JPS63245673A - アミノ酸ラセマ−ゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野〕 この発明は、アミノ酸ラセマーゼに関する。

〔従来の技術〕

左右田及び大隅、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏ
ｌｏ　　　。

１７Ｂ　、　６２９（１９７１）にはシェードモナス・
ストリアタ（プチダ）　　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　
５ｔｒｔａｔａ　　（Ｂ旦ハ）〕により生産される低基
質特異性アミノ酸ラセマーゼが記載されているが、この
酵素は分子量が１１０．０００である点等において本発
明のアミノ酸ラセマーゼとは異なり、また前記文献には
そのアミノ酸ラセマーゼが芳香族アミノ酸に作用する旨
の記載はない。

Ｇ、　Ｒｏｓｓｏ＄翫Ｂｉｏｃｈｅｍｔｃａｌ　ａｎｄ
　Ｂｉｏ　ｈ　５ｉｃａｌＬ？ｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｖ
ｗｕｎｉｃａｔｉｏｎ　、　３Ｃ１３４（１９６９）に
はシュ・−トモナス・プチダ（、Ｐ、匹旦鼓）により生
産されるアラニンラセマーゼが記載されているが、この
酵素が芳香族アミノ酸に作用する旨の記載はない。

山田等、ユ１ム肛胆し妊」圏並組旦旦り、並。

５２９（１９６９）にはバシルス・プレビス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）により生産されるフェニルアラ
ニンラセマーゼが記載されているが、生産微生物の属が
異る点、分子量が１００，０００である点、及び補酵素
としてＡＴＰを必要とする点等において本発明の酵素と
は全く異る。

稲垣等、蝕「お四上卸りリー鮭ｄ　Ｂｉ朝旦Ｃ工ａｔ並
印ｎｋＬ、　５１　、１７３（１９８７）　ニは低基質
特異性アミノ酸ラセマーゼが記載されているが、この酵
素は、生産微生物の属が異る点等において本発明の酵素
とは全く異り、またこの文献にはその酵素が芳香族アミ
ノ酸に作用することは記載されていない。

寄Ｂ等、Ｔｌ聾工島且皿旦１　ｏｆ　Ｂ±Ｕ旦〔工幻−
Ω印亘江１．２４６　　、５０８５（１９７１）にはア
ルギニンラセマーゼが記載されているが、この酵素は１
６９．０００の分子量を有する点において本発明の酵素
とは異る。また、この文献には、その酵素が芳香族アミ
ノ酸に作用する旨の記載はない。

また、国中、日本農芸化学会誌、３４　、１０２２（１
９６０）にはラクトバチルス・ファーメンティ（Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｆｅｒｍｅｎｔｉ）のアセト
ン処理菌体によりＬ−フェニルアラニンからＤ−フェニ
ルアラニンが生じることが記載されているが、酵素の精
製はなされておらずその性質の詳細については不明であ
る。さらに、生産微生物の属が異る点において、本発明
の酵素とは全く異る。

以上のごとく、補酵素としてＡＴＰを必要とせず、フェ
ニルアラニン、トリプトファン、チロシン等の芳香族ア
ミノ酸に作用する酵素は、本発明のアミノ酸ラセマーゼ
以外に全く知られていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って本発明は、今まで芳香族アミノ酸をラセミ化する
ことが知られていなかった、微生物由来のアミノ酸ラセ
マーゼを提供しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

前記の目的は、次の性質： （１）Ｌ−あるいはＤ−アミノ酸に作用してラセミ体を
生成する反応を触媒する； （２）高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において
約６０，０００〜８０，０００の分子量を示しＳＤＳ−
ポリアクリルアミドディスク電気泳動法において約３０
．０００〜４２，０００の分子量を有するサブユニット
を示す； （３）芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、トリプ
トファン、及びチロシンに作用する；を有することを特
徴とするアミノ酸ラセマーゼを提供することにより達成
される。

〔具体的な説明〕

（１）監生立 本発明において使用する微生物としてはシュードモナス
属に属し、アミノ酸ラセマーゼを生産することができる
ものであればよく、このような微生物は保存菌の中から
選択することができる場合もあり、また、自然界から新
たに分離することができる。

このような微生物としては、シュードモナス・プチダを
挙げることができる。この種に属する新菌株として、本
発明者等が分離したシュードモナス・プチダ５ＣＲＣ−
７４４を挙げることができる。本菌は、微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第９０３９号（ＦＥＲＭ　Ｐ−９０
３９）として寄託されている。

前記の新菌株は次の第１表に示す組成の培地を用いて神
奈川県相模原市の土壌より分離した。

星−上一表 Ｄ−フェニルアラニン　　　０．２％ 酵母エキス　　　　　　　　０．０５ リン酸二カリウム　　　　　０．２ 塩化ナトリウム　　　　　　０．１ 硫酸マグネシウム　　　　　０．０５ ビタミン混液（−１（ｌ　ｌ 水道水　　　　　　　　　ｐＨ７，０ ビタミン混液（リ ビオチン　　　　　　　　　　　２μｇパントテン酸カ
ルシウム　　４００ イノシトール　　　　　　　２０００ 塩酸チアミン　　　　　　　　４００ 塩酸ピリドキシン　　　　　２００ ニコチン酸　　　　　　　　４００ ｐ−アミノ安息香酸　　　　２００ リボフラビン　　　　　　　　２００ 葉酸　　　　　　　　　　　　１０ 蒸留水　　　　　　　　　　１００　ｍ　ｌこの培地を
試験管（φ１８酊）に５ｍＪずつ分注し、１２０℃で１
５分間滅菌した。この培地に各地より採集した土壌サン
プルを少量加え、３７℃で２〜３日間振盪培養した。こ
の培養液を一白金耳とり、同じ培地に接種し、さらに３
７℃で２日間培養した。第１表の培地に２％の寒天を加
えた゛平板培地に培養液の一部を白金耳を用いて画線塗
布し、３０℃で数日保温した。出現したコロニーを同じ
培地組成の斜面培地に釣菌し、多数の菌株を分離した。

次に、表の培地５ｍｅを同試験管に分注し、同様に滅菌
した。それぞれの菌株をこの培地で３７℃、２０時間振
盪培養し、上清中のＤ−フェニルアラニンの減少が顕著
な菌株を選抜した。この菌株の培養物を、表に示した培
地２００　ｍ　ｌを５００ｍ１容の三角フラスコに分注
し同様に滅菌したものに接種し、３７℃で２０時間回転
振盪培養した。

この培養液から遠心分離で得られた菌体を超音波により
破砕した。これを１２．０００Ｘ　ｇで遠心分離して得
られた上清を、Ｏ，１ｍＭのＥＤＴＡ、　５　ｍＭの２
−メルカプトエタノール、及び０．１ｍＭのピリドキサ
ール５′−リン酸を含む０．０１　Ｍリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ７，０）で透析した。この上清に含まれるア
ミノ酸ラセマーゼ活性を、Ｌ−またはＤ−フェニルアラ
ニンより生ずるそれぞれの光学異性体を定量することに
より測定した。なお、Ｄ−フェニルアラニンはＤ−アミ
ノ酸オキシダーゼにより定量し、Ｌ−フェニルアラニン
の定量はＬ−アミノ酸オキシダーゼ又は、ペディオコッ
カス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｕｓ　　
ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）　ＡＴＣＣ。

８０４２を用いる微生物定量法によった。

以上のようにして得た前記の新規な菌株は第２表に示す
ような菌学的性質を有する。

策−主−１ 観察項目　　　　　　　　　　　　　　　５ＣＲＣ−７
４４ａ）形態　　　　　　　　　　　　　２１　細胞の
型　　　　　　　　　　　　桿菌大きさ　　　　　　　
　　　　　１．８　Ｘ　０．７μｍ２　多形性の有無　
　　　　　　　　　なし　　　　　３３　運動性の有無
　　　　　　　　　　十鞭毛の着生状態　　　　　　　
　　極鞭毛４　胞子の有無　　　　　　　　　　　なし
５　グラム染色　　　　　　　　　　　−６抗酸性　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　４ｂ）各培地に
おける生育状態 ・　１　肉汁寒天平板培養（３０℃、３日間）　　　　
　　５イ）コロニー形状（直径）　　　　３鳳ｌ口）コ
ロニーの形　　　　　　　　円形ハ）コロニー表面の形
状　　　　　平滑二）コロニーの隆起状態　　　　　半
レンズ状ホ）コロニーの周縁　　　　　　　金縁へ）コ
ロニーの色調　　　　　　　淡黄ト）コロニーの透明度
　　　　　　不透明チ）コロニーの光沢　　　　　　　
輝光り）可容性色素の生成　　　　　　　−肉汁寒天斜
面培養（３０℃、３日間） イ）生育の良否　　　　　　　　　生育良好口）コロニ
ーの光沢　　　　　　　輝光肉汁液体培養（３０℃、７
日間） イ）表面の生育　　　　　　　　　あり（菌環）口）濁
度　　　　　　　　　　　　やや濁るハ）沈殿　　　　
　　　　　　　　粉状二）ガス発生　　　　　　　　　
　なし肉汁ゼラチン（３０℃、７日間） ゼラチン液化　　　　　　　　　　　−リドマスミルク
　（３０℃、７日間）アルカリＣ）生理学的性質 １　硝酸塩の還元　　　　　　　　　　　−２脱窒　　
　　　　　　　　　　　　　−３ＭＲ− ４ＶＰ　　　　　　　　　　　　　　　　−５インドー
ル生成　　　　　　　　　　−６硫化水素の生成　　　
　　　　　　　−７デンプンの加水分解　　　　　　　
　−８クエン酸利用 イ）　Ｋｏｓｅｒ　　　　　　　　　　　　　　　＋口
）　Ｓｉｍｍｏｎｓ　　　　　　　　　　　　　　＋ハ
）　　Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　＋９　硝酸塩の利用　　　　　　
　　　　　−１０色素生成 イ）Ｋｉｎｇ　　Ａ　　培地　　　　　　　　−口）Ｋ
ｉｎｇ　　Ｂ　　培地　　　　　　　　　＋１１　　ウ
レアーゼ　　　　　　　　　　　　＋１２　　オキシダ
ーゼ　　　　　　　　　　　＋１３　　カタラーゼ　　
　　　　　　　　　　＋１４　　生育の範囲 イ）ｐＨ５，０−９，０ 口）温度　　　　　　　　　　　　５−４０℃１５　　
酸素に対する態度　　　　　　　　好気性１６０−Ｆテ
スト（グルコース）　　　酸化１７Ｉ！類からの酸およ
び ガスの生成　　　　　　　　　酸　　ガスＩ　Ｌ−アラ
ビノース　　　　−− ２Ｄ−キシロース　　　　　−− ３Ｄ−グルコース　　　　　−− ４Ｄ−マンノース　　　　　−− ５Ｄ−フラクトース　　　　−　　　−６Ｄ−ガラクト
ース　　　　−　　　−７麦芽糖　　　　　　　　　−
− ８シｇ糖　　　　　　　　　−− ９乳糖　　　　　　　　　　−− １０トレハロース　　　　　　−　　　−１１Ｄ−ソル
ビット　　　　　−− １２Ｄ−マンニット　　　　　−− １３グリセリン　　　　　　−− １４デンプン　　　　　　　　−− １５ラフィノース　　　　　　−− １６イヌリン　　　　　　　　−− １７Ｄ−リボース　　　　　　−− １８ソルボース　　　　　　　−− １９カルボキシメチル　　　　−− セルロース ２０　　グリコーゲン　　　　　　−−ｄ）抗生物質に
対する感受性 １　ペニシリンＧ　　　　　　　　− ２ストレプトマイシン　　　　　＋ ３　クロラムフェニコール　　　　＋ ４　テトラサイクリン　　　　　　＋ ５　ノボビオシン　　　　　　　　− ６ポリミキシンＢ　　　　　　　＋ ｅ）その他の諸性質 ＤＮａ　ｓ　ｅ　　　　　　　　　　　　−リパーゼ　
　　　　　　　　　　− レシチナーゼ　　　　　　　　　　− アルギニンの分解　　　　　　　　十 ゼラチンの分解性　　　　　　　　− ビタミン要求性　　　　　　　　　− 耐塩性　５％　　　　　　　　　　＋ ７％　　　　　　　　　　− １θ％　　　　　　　　　　− 上記の菌学的性質に基づき勧ユ■ｊ」且ｕａｌ　ｏｆ−
シュ旦見配土ｃ　Ｂ、匹上「１杜」は、第上巻、１９８
４年の分類基準およびＧｉｂｂｓ　＆　５ｋｉｎｎｅｒ
によるＩｄｅｎｔｉｆｉｃ−Ｂユ卯−肪μ四士ＬＬ匡」
１虹α１劇Ａ肘亙堕−に従って、前記の菌株を次のよう
に同定した。

本国は、好気性で極鞭毛を持ち運動性を有するダラム陰
性の桿菌であり、肉エキスやペプトンに生育する。また
、オキシダーゼ反応陽性でグルコースを酸化的に分解す
ることから、シュードモナス属に属する細菌であると同
定した。さらに、キングＡ培地で発色せず、橙色の不審
色素や緑色の結晶を生成しないが、キングＢ培地で緑色
の蛍光色素を産生ずること、また４２℃で生育せず、ゼ
ラチンを液化しないこと及び炭素源の利用能等から、シ
ュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　　匹
一旦並）であると同定した。

なお、本国に変異を生じさせて一層生産性の高い菌株を
得ることもできる。また、本菌株の細胞中に存在するア
ミノ酸ラセマーゼの生産に関与する遺伝子を切り出し、
これを適当なベクター例えばプラスミドに挿入し、この
ベクターを用いて適当な宿主、例えばエッシエリッヒア
・コリ（Ｅｓｈｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｔ）や酵
母のごとき異種宿主またはシェードモナス属菌のごとき
同種宿主を形質転換することにより、本発明のアミノ酸
ラセマーゼ生産株を人為的に創成することもできる。

この発明の菌株は、常法に従って保存することができ、
例えば寒天スラント上で、または凍結乾燥法により保存
することができる。寒天スラント培地としてはシュード
モナス属菌の保存に常用されている培地、例えば菌の分
離に関して前記した培地を使用することができる。また
凍結乾燥も常法に従って行なうことができる。

（２）ｔｌｎＬＬＬ汰 前記の微生物を培養して本発明のアミノ酸ラセマーゼを
製造しようとする場合、基礎栄養培地として、この発明
の微生物が増殖し得るものであればいずれを使用しても
よい、この培地は、窒素源として例えば酵母エキス、ペ
プトン、肉エキス等の１種類又は複数種類を含有する。

また、この培地には必要に応じて炭素源としてグルコー
ス、澱粉、グリセリン等を加えることができる。この培
地には無機塩類、例えばリン酸二カリウム、塩化ナトリ
ウム、硫酸マグネシウム等を加えることが好ましい。

アミノ酸ラセマーゼの製造に当っては前記基礎培地に、
誘導物質として小量のし−またはＤ−フェニルアラニン
もしくはＤＬ−フェニルアラニンを添加するのが好まし
い、このフェニルアラニンの添加量は、基礎培地の組成
、培養する菌株の性質等により異なるがおよそ０．０１
〜５　ｗ　／　ｖ％である。

培養は固体培地又は液体培地のい′ずれを用いてもよい
が、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を用い、
振盪培養、通気・攪拌培養等により好気的条件下で培養
を行なうのが好ましい、培養温度は菌が生育し、アミノ
酸ラセマーゼが生産される温度範囲内であればいずれの
温度でも良いが、好ましくは２５〜３７℃である。ｐＨ
は５〜９の範囲である。培養時間は酵素活性が発現され
る時間を選べば良いが好ましくは６〜４８時間である。

次に得られた培養物から本発明のアミノ酸ラセマーゼが
採取されるが、精製法として通常の酵素精製法を用いる
ことが出来る。遠心分離等によって菌体を集め、超音波
処理、ダイノミル等の機械的方法によって菌体を破砕す
る。細胞片等の固形物を遠心分離等によって除き、粗酵
素を得、さらにこれに硫酸プロタミン又は硫酸ストレプ
トマイシンを加えて処理を行ない、塩析、有機溶媒沈殿
、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等を行ない、均一の
酵素標品を得ることが出来る。なお、本発明の酵素の製
造方法の具体的な一例を実施例に記載する。

（３）力ｌ■皿定汰 本発明においては次の方法により力価を測定した。

トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，５）５０μｌｌｌ０ｌ、
ピリドキサール５′−リン酸０．０２μｍｏｌ！　％　
Ｄ−アミノ酸２０μｔｍｏｌｌ　、及び適当量のサンプ
ルを０．５ｍｌになるように混合して３７℃において反
応せしめ、生じたし一アミノ酸を、Ｌ−アミノ酸オキシ
ダーゼあるいはペディオコッカス・アシディラクティシ
（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ　　ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃ
ｉ）八ＴＣＣ８０４２を用いる微生物定量法により測定
した。１分間当り１μｍｏｌのＬ−メチオニンが生じる
酵素量を１単位と′した。

（４）侶じ１Ｑ土Ｌｔ 本発明のアミノ酸ラセマーゼは次の性質を有する。

（１）作用：Ｌ−あるいはＤ−アミノ酸に作用してラセ
ミ体を生成する反応を触媒する。

（２）基質特異性二本アミノ酸ラセマーゼは第３表に示
すように、グルタミンに高い活性を示し、フェニルアラ
ニン、トリプトファン、チロシン等の芳香族アミノ酸に
作用する。

Ｄ−グルタミン　　　　　　　　　１００Ｄ−メチオニ
ン　　　　　　　　　　４２Ｄ−アラニン　　　　　　
　　　　３６Ｄ−セリン　　　　　　　　　　　３１Ｄ
−リジン　　　　　　　　　　　２２Ｄ−アルギニン　
　　　　　　　　　２１Ｄ−ロイシン　　　　　　　　
　　　１５Ｄ−アスパラギン　　　　　　　　　６Ｄ−
システィン　　　　　　　　　　６Ｄ−ヒスチジン　　
　　　　　　　　５Ｄ−フェニルアラニン　　　　　　
　ＩＤ−）リプトファン　　　　　　　　　０．８Ｄ−
チロシン　　　　　　　　　　　０．４基質濃度はＤ−
トリプトファンを２０ｍＭ、Ｄ−チロシンを４ｍＭとし
たのを除き、４０ｍＭとした。

（３）至適ｐｎ　：　ｐＨ８，０付近が至適である（第
１図）。

（４）　ｐＨ安定性：各ｐＨの緩衝液（０，１Ｍ）中３
０℃にて１時間保温した後の残存活性を測定した場合、
第２図に示す（処理前の活性を１００％とする）ように
ｐＨ７，０〜１１．０において安定である（第２図）。

（５）至適温度＝５０〜６０℃付近における活性が最大
である（第３図）。

（６）温度安定性：０．２Ｍグリシン−ＭＣＩ　−ＫＯ
ＩＩ緩衝液（ｐＨ１０，０）中、各温度において１０分
間処理した後の残存活性を測定する場合、第４図に示す
（処理前の活性を１００％とする）ように、ｐＨ１０，
０においては６７℃で活性が半減する。

（７）吸収スペクトル：　２７９　ｎｍ及び４１７　ｎ
ｍ付近に極大吸収を有する（第５図）６ （８）金属イオン、及び阻害剤の影ｇ：ニッケル、亜鉛
等の金属イオン及びヒドロキシルアミン、Ｄ−ペニシラ
ミン、Ｄ−サイクロセリン等のカルボニル試薬によって
活性が阻害される（第４表及び第５表）。

Ｌｉ”　　　　　　　　　　　　１００Ｎａ”　　　　
　　　　　　　　　９３Ａｇ”　　　　　　　　　　　
　　８６ｙ１　ｇｔｏ　　　　　　　　　　　９５Ｃａ
２＋　　　　　　　　　　　　１０７Ｃｕ”　　　　　
　　　　　　　ｌＯ２Ｍｎ”　　　　　　　　　　　　
１１７Ｚｎ”　　　　　　　　　　　　６Ｏ Ｎｉ”　　　　　　　　　　　　２０ Ｆ　ｅ”　　　　　　　　　　　　１０５Ｂａ”　　　
　　　　　　　　　９５ Ｃｄ”・　　　　　　　　　　　７９ Ｐｂ”　　　　　　　　　　　　１００Ｓ　ｎ”　（０
，４ｍＭ）　　　　　　　　　９４Ｈｇｔ◆　　　　　
　　　　　　９４ Ａｌコ中　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　１００Ｆｅ”　　　　　　　　　　　　　　　　
　１０９無添加　　　　　　　　　　　１００ ＮａＮｚ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　９８ヒドロキシルアミン　　　　　　　　３５に
ＣＮ（０，４ｍＭ）　　　　　　　　　　　　　９３Ｌ
−ペニシラミン　　　　　　　　１１０Ｄ−ペニシラミ
ン　　　　　　　　　１２Ｄ−サイクロセリン　　　　
　　　　１７セミカルバジド　　　　　　　　　１１４
０−フエナンロリン　　　　　　　　１００α、α′−
ジピリジル　　　　　　　９５８−オキシキノリン（０
，８ｍＭ）　　　　９８ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　
　　　　　　９１ＰＣＭＢ　（０，１５ｍＭ）　　　　
　　　　　　　８９５．５′−ジチオビス　　　　　　
　９５（２−ニトロ安息香酸）（０，１３ｍＭ）Ｎ−エ
チルマレイミド　　　　　　　９６ヨード酢酸　　　　
　　　　　　　　１０１無添加　　　　　　　　　　　
　　１００金属イオン及び阻害剤の濃度は特に記さない
限り１ｍＭである。

（９）等電点：アンホラインを用いる焦点電気泳動によ
り測定した場合７．６である。

（１０）分子量：高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ
ｇｅｌ　Ｇ３０００　ＳＷ）により約６０，０００〜８
０，０００と算出される。　　　　　′ （１１）サブユニットの分子量：　ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により３０．０００〜４２．００
０と算出される。

（１２）均一性：ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７
，５％、ｐＨ８，４）により第６図Ａに示す如く単一の
バンドを与える。また、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（１０，０％、ｐＨ７，２）により第６図Ｂ
に示す如く単一のバンドを与える。

以上のように、本発明のアミノ酸ラセマーゼは、他の微
生物起源のそれとは異なっている。

次に実施例によりこの発明をさらに具体的に説明する。

ＤＬ−フェニルアラニン０．２％、酵母エキス０．５％
、ペプトン１．０％、肉エキス１．０％、ＫＪＰＯ４０
，２％、ＮａＣ１０，１％及びＭｇ５Ｏａ　　’　７８
ｚ００．０５％を含有し、ｐ）１７．０に調製した培地
１２０リツターを１２０℃、１５分間加熱殺田した後、
シュードモナス・プチダ５ＣＲＣ−７４４（微工研菌寄
第９０３９号）を接種し、３０℃で２０時間好気的に培
養した。培養後、遠心分離機で菌体を採取し、湿重量約
９１９ｇの菌体を得た。菌体を生理的食塩水で洗浄した
後、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び５ｍＭの２−メルカプ
トエタノール、０．０１ｍＭピリドキサール５′−リン
酸を含む０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）３リツ
ターに懸濁し、９にＨｚにおける超音波処理を約２０時
間行ない菌体を破砕した。破砕菌体は１４．０００　Ｘ
　ｇ、２０分間の遠心分離で除去し、アミノ酸ラセマー
ゼを含む粗抽出液を得た。この無細胞抽出液に５％プロ
タミン硫酸液をＩｇ蛋蛋白的０．１ｇとなるように添加
し、３０分間攪拌した。この液（３，２２０ｍ１）に固
形硫酸アンモニウム（５６７ｇ　）を加え３０％硫酸ア
ンモニウム飽和とした。３０分間撹拌の後、１４．ＯＯ
ＯＸｇで２０分間遠心分離して得られる上清（３，１６
０ｒｒｌ　）にさらに固形硫酸アンモニウム（６２６ｇ
　）を加え６０％硫酸アンモニウム飽和とした。１４，
０００Ｘｇで２０分間遠心分離して得られる、酵素活性
を有する沈殿を少量の０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）に溶解し、さらに０．　ｉ　ｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡ及
び５ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．０１ｍＭピ
リドキサール５′−リン酸を含む０．０１　Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７，０）で透析した。この酵素液をあらかじ
め０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び５ｍＭの２−メルカプト
エタノール、０．０１ｍＭピリドキサール５′−リン酸
を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化
したＤＥＡＥ−セルロースのカラムに通過させ、同緩衝
液（ｐＨ７，０）で洗浄し、さらに０．１　ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ及び５１の２−メルカプトエタノール、０．０１ｍ
Ｍピリドキサール５′−リン酸を含む０．０５Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出した。

活性区分を集め、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び５＋ｎＭ
の２−メルカプトエタノール、０．０１ｍＭピリドキサ
ール５′−リン酸を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）で透析後、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化した
Ｄｔ！ＡＥ−セルロースのカラムに再び通過させ、同様
に０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び５＋＋Ｍの２−メルカプ
トエタノール、０．０１０１Ｍピリドキサール５′−リ
ン酸を含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶
出した。

活性区分を集め、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び５ｍＭの
２−メルカプトエタノール、０．０１ｍＭピリドキサー
ル５′−リン酸を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）で透析しく２．３１５ｍＩり　、固形硫酸アンモ
ニウム（４０７ｇ　）を加え３０％硫酸アンモニウム飽
和とした。この酵素液を、同様に３０％硫酸アンモニウ
ム飽和とした０、０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で
平衡化したブチル−トヨパール６５０Ｍのカラムに通遇
させ、３０％硫酸アンモニウム飽和から０％の同じ緩衝
液の（ｐＨ７，０）の直線的な濃度勾配で酵素を溶出さ
せた。

活性区分を集め、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び５ｍＭの
２−メルカプトエタノール、０．０１ｍＭピリドキサー
ル５′−リン酸を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）で透析後、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化したヒ
ドロキシアパタイトのカラムに通過させ、０．１　ｍＭ
ＥＤＴＡ及び５ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．
０１ｎ＋Ｍピリドキサール５′−リン酸を含む０．０１
Ｍから０、２　Ｍリン酸緩衝液（ｐ）１７．０）の直線
的な濃度勾配で酵素を溶出させた。この活性区分を集め
、０、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び５ｍＭの２−メルカプト
エタノール、０．０１＋＋＋Ｍピリドキサール５′−リ
ン酸及び０．１ＭＮａＣ１を含む０．０５Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）で平衡化したセファデックスＧ−２０
０によるゲル濾過クロマトグラフィーを行なった。この
ようにして得られた酵素液を限外濾過により濃縮し、以
下のように高速液体クロマトグラフィーを行なった。

すなわち、０．２ＭのＮａＣｔを含む０．１　Ｍリン酸
緩衝液（ｐｌ＋　７．０　＞　で初期化したＴＳＫ　ｇ
ｅｌ　Ｇ３０００ＳＷのカラムにつけ、流速０．４　ｍ
ｌ　／ｍｉｎで同じ緩衝液により溶出した。

活性区分を集め、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び５１ＩＩ
Ｍの２−メルカプトエタノール、０．０１ｍＭピリドキ
サール５′−リン酸を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）で透析後、限外濾過により濃縮した。これを
０．０２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０＞　　
で初期化したＡｓａｈｉｐａｋ　　ＥＳ−５０２Ｃのカ
ラムにつけ、流速０．５ｒｒｌ／ｗｉｎで同じ緩衝液に
より溶出した。

活性区分を集め、０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び５ｍＭの
２−メルカプトエタノール、０．０１ｍＭピリドキサー
ル５′−リン酸を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐｔ１
７．０）で、透析後、限外濾過によりｆＭ１１シた。こ
れを、０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）　
７５％、０、２　ＭＮａＣｌを含む同緩衝液２５％の溶
媒で初期化したＴＳＫ　ｇｅｌ　ＤＥＡＥ　−５Ｐ−の
カラムにつけ、上記緩衝液の割合が２０分間で後者１０
０％になるＮａＣ１の直線的な濃度勾配で、流速０．３
ｍβ／ｗｉｎで溶出した。こうして、アミノ酸ラセマー
ゼを約０．０６％の収率で約２．９６０倍に精製した。

この精製過程における比活性及び回収率を第６表に示す
、この酵素標品はポリアクリルアミドゲル電気泳動及び
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において均一
であった。

以下余白 監Ｕ １、無細胞抽出液　　　２４，８００　　１１３．２０
０　　　　０．２２　　１００１鏝月舛 第６表に示した工程８セファデックスＧ−２００まで精
製したアミノ酸ラセマーゼを用いて、以下のように反応
を行なった。すなわち、トリス−塩酸緩衝液（ρ１１８
．５）３５μｍｏ１、ピリドキサール５′−リン酸２μ
ｌｌｌ０１、Ｄ−またはＬ−アミノ酸４０μｍ０１、ア
ミノ酸ラセマーゼ０．４１Ｕを含む反応液１ｍｌを３７
℃で２０分間反応させ、沸とう水中に１分間つけて反応
を止めた後、生じたＬ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸を
それぞれＬ−アミノ酸オキシダーゼ、Ｄ−アミノ酸オキ
シダーゼを用いて定量した。結果は第７表に示す通りで
あった。

メチオニン　　　　８．２　　　　　　　　１０アラニ
ン　　　　　７．０　　　　　　　　　８．８フエニル
アラニン　０．２０　　　　　　　　　０．２５＊１は
０体を基質として生じたＬ体の量を示しである。

＊２はＬ体を基質として生じた０体の量を示しである。

【図面の簡単な説明】

第１図はシュードモナス・プチダ５ＣＲＣ−７４４株が
生産するアミノ酸ラセマーゼのｐＨと反応速度の関係を
表わすグラフであり； 第２図はシュードモナス・プチダ５ＣＲＣ−７４４株が
生産するアミノ酸ラセマーゼのｐＨ安定性を示すグラフ
であり； 第３図はシュードモナス・プチダ５ＣＲＣ−７４４株が
生産するアミノ酸ラセマーゼの温度と反応速度の関係を
表わすグラフであり； 第４図はシュードモナス・プチダ５ＣＲＣ−７４４株が
生産するアミノ酸ラセマーゼの温度安定性を示すグラフ
であり； 第５図はシュードモナス・プチダ５ＣＲＣ−７４４株が
生産するアミノ酸ラセマーゼの紫外部吸収スペクトラム
であり：そして 第６図はシュードモナス・プチダ５ＣＲＣ−７４４株が
生産するアミノ酸ラセマーゼの均一性を示す電気泳動図
であって、Ａはポリアクリルアミド電気泳動（７，５％
、ｐＨ８，４＞を示し、そしてＢはＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（１０，０％、ｐＨ７，２）を示
す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次の性質： （１）Ｌ−又はＤ−アミノ酸に作用してラセミ体を生成
   する反応を触媒する； （２）高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において
   約６０，０００〜８０，０００の分子量を示し、ＳＤＳ
   −ポリアクリルアミドディスク電気泳動法において約３
   ０，０００〜４２，０００の分子量を有するサブユニッ
   トを示す； （３）芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン、トリプ
   トファン、及びチロシンに作用する；を有することを特
   徴とするアミノ酸ラセマーゼ。 ２、シュードモナス（￥Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ￥）属
   細菌により生産される特許請求の範囲第１項記載のアミ
   ノ酸ラセマーゼ。 ３、前記細菌がシュードモナス・プチダ （￥Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ￥　￥ｐｕｔｉｄａ￥）Ｓ
   ＣＲＣ−７４４株（ＦＥＲＭ　Ｐ−９０３９）である特
   許請求の範囲第２項記載のアミノ酸ラセマーゼ。