JPS62257392A - トランスアミノ化によるｌ−アミノ酸の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アミノ酸は幾通りムの応用側面を有する。ごれらは動物
栄養補給物として、または人間の食品添加剤としてまた
は注入溶液の成分として使用される。さらにＬ−フェニ
ルアラニンは、フェニルアラニンメヂルエステルとアス
パラギン酸とからなる甘味料アスパルテーム合成用成分
としても使用される。

トランスアミナーゼを用いる生物学的変換によるし一ア
ミノ酸の製造それ自体は知られている。ヨーロッパ特許
出願節１５２，２７５号には特に、アミノトランスフェ
ラーゼの過剰生産を特徴とする、遺伝子工学により修飾
された微生物を用いるトランスアミノ化によるフェニル
アラニンの製法が記載されている。トランスアミノ化反
応は少なくとも４０℃で実施される。何故ならこの比較
は高い温度で微生物細胞はより透過性となるからである
。

ヨーロッパ特許出願１３５．８４６号（米国特許第４．
５１８，６９２号および同第４，５２５，４５４号）に
よれば、■、−アζノ酸の製造はα−ケト酸を大腸菌（
Ｅｃｏｌｉ）から単離されたトランスアミナーゼの存在
下にＬ−アスパラギン酸と反応させることにより行われ
る。アスパラギン酸からケ］・酸に対応するα−アミノ
酸とオキザロアセテートが生成する。脱力ルボギノル化
後に反応媒体からオキサロアセテ−１・を除去したのち
、反応平衡が最終生成物の側にシフトする。オキザロア
セテートは不安定なので水溶液中て脱カルポギシル化さ
れる。この反応は熱により、または化学的にまたは酵素
により促進されうる。

フェニルピルビン酸からＬ−フェニルアラニンをより高
収率で製造するための、大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ、）、バラコツカス・デニトリフィカンス（Ｐ
ａｒａｃｏｃｃｕｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、
トルラ（Ｔｏｒｕｌａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏ
ｒｕｌａ）およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ）からなる群の微生物の選択および突然変異が
西ドイツ特許出願第３．４２３，９３６号に示されてい
る。

今、驚くべきことに、トランスアミノ化が行われる反応
溶液中に単にガスを通ずることにより、短い反応時間で
所望のアミノ酸の収率が１００％まで到達できることが
見出された。

従って本発明はアミノ基供与体によるα−ケト酸のトラ
ンスアミノ化によりＩ、−アミノ酸を微生物的に製造す
るにあたり、アミノ基供与体としてアスパラキン、アス
パラギン酸、グルタミンおよびグルタミン酸を使用しそ
して反応溶液にガスを通ずることからなる方法に関する
。

以下に本発明についてくイつしく説明する。

多数の微生物が生物学的変換によりα−ケト酸を１７−
アミノ酸に変換できる。これら微生物は本発明により使
用されうる。しかしながらバラコツカス・デニトリフィ
カンスＤＳＭ　６５ならびに土壌試料から単離されたス
トレプトミセス科微生物を用いて操作するのが好ましい
。大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３を用いると最良の結果が得
られる。

選択および突然変異により、それ自体知られた　４一 方法、特に西ドイツ特許出願第３，４２３．９３６号記
載の方法に従い、以後操作のための培地中における漸増
量の相当するα−ケト酸の存在下に、α−ケト酸に対す
るその適合性ゆえに生物学的変換をより良好な収率で遂
行する微生物が選択されることが好ましいが、）７かし
絶対的に必要なわけではない。

選択により例えば培養液ＩＣ当りトランスアミナーゼ活
性１００〜２００μモル／分が基礎とされうる。この方
法で本発明による方法を用いることにより６０９／Ｑ、
までのα−ケト酸が約１００％の収率で対応するアミノ
酸にアミノ交換されうる。

微生物をそれらの生育に最適の培養基中で適当な好適な
温度および通気条件下に栄養溶液ｌρ当り湿潤重量的７
１〜１０Ｌｉとなるまで培養するのが好ましい。それぞ
れの微生物にとって最も好適な条件は当業者に知られて
いるかまたは簡弔な予備実験で判定されつる。次に細胞
を栄養溶液中にまたは栄養溶液から分離したのちケト酸
のアミノ化に使用する。トランスアミノ化は全細胞を用
いてまたは消化された細胞を用いて実施され、その場合
は慣用の消化法が用いられる。操作を容易にするゆえに
完全な細胞を用いて操作するのが好ましい。さらに、微
生物を固定された形態で使用することも可能である。

固定するには、知られた方法好ましくは西ドイツ特許公
開公報第３，２３７，３４１号（米国特許第４．６０３
．１１１号）および同第３．２４３，５９１号（米国特
許第４，５４２，０６９号）記載の方法が用いられうる
。

微生物はα−ケト酸およびアミノ基供与体を添加して細
胞用生理学的緩衝液中に懸濁される。

微生物の量に応じ反応混合物（こ添加された酵素活性は
広範囲に変動しうる。１０〜２００００μモル／分・ρ
にあるのが好都合である。反応混合物が酵素活性１５０
０〜２０００μモル／分・ρを有する細胞量を含有する
のか好ましい。

アミノ基供与体としては例えばグリシジ、アラニン、バ
リン、ロイシン、特にアスパラギン、アスパラギン酸、
グルタミンおよびグルタミン酸のようなアミノ酸が使用
される。これらアミノ酸はそれらの遊離の酸または適当
な塩（使用される培地に応じて）の形態で用いられる。

アミノ基供与体はα−ケト酸に対して等モル量でまたは
過剰に用いられる。比率１・１〜５．１、好ましくはＩ
、１〜２；１が適当であることが判った。

反応混合物への反応体の添加は水中における溶液として
または固形物質の添加により同時になされることができ
る。しかしながらそれぞれ反応混合物の重…に基づき１
〜４．５％、特に１，５〜２％の量で１〜９０時間好ま
しくは２〜４０時間にわたり段階的にまた（」斜読して
添加するのが好ましい。

ｐｌ＋５〜９特に７〜８．５で操作するのが好ましい。

さらに、アミノ交換反応を２０〜６５℃で実施するのが
好都合である。それより温度が低くなればなるほど酵素
反応はまずまずゆっくりと進行し、一方酵素はそれより
温度が高くなればなる程まずます不活性化される。

最も好適な操作法はそれぞれの微生物の如何によるもの
であり、そして簡単な予備実験で容易に設定されうる。

微生物をトランスアミノ化の前または間により浸透性と
なすことが特に好都合であることが判った。これは適当
な薬剤例えばトルエン、セヂルトリメヂルアンモニウム
ブロマイド、ジメチルスルホキシド等をインキュベーシ
ョン培地に添加することにより行われつる。

短時間での高い反応速度は驚くべきことに、生物学的変
換が行われる前記反応混合物にガスを通ずる場合（己達
成される。ガス通気は毎分０．１−１５ｖ／ｖ（以下Ｖ
Ｖｍと略記する）好ましくは０．２〜３　ＶＶｍの速度
で行イっれる。原則的には微生物の酵素活性を実質的に
低下させないすべてのガスが用いられ−）る。例えば圧
縮空気、純粋な酸素、窒素および種々の怖ガス例えばヘ
リウム、ネオン、アルゴンまたはクルプトンが適当であ
る。

価格が低いことおよび入手し易さゆえに圧縮空気および
純粋な窒素が好ましい。

本発明による方法を用いて原則的にずべてのα−ケト酸
がアミノ化されうる。天然のタンパク質に組み込まれた
、特に下記の表に示されるアミノ酸が用いられるのが好
ましい。

ピルベート　　　　　　　　　　アラニンジメチルピル
ベート　　　　　　バリンイソプロピルピルベート　　
　　ロイシンエチルメヂルピルベート　　　　イソロイ
ンンヒドロキシピルベート　　　　　セリンフェニルビ
ルビート　　　　　　フェニルアラニン４−ヒドロキシ
フェニル　　　チロンンピルベート インドールビルベート　　　　　トリプトファン下記実
施例により本発明をさらに説明する。

％表示は別に断りなければ重量によるものとする。

実施例　１ 大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３を慣用法により培養しそして
Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトログアニジン（ＭＮ
Ｇ）を用いて突然変異させた。ＭＮＧで処理された細胞
を下記組成 フマル酸　　　　　　　５９／ａ 肉エキス　　　　　　２０　ｇ／ρ アスパラギン酸　　　２０　　ｇ＃ ＫＩ１．ＰＯ４２９／（Ｉ ＭｇＳＯ，Ｘ　７１１２０　　　　　０．５９／１２Ｃ
ａＣρ２Ｘ　２Ｈ２００，１ｆｊ／（１寒　　天　　　
　　　　　　　　　２０　ｇｌｏ。

（水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７，２に調整）を有す
る圧熱滅菌された寒天上に塗布した。

フェニルピルベートの滅菌　過された溶液をまだ厚い寒
天中に注ぐと、フェニルピルベート２４ｇ／Ｃの最終濃
度に達した。このプレートを３７℃で４日間インキ、ベ
ートした。直径１　ａｍ以上を有するコロニーを単離し
た。生育した菌株の２０％がもとの菌株に比較して高い
トランスアミナーゼ活性を何していた。

トランスアミナーゼ活性測定はＳｉｇｍａテストキット
Ｇ　０３９０を用いて行われた。α−ケトグルタレート
の代りに１２ミリモル／σのフェニルピルベートナトリ
ウム塩が用いられた、。

実施例　２ 大腸菌ＡＴＣＣ１１３０３の実施例１により選択された
突然変異体を寒天なしの実施例１の栄養溶液ｌｌ− 中で培養した。このものは３７℃で２０時間生育後でト
ランスアミナーゼ活性１７０μモル／分・ρを有してい
た。細胞を遠心分離し、ｐ）１７　、４の５０ミリモル
／ρ燐酸塩緩衝液で洗いそして３０ミリモル燐酸塩緩衝
液（ｐＨ７，４）中にトランスアミナーゼ活性１５００
μモル／分・Ｑが含有されろように懸濁した。２４ｙ／
＆のＮａ−フェニルピルベートおよび２０９／ρのアス
パラギン酸をこの細胞懸濁液中に加えた。

３７℃で６時間インキュベーションしたのち反応混合物
には２１ｇ／ρの１７−フェニルアラニンが含有されて
いた。この溶液をか遇しそして水を蒸発させることによ
り１：１０に濃縮した。

フェニルアラニンはｐｌ＋５，５および５℃で結晶化し
た。アミノ酸の定性分析および定量分析はＲＰ１８−カ
ラムでのＨＰ　Ｌ　Ｃにより行われた。

実施例　３ 実施例１により得られた細胞物質を４２９／Ｑのフェニ
ルピルベート、３４ｇ／ρのアスパラギン酸およびｐＨ
７，４の１０ミリモル／ｇ燐酸塩緩衝液からなる溶液１
００πρ中に溶液中の酵素活性が１５００μモル／分・
ａに相当するように懸濁させた。反応混合物の半分を３
７℃で撹拌し、その間残りの半分にはこれに加えて反応
緩衝液ＩＱ４当り毎分１ρの圧縮空気を通じた。４時間
後に通気されなかった反応容器はフェニルアラニン１６
．５ｇ、Ｑを含有するが一方通気された方の容器では２
６．９９／ρが測定された。

実施例　４ その量が酵素活性１００　Ｉｔモル／ａ・分に相当する
バラコツカス・デニトリフィカンスＤＳＭ　６５の細胞
を９０ミリモル／Ｑのアスパラギン酸、２７μモル／１
２のＮ−セチル−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウム
ブロマイド、２０ミリモル／Ｑの４−ヒドロキシフェニ
ルピルベートおよび３０ミリモル／Ｑの燐酸塩緩衝１（
ｐＨ７，４）からなる組成を有する水溶液１００ｍρ中
に懸濁した。

３０℃および０．５ＶＶｍで窒素を通じて２０時間イン
キュベーションしたのち１８ミリモル／ρのＩ、−チロ
シンが測定された。

実施例　５ 実施例３におけると同様の細胞物質を９０ミリモル／Ｑ
のアスパラギン酸、２７μモル１０．のＮ−セチル−Ｎ
、Ｎ、Ｎ−）リメチルアノモニウムブロマイド、３５ミ
リモル／（！のジメチルピルベートおよび３０ミリモル
１０．燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，４）からなる水溶液１０
０＋ｉ！中でインキュベートした。４０℃でＩ　ＶＶｍ
で圧縮空気を通じながら２０時間経過後で３０ミリモル
／Ｑのバリンが測定された。

実施例　６ 実施例３におけると同様の細胞物質を３２０ミリモル／
Ｑ、のフェニルピルベートナトリウム塩、３４０ミリモ
ル／１２のアスパラギン酸、１０μモル／ρのトルエン
およびＩＯミリモル／ａのトリス／　ＨＣｆ２緩衝液（
ｐＨ７，４）からなる水溶液１００ｙｘＱ中でインキユ
ベーションした。０．５ＶＶｍで５時間酸素を通じた後
に、３７℃ではフェニルアラニン含量１５０ミリモル／
Ｉ２そして５０℃ではフェニルアラニン含ｉ　２７０　
ミリモル／ａが測定された。

実施例　７ 実施例３におけると同様の細胞物質を３０ｇ／ρのフェ
ニルピルベートナトリウム塩、２８９／ρのアスパラギ
ン酸おにびＩＯミリモル／ρのトリス／　１１　Ｃθ緩
衝液（ｐＨ７，４）からなる水溶液１００靜中に懸濁し
た。この懸濁液を５０℃で０．５ＶＶｍの圧縮空気を通
じてインキユベーションした。

２時間後に２５ｇ／ρのフェニルアラニン濃度が測定さ
れた。ここで反応容！ｔｔ　ｌ　Ｑ当り固形フェニルピ
ルベートナトリウノ、塩３０９および固形アスパラギン
酸すトリウノー２塩２６ｇを秤量添加＝１５＝ した。さらに２時間後にはフェニルアラニン濃度４５９
／（ｌが測定゛された。

特許出願人　　ヘキスト・アクチェンゲゼルシャフト外
２名 １６一

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）水溶液中でアミノ基供与体によるα−ケト酸のトラ
   ンスアミノ化によりＬ−アミノ酸を微生物的に製造する
   にあたり、アミノ基供与体としてアスパラギン、アスパ
   ラギン酸、グルタミンおよびグルタミン酸を使用しそし て反応溶液にガスを通じることからなる方 法。 ２）反応溶液に毎分０．１〜１５ｖ／ｖでガスを通じる
   ことからなる特許請求の範囲第１項記載の 方法。 ３）反応溶液に毎分０．２〜３ｖ／ｖでガスを通じるこ
   とからなる特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４）反応媒体へのα−ケト酸およびアミノ基供与体の添
   加が１〜９０時間にわたり同時にそして段階的に行われ
   ることからなる特許請求の範囲第１〜３項のいずれか１
   項記載の方 法。 ５）添加が２〜４０時間にわたり行われることからなる
   特許請求の範囲第４項記載の方 法。 ６）アミノ基供与体およびα−ケト酸が１：１〜５：１
   （モル／モル）の比率で用いられることからなる特許請
   求の範囲第１〜５項のいずれか１項記載の方法。 ７）アミノ基供与体およびα−ケト酸が１：１〜２：１
   （モル／モル）の比率で用いられることからなる特許請
   求の範囲第６項記載の方法。