する。アンモニウム塩の使用量はα−ケ
トカルボン酸の量と同モル量又はそれより多量とする。
この量は一般にα−ケトカルボン酸の量に対して１〜10
0培モル量とするのが便利である。アンモニウム塩のモ
ル量を多くすることによって酵素反応の平衡をＬ−アミ
ノ酸側に傾け、α−ケトカルボン酸に対するＬ−アミノ
酸の収率を上昇せしめることができる。

NADHは、α−ケトカルボン酸と等モルを加えてもよい
が、NADHは非常に高価であるから、工業的見地から、前
記の反応系のほかに、NADH再生系、すなわち前記反応に
より生成したNAD⁺をNADHに還元する系を共有させるのが
好ましい。このような系としてNAD⁺をNADHに変換する酵
素とその基質との組合わせ、例えば蟻酸脱水素酵素（EC
1.2.1.2）と蟻酸、Ｌ−グルタミン酸脱水素酸素（EC
1.4.1.2）とグルタミン酸、アルコール脱水素酵素（EC
1.1.1.1）とエタノール、アルデヒド脱水素酵素（EC 1.
2.1.3）とアセトアルデヒド、グルコース−６−リン酸
脱水素酵素（EC 1.1.1.49）とグリコース−６−リン酸
等を使用することができる。また、ヒドロゲナーゼ（EC
1.18.3.1.）による分子状水素を電子供与体とするNAD⁺
のNADHへの還元反応や、電気化学的に還元されたメチル
ビオローゲンやジヒドロリポアミドのジアホラーゼ（EC
1.6.4.3）による酸化に伴うNAD⁺のNADHへの還元反応を
も使用することができる。蟻酸脱水素酵素と蟻酸を使用
する場合、NAD⁺が還元されてNADHとなると同時に蟻酸が
酸化されて二酸化炭素が生成し、これは反応系から容易
に除去され、反応が常に所望の方向に進行するため特に
好ましい。蟻酸脱水素酵素は市販されており容易に入手
することができる。又、例えばカンジダ・ボイディニ
（Candida boidinii）No.2201（AKU 4705）や、ハンゼ
ヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）（ATCC26
012）から公知の方法〔カトウら、アグリカルチュラル
・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agri−cult
ural and Biological Chemistry）38,111〜116（197
4）〕により精製して使用することもできる。また蟻酸
脱水素酵素を菌体に含む形態で反応に供する場合、菌体
の前処理は公知の方法〔イズミら、ジャーナル・オブ・
ファーメンティション・テクノロジー〔Journal of Fer
mentation Technology）61,135（1983）〕の方法を用い
ることができる。

NADH再生系の酵素濃度は、Ｌ−フェニルアラニン脱水素
酵素濃度等に依存して異なり、一般に基質α−ケトカル
ボン酸の還元的アミノ化速度（従ってNAD⁺生成速度）に
匹敵する速度でNAD⁺をNADHに還元するために必要な量で
ある。例えば、前記のように10〜10,000単位／のＬ−
フェニルアラニン脱水素酵素を使用し、NADH再生系酵素
として蟻酸脱水素酵素を使用する場合、この酵素の使用
量は10〜10,000単位／程度とするのが好ましい。蟻酸
脱水素酵素の基質としては蟻酸の塩、例えば蟻酸ナトリ
ウム、蟻酸カリウム、蟻酸アンモニウム等を使用するの
が便利である。蟻酸塩の使用量はα−ケト酸又はその塩
の量の１〜２倍モル量とするのが好ましい。NADH再生系
を用いる場合は、NAD⁺又はNADHを通常の生理的濃度であ
る0.1〜10mM加えればよい。

Ｌ−アミノ酸の製造のために、増殖中の培養物、例えば
菌体を含む培養液、分離された生菌体、又は酵素系が破
壊されない程度に処理された菌体を使用する場合には、
NADH,NAD₊及びNADH再生系を加える必要はなく、エネル
ギー源として例えば糖類、アルコール類あるいは有機酸
類を菌体の培養液や菌体の反応液に加えれば良い。糖類
としては、アラビノース、リボース、リブロース、キシ
ロース、フコース、ラムノース、フラクトース、ガラク
トース、グルコン酸、トレハロース、グルコース、マン
ニトール、マンノース、ソルビトール、ソルボース、イ
ノシトール、ラクトース、マルトース、シュークロー
ス、ラフィノース、グリセロール、澱粉、イヌリン、グ
リコーゲン、カルボキシメチルセルロース等が挙げられ
る。アルコールとしてはエタノール、メタノール等が挙
げられる。有機酸としてはプロピオン酸、酢酸、蟻酸、
クエン酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、α−ケト
グルタール酸等が挙げられる。

反応媒体としては水、又はアセトン、アセトニトリル、
DMSO,DMFなどを含む水性液、例えば水性緩衝液を用いる
ことができる。緩衝液としては例えばトリス−HCl緩衝
液、グリシン−NaOH緩衝液等を使用することができる。

反応液のpHとしては、前記のNADH再生系を用いない場合
には、Ｌ−フェニルアラニン脱水素酵素による還元的ア
ミノ化に適するpHを用いることができ、例えばスポロサ
ルシナ属細菌由来の酵素を用いる場合にはpH8〜10、好
ましくはpH約９とし、バシルス属細菌由来の酵素を用い
る場合にはpH9〜11、好ましくはpH約10とする。α−ケ
トカルボン酸の還元的アミノ化系と共にNADH再生系を用
いる場合には、これら両者の反応が共に良好に進行する
pH範囲を選択する必要がある。このようなpHは、例え
ば、スポロサルシナ属細菌由来のＬ−フェニルアラニン
脱水素酵素とカンジダ・ボイディニ由来の蟻酸脱水素酵
素を用いる場合には通常はpH7.5〜9.5、好ましくはpH8.
0〜9.0である。また、バシルス属細菌由来のＬ−フェニ
ルアラニン脱水素酵素とガンジダ・ボイディニ由来の蟻
酸脱水素酵素を用いる場合には通常はpH8〜10好ましく
はpH8.5〜9.5である。

反応温度も、反応pHの場合と同様に考えることができる
が酵素のいずれの組合わせにおいても通常は20℃〜50
℃、好ましくは25℃〜40℃である。

反応時間は特に臨界的でなく、反応混合物の基質濃度、
酵素力価等に依存して、基質α−ケトカルボン酸が十分
な収率でＬ−アミノ酸に転換されるまで反応を維持す
る。

反応方式は回分式であっても連続式であってもよく、反
応時間はいずれの方式を用いるかにより異なる。

生成したＬ−アミノ酸は任意の常法に従って精製採取す
ることができる。例えば、反応終了後にトリクロロ酢酸
を加えて蛋白質を沈澱せしめ、菌体（存在する場合に
は）と共に濾去し、濾液をイオン交換樹脂等により精製
し、結晶化する。

Ｌ−アミノ酸の定量は、例えばロイコノストック・メセ
ンテロイデス（Leuconstoc mesenteroides）ATCC 8042
を用いるバイオアッセイにより行うことができ、またペ
ーパークロマトグラフィーにより展開し、ニンヒドリン
発色の後スポットを抽出し比色計で定量することも出来
る。

次に実施例によりこの発明をさらに具体的に説明する。

実施例１第１表〜第５表に記載する各種のα−ケト酸からそれぞ
れ対応するＬ−アミノ酸の合成を行なった。なお、表中
でＬ−フェニルアラニン脱水素酵素の状態で「粗酵素」
とは無細胞抽出液を硫安分画した酵素を意味し、「部分
精製酵素」とは、さらにDEAE−トヨパールカラムを通過
させた酵素を意味する。NAD⁺又はNADHの濃度は１ないし
20mMの濃度となるようにした。アンモニウムイオンは塩
化アンモニウム、蟻酸アンモニウム又はNH₄OH−NH₄Cl緩
衝液（pH9.0）として供給し、その濃度は0.05ないし0.5
Mの濃度となるようにした。蟻酸は蟻酸ナトリウム又は
蟻酸アンモニウムとして供給し、その量はα−ケトカル
ボン酸の１〜30当量とした。反応液のpHは8.5ないし９
であり、トリス−HCl緩衝液（pH8.5）又はNH₄OH−NH₄Cl
緩衝液（pH9.0）を0.05ないし0.5Mの濃度となるように
して用いた。反応は30℃で行なった。

なお、具体的には次の様にして反応を行い、後記の結果
を得た。

反応番号1. フェニルピルビン酸ナトリウム0.61g（3mmol）、Ｄ−フ
ラクトース0.54g（3mmol）、スポロサルシナ・ウレアエ
SCRC−RO4（微工研菌寄第8178号；微工研菌条寄第1012
号）の菌体（200molの培養液から菌体を遠心分離で集菌
し、生理的食塩水で１回洗浄した菌体）を含む50mlの反
応液を30℃で28時間静置した。反応液中のＬ−フェニル
アラニンの量を微生物定量法により測定したところ0.34
g（2.07mmol:69％の転換率）のＬ−フェニルアラニンが
生成していた。

反応番号2,8,30,34はこの例と同様に実験を行なった。

反応番号3. フェニルピルビン酸ナトリウム20.4mg（100μmol）、NA
D⁺2.5μmol、トリス−塩酸緩衝液（pH8.5）250μmo
l）、蟻酸アンモニウム2mmol、カンジダ・ボイディニN
o.2201風乾菌体5mg、スポロサルシナ・ウレアエSCRC−R
O4（微工研菌寄第8178号：微工研条寄第1012号）の菌体
（培養液25mlからの洗浄菌体）を含む5mlの反応液を30
℃で24時間反応させた。反応液中のＬ−フェニルアラニ
ン量を微生物定量法により測定したところ11.7mg（71μ
mol、71％の転換率）のＬ−フェニルアラニンが生成し
ていた。

反応番号9,21はこの例と同様に実験を行なった。

反応番号5. α−ケト−γ−メチルチオ酪酸ナトリウム17.02mg（100
μmol）、NADH76.3mg（100μmol）トリス−塩酸緩衝液
（pH8.5）250μmol、塩化アンモニウム107mg（2mmo
l）、スポロサルシナ・ウレアエSCRC−RO4（微工研菌寄
第8178号；微工研条寄第1012号）のＬ−フェニルアラニ
ン脱水素酵素0.5単位（硫安分画における30−60％飽和
画分）を含む5mlの反応液を30℃において24時間保温し
た。

反応液中のＬ−メチオニン量を微生物定量法により測定
したところ、10.02mg（67μmol）のＬ−メチオニンが生
成していた。反応番号16,35,37はこの例と同様に実験を
行なった。

反応番号7. α−ケト−γ−メチルチオ酪酸ナトリウム17.02mg（100
μmol）、蟻酸アンモニウム50mg（800μmol）、NAD⁺3.6
mg（５μmol）、トリス−塩酸緩衝液（pH8.5）250μmo
l、スポロサルシナ・ウレアエSCRC−RO4（微工研菌寄第
8178号；微工研条寄第1012号）のＬ−フェニルアラニン
脱水素酵素2.5単位（均一に精製された酵素標品）、お
よび粗蟻酸脱水素酵素0.5単位（pH8.5、カンジダ・ボイ
ディニNo.2201より部分精製）を含む5mlの反応液を30℃
において24時間保温した。微生物定量法により定量した
ところ13.05mg（85μmol）のＬ−メチオニンが生成して
いた。

反応番号 4,6,10,11,12,13,14,15,17,18,19,20,22,23,24,25,26,2
7,28,29,31,32,36,38,39,40はこの例と同様に実験を行
なった。

反応15においては反応液よりＬ−チロシンを結晶として
単離して以下の分析を行なった。元素分析値は以下のと
おりであった。

実測値（％）計算値（％）Ｃ 59.45 59.66 Ｈ 6.11 6.12 Ｎ 7.69 7.73 比旋光度▲〔α〕²⁵ _D▼＝−7.33.（ｃ＝4,6N HCl）でＬ体であり、光学純度は100％e.eである。マススペク
トル、核磁気共鳴吸収スペクトル、および赤外吸収スペ
クトルによる分析結果はいずれも、生成物がＬ−チロシ
ンであることを示した。

反応26においては反応液より４−ビニル−Ｌ−フェニル
アラニンを結晶として単離し、以下の分析を行なった。
元素分析値は次のとおりであった。

実測値（％）計算値（％）Ｃ 69.01 60.09 Ｈ 6.79 6.87 Ｎ 7.29 7.32 融点:190℃で分解した。

比旋光度▲〔α〕²⁰ _D▼＝−13.53（ｃ＝1.02,4N NaOH）であった。

マススペクトル、核磁気共鳴スペクトル、および赤外吸
収スペクトルによる、分析結果はいずれも、生成物が４
−ビニル−Ｌ−フェニルアラニンであることを示した。

反応27においては反応液により４−フルオロ−Ｌ−フェ
ニルアラニンを結晶として単離し、以下の分析を行なっ
た。

元素分析値は次のとおりであった。

実測値（％）計算値（％）Ｃ 58.92 59.01 Ｈ 5.47 5.50 Ｎ 7.64 7.65 融点:223〜226℃。

比旋光度▲〔α〕²⁰ _D▼＝−1.12（ｃ＝0.83,4N NaOH）であった。

マススペクトル、核磁気共鳴スペクトル、および赤外吸
収スペクトルによる分析結果はいずれも生成物が４−フ
ルオロ−Ｌ−フェニルアラニンであることを示した。

その他のＬ−アミノ酸の定量は微生物定量法によった。
反応13,14,19,20,24および25では有機溶媒を含む条件で
も反応が進行した。

結果を第１表〜第５表に要約する。表中、Ｕ数は使用し
た酵素の単位数を示す。

実施例２スポロサルシナ・ウレアエSCRC−RO4（微工研菌寄第817
8号；微工研条寄第1012号）、バシルス・スフェリカスS
CRC−R79a（微工研菌条寄第1013号）、バシルス・バデ
ィウスIAM 11059（微工研菌寄第8529）、およびカンジ
ダ・ボイディニNo.2201のアセトン処理菌体を用いてＬ
−フェニルアラニンの合成を行なった。NAD⁺の濃度は0.
5mMとした。アンモニウムイオンは蟻酸アンモニウム又
はNH₄OH−NH₄Cl緩衝液（pH8.5）として供給し、その濃
度は0.1ないし0.4Mの濃度となるようにした。蟻酸は蟻
酸ナトリウム又は蟻酸アンモニウムとして供給し、その
量はフェニルピルビン酸の１〜７当量とした。反応液の
pHは8.5であり、トリス−HCl緩衝液（pH8.5）又はNH₄OH
−NH₄Cl緩衝液（pH8.5）を0.05ないし0.4Mの濃度となる
ようにして用いた。反応は30℃で行なった。

なお、具体的には次の様にして反応を行ない後記の結果
を得た。

反応番号41. フェにルピルビン酸ナトリウム37.1mg（182μmol）、NA
D⁺1.5μmol、トリス−塩酸緩衝液（pH8.5）150μmol、
蟻酸アンモニウム1.2mmol、カンジダ・ボイディニNo.22
01のアセトン処理菌体30mg、スポロサルシナ・ウレアエ
SCRC−RO4（微工研菌寄第8178号；微工研条寄第1012
号）のアセトン処理菌体6mg（培養液3ml分）を含む3ml
の反応液を30℃で３時間反応させた。反応液中のフェニ
ルアラニン量を微生物定量法により測定したところ18.3
mg（111μmol、61％の転換率）のＬ−フェニルアラニン
が生成していた。

反応番号42ではバシルス・スフェリカスSCRC−R79a（微
工研条寄第1013号）の、反応番号45.ではバシルス・バ
ディウスIAM 11059（微工研菌寄第8529号）のアセトン
処理菌体を用いて、この例と同様に実験を行なった。

反応番号43. フェニルピルビン酸ナトリウム37.1mg（182μmol）、NA
D⁺1.5μmol、NH₄OH−NH₄Cl緩衝液（pH8.5）900μmol、
蟻酸ナトリウム400μmol、カンジダ・ボイディニNo.220
1のアセトン処理菌体30mg、バシルス・スフェリカスSCR
C−R79a（微工研条寄第1013）のアセトン処理菌体30mg
（培養液15ml分）を含む3mlの反応液を30℃で15時間反
応させたところ、30.1mg（182μmol、100％の転換率）
のＬ−フェニルアラニンが生成していた。

反応番号44. NAD⁺15μmol、トリス−塩酸緩衝液（pH8.5）1.5mmol、
蟻酸アンモニウム12mmol、カンジダ・ボイディニNo.220
1のアセトン処理菌体300mg、バシルス・スフェリカスSC
RC−R79a（微工研菌条寄第1013）のアセトン処理菌体30
0mg（培養液150ml分）を含む30mlの反応液を30℃に保ち
ながら、フェニルピルビン酸ナトリウム2.23g（10.92mm
ol）を６回に分けて添加し、さらに蟻酸アンモニウム12
mmolを加えたところ、48時間の反応で1.80g（11.2mmo
l、100％の転換率）のＬ−フェニルアラニンが生成して
いた。

以上の結果を第６表に要約する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】バシルス（Bacillus）属細菌又はスポロサ
ルシナ（Sporosarcina）属細菌によって生産されるＬ−
フェニルアラニン脱水素酵素又は酵素含有物の存在下
で、次の式（Ｉ）（式中、R₁は水素又はメチル基であり、そしてR₂は置換
基を有する場合がある炭素原子数１〜４の直鎖もしくは
分岐鎖のアルキル基、又は置換基を有する場合がある芳
香族基である）で表わされるα−ケトカルボン酸、アンモニウムイオン
及びNADHを反応せしめることにより、次の式（II）（式中Ｒは前記の意味を有する）で表わされるＬ−アミノ酸を生成せしめ、このアミノ酸
を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項２】前記酵素含有物が前記細菌の培養物、菌
体、菌体処理物、又は部分精製酵素である特許請求の範
囲第１項記載の方法。
【請求項３】前記反応により生成したNAD⁺をNADHに再生
する系をさらに含んで成る特許請求の範囲第１項記載の
方法。
【請求項４】前記NADH再生系が蟻酸脱水素酵素又はその
酵素含有物、及び蟻酸又はその塩を含んで成る特許請求
の範囲第３項記載の方法。
【請求項５】前記NADH再生系がＬ−フェニルアラニン脱
水素酵素生産菌中の酸化−還元酵素系である特許請求の
範囲第３項記載の方法。
【請求項６】スポロサルシナ（Sporosarcina）属に属す
る細菌の培養物、菌体又は菌体処理物及びエネルギー源
の存在下で、アンモニウムイオンと次の式（Ｉ）（式中、R₁は水素又はメチル基であり、そしてR₂は置換
基を有する場合がある炭素原子数１〜４の直鎖もしくは
分岐鎖のアルキル基、又は置換されている場合がある芳
香族基である）で表わされるα−ケトカルボン酸とを反応させることに
より、次の式（II）（式中Ｒは前記の意味を有する）で表わされるＬ−アミノ酸を生成せしめ、このアミノ酸
を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項７】エネルギー源が糖類、アルコール類もしく
は有機酸類又はこれらの組合わせである特許請求の範囲
第６項記載の方法。