JPS6012977A - アミノアシラ−ゼ - Google Patents
アミノアシラ−ゼInfo
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- JPS6012977A JPS6012977A JP58120255A JP12025583A JPS6012977A JP S6012977 A JPS6012977 A JP S6012977A JP 58120255 A JP58120255 A JP 58120255A JP 12025583 A JP12025583 A JP 12025583A JP S6012977 A JPS6012977 A JP S6012977A
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- JP
- Japan
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- enzyme
- activity
- benzoylglycine
- benzoyl
- aminoacylase
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
に分解する新規なアミノアシラーゼに関するものである
。
。
アミノアシラーゼ.ま各種のものが知られているが、そ
のほとんどは脂肪族アンルアミノ酸に対して高分解活性
を示し、芳香族アシルアミノ酸を分解するものは微生物
起源のものがいくつか知られているにすぎない。
のほとんどは脂肪族アンルアミノ酸に対して高分解活性
を示し、芳香族アシルアミノ酸を分解するものは微生物
起源のものがいくつか知られているにすぎない。
本発明者らは、サルコイド−シスの診断などに利用され
るアンジオテンシン変換酸素の活性測定法(特公昭58
−23080号など)、あるいはカルボキシベゾチダー
ゼAの活性測定法(特願昭57−193466号など)
にアミノアシラーゼを利用するために、芳香族アシルア
ミノ酸を分解する活性の高いアミノアシラーゼを取得す
るべく広く微生物を探索し、先にコリネバクテリウム・
エクイ( Corynebacterium equi
) H−7株がN−ペンゾイルーLーアラニンに高分
解活性を有するアミノアシラーゼを産生ずることを見出
しだ(特開昭57−86292号)。そして、さらに研
究を進め、今回N−ベンゾイルグリシンに高分解活性を
有する新規なアミノアシラーゼをシュードモナス属に属
する細菌が産生ずることを見出し、これに基いて本発明
を完成するに至った。
るアンジオテンシン変換酸素の活性測定法(特公昭58
−23080号など)、あるいはカルボキシベゾチダー
ゼAの活性測定法(特願昭57−193466号など)
にアミノアシラーゼを利用するために、芳香族アシルア
ミノ酸を分解する活性の高いアミノアシラーゼを取得す
るべく広く微生物を探索し、先にコリネバクテリウム・
エクイ( Corynebacterium equi
) H−7株がN−ペンゾイルーLーアラニンに高分
解活性を有するアミノアシラーゼを産生ずることを見出
しだ(特開昭57−86292号)。そして、さらに研
究を進め、今回N−ベンゾイルグリシンに高分解活性を
有する新規なアミノアシラーゼをシュードモナス属に属
する細菌が産生ずることを見出し、これに基いて本発明
を完成するに至った。
本発明のアミノアンラーゼはN−ベンゾイルグリシン及
びN−ペンゾイルーLーアラニンを分解し、N−ベンゾ
イルグリシンを分解する活性がN−ベンゾイルーL−ア
ラニンを分解する活性よシ大きく、かつN−アセチルグ
リシン及びN−ベンゾイル−D−アラニンを分解する活
性がいずれもN−ベンゾイルグリシンを分解する活性の
1/20以下のものである。
びN−ペンゾイルーLーアラニンを分解し、N−ベンゾ
イルグリシンを分解する活性がN−ベンゾイルーL−ア
ラニンを分解する活性よシ大きく、かつN−アセチルグ
リシン及びN−ベンゾイル−D−アラニンを分解する活
性がいずれもN−ベンゾイルグリシンを分解する活性の
1/20以下のものである。
実施例で得られた精製酵素標品の理化学的性質を次に示
す。
す。
(1) 作用
本酵素はN−ベンゾイルグリシンを加水分解して安息香
酸とグリシンを生成する。
酸とグリシンを生成する。
(2)基質特異性
各種アミノ酸のN−アシル誘導体を基質として酵素活性
を測定した結果を第1表に示す。表中の酵素活性はN〜
ベンゾイルグリシンに対する活性を100とした相対活
性で表示しである。この表に示すように本酵素はN−ベ
ンゾイルグリシン及rjN−−!7ゾイルーL−アラニ
ンをよく分解シ、特KN−ベンゾイルグリシンを分解す
る活性が大きく、かつN−アセチルグリシンを分解する
活性がN−ベンゾイルグリシンを分解する活性の171
00以下である。
を測定した結果を第1表に示す。表中の酵素活性はN〜
ベンゾイルグリシンに対する活性を100とした相対活
性で表示しである。この表に示すように本酵素はN−ベ
ンゾイルグリシン及rjN−−!7ゾイルーL−アラニ
ンをよく分解シ、特KN−ベンゾイルグリシンを分解す
る活性が大きく、かつN−アセチルグリシンを分解する
活性がN−ベンゾイルグリシンを分解する活性の171
00以下である。
第1表
基 質 相対活性
N−アセチルグリシン O
N−ベンゾイルグリシン 100
N−ベンゾイル−し−アラニン 29
N−ベンゾイル−D−アラニン 〈5
N−ベンゾイル−DL−2−アミ
ノ酪酸 11
N−ベンゾイル−し−バリン く5
N−ベンゾイル−DL−ロイシン く5N−ベンゾイル
−DL−メチオニン ON−ベンゾイル−L−フェニル
アラニン 101N−ペン7’イル−D−フェニルアラ
ニア Q(3)至適PH及び安定PH範囲 N−ベンゾイルグリシンを基質として、0.1Mリン酸
ナトリウム緩衝液pH6,0〜8.0(白丸)、02M
ホウ酸緩衝液PI48.0〜9.0(黒丸)及び0.1
M炭酸緩衝液pH9,0〜10.0 (三角)を用いて
、37℃で10分間反応させて至適PHを測定した結果
を第1図に示す。図から明らかなように本酵素の至適P
F(は7.0〜8.0にある・次に、本酵素を0.1
M酢酸緩衝液pH4,0〜55(三角)、0.1Mリン
酸ナトリウム緩衝液pH6,0〜8.0(白丸)、0.
2 M *つ酸緩衝液pH8,0〜9.5(黒丸)及び
0.1 M炭酸緩衝液pH9,0〜10.5(四角)の
各緩衝液中で37℃1時間加熱し、残存する酵素活性を
測定した結果を第2図に示す。
−DL−メチオニン ON−ベンゾイル−L−フェニル
アラニン 101N−ペン7’イル−D−フェニルアラ
ニア Q(3)至適PH及び安定PH範囲 N−ベンゾイルグリシンを基質として、0.1Mリン酸
ナトリウム緩衝液pH6,0〜8.0(白丸)、02M
ホウ酸緩衝液PI48.0〜9.0(黒丸)及び0.1
M炭酸緩衝液pH9,0〜10.0 (三角)を用いて
、37℃で10分間反応させて至適PHを測定した結果
を第1図に示す。図から明らかなように本酵素の至適P
F(は7.0〜8.0にある・次に、本酵素を0.1
M酢酸緩衝液pH4,0〜55(三角)、0.1Mリン
酸ナトリウム緩衝液pH6,0〜8.0(白丸)、0.
2 M *つ酸緩衝液pH8,0〜9.5(黒丸)及び
0.1 M炭酸緩衝液pH9,0〜10.5(四角)の
各緩衝液中で37℃1時間加熱し、残存する酵素活性を
測定した結果を第2図に示す。
本酵素はpH6,0〜7oの範囲において最も安定であ
る。
る。
(4) 力価の測定法
酵素液0.05 mlに100 mMリン酸ナナトリウ
ム緩衝液pH8,0) 0.45mlを加え、37℃で
5分間予熱した後、10mMN−ベンゾイルグリシン溶
液1、 Ozttlを加えて37℃でio分間反応させ
る。反応液にトリクロル酢酸1. ’Orrtlを加え
て反応を停止させ、生成したグリシンをニンヒドリン法
で定量する。
ム緩衝液pH8,0) 0.45mlを加え、37℃で
5分間予熱した後、10mMN−ベンゾイルグリシン溶
液1、 Ozttlを加えて37℃でio分間反応させ
る。反応液にトリクロル酢酸1. ’Orrtlを加え
て反応を停止させ、生成したグリシンをニンヒドリン法
で定量する。
ニンヒドリン法による定量はムーアらの方法(S、Mo
ore and W、H,5tein 、J、Biol
、Chem 、+ vol。
ore and W、H,5tein 、J、Biol
、Chem 、+ vol。
211、P2O3(1954))に準じて下記のように
行なった。すなわち、反応液を遠心分離し、その上清1
. Orulにニンヒドリン試乗0.2 WLlを加え
煮沸水浴中で15分間加熱し、ただちに50係エタノー
ル2.0 mlを加える。水冷後、575 nmで比色
し、同様にしてめたグリシンの標準的2腺からグリノン
の生成量を定量した。
行なった。すなわち、反応液を遠心分離し、その上清1
. Orulにニンヒドリン試乗0.2 WLlを加え
煮沸水浴中で15分間加熱し、ただちに50係エタノー
ル2.0 mlを加える。水冷後、575 nmで比色
し、同様にしてめたグリシンの標準的2腺からグリノン
の生成量を定量した。
酵素活性は、1分間に1μmolのグリシンを生成する
酵素量を1単位とした。
酵素量を1単位とした。
(5)作用適温の範囲
各温度において、力価の測定方法に準じて酵素活性を測
定した結果を第3図に示す。図から明らかなように、本
酵素の作用適温の範囲は20〜50℃である。
定した結果を第3図に示す。図から明らかなように、本
酵素の作用適温の範囲は20〜50℃である。
(6) PH%温度などによる失活の条件本酵素は、第
2図に示したように、37℃1時間の処理でpH4以下
及びPH10,5以上でほぼ完全に失活し、PH5及び
PH9では活性がほぼ半分になる。
2図に示したように、37℃1時間の処理でpH4以下
及びPH10,5以上でほぼ完全に失活し、PH5及び
PH9では活性がほぼ半分になる。
次に、本酵素’t、0.1M’Jン酸すトリウム緩衛
□液pH7,0中で各温度で30分間加熱後、残存活性
を測定した結果を第4図に示す。図に示すように、本酵
素は50℃30分間の加熱では失活しないが、60℃3
0分間の処理で70%が失活し、70℃30分間の処理
でほぼ完全に失活する。
□液pH7,0中で各温度で30分間加熱後、残存活性
を測定した結果を第4図に示す。図に示すように、本酵
素は50℃30分間の加熱では失活しないが、60℃3
0分間の処理で70%が失活し、70℃30分間の処理
でほぼ完全に失活する。
(7) 阻害、活性化及び安定化
各種金属イオン、金属キレート剤及びSH阻害剤を終濃
度が第2表に示す濃度になるように反応液に加えたとき
の本酵素の活性に及はす影響を第2表にまとめて示す。
度が第2表に示す濃度になるように反応液に加えたとき
の本酵素の活性に及はす影響を第2表にまとめて示す。
この表の相対活性は無添加の場合の活性を100として
表示しである。尚、表には示してい%、本酵素はクロル
イオンの存在によって安定化される。
表示しである。尚、表には示してい%、本酵素はクロル
イオンの存在によって安定化される。
第2表
薬 剤 濃度 相対活性
8− ヒドロキシキノリン 〃 0
α、α′−ソピリジル 〃 。
エチレンジアミン四酢酸 IQmM 100モノヨード
酢酸 1mM O p−クロロ水銀安息香酸 〃 O Hg” O Cu″〃O N1 〃 O Zn” ” 100 Fe廿 〃76 Fet 〃 100 Co” 〃 90 Mn″″ tt 51 Mg″ “ io。
酢酸 1mM O p−クロロ水銀安息香酸 〃 O Hg” O Cu″〃O N1 〃 O Zn” ” 100 Fe廿 〃76 Fet 〃 100 Co” 〃 90 Mn″″ tt 51 Mg″ “ io。
Ba″+ 〃82
無添加 100
(8)精製方法
培養後、菌体から酵素を抽出した液を、0,1M塩化ナ
トリウムを含む0.OIMリン酸ナトリウムW N W
で平衡化したノエチルアミノエチルセルロースのカラム
に流して酵素を吸着させ、0.25M塩化ナトリウムを
含む同緩衝液で溶出し、活性区分を集める。この活性区
分に硫酸アンモニウムを40%飽和になるように加え、
生成した沈澱を集める。この沈澱を少量の0.1M塩化
ナトリウムを含む同緩衝液に溶解し、同緩衝液に対して
一夜透析する。透析物をO,l M塩化ナトリウム及び
5mMメルカノトエタノールを含む同緩衝液で平衡化し
たセファロースCL −6Bのカラムを用いてグル濾過
を行ない、活性画分を集めてそれに硫酸アンモニウムを
20%飽和になるように加える。生成した沈澱物を遠心
して除去し、上清液にさらに硫酸アンモニウムを40%
飽和になるように加えて生。
トリウムを含む0.OIMリン酸ナトリウムW N W
で平衡化したノエチルアミノエチルセルロースのカラム
に流して酵素を吸着させ、0.25M塩化ナトリウムを
含む同緩衝液で溶出し、活性区分を集める。この活性区
分に硫酸アンモニウムを40%飽和になるように加え、
生成した沈澱を集める。この沈澱を少量の0.1M塩化
ナトリウムを含む同緩衝液に溶解し、同緩衝液に対して
一夜透析する。透析物をO,l M塩化ナトリウム及び
5mMメルカノトエタノールを含む同緩衝液で平衡化し
たセファロースCL −6Bのカラムを用いてグル濾過
を行ない、活性画分を集めてそれに硫酸アンモニウムを
20%飽和になるように加える。生成した沈澱物を遠心
して除去し、上清液にさらに硫酸アンモニウムを40%
飽和になるように加えて生。
成した沈澱物を集める。この沈澱物を少量の0.1M塩
化ナトリウム及び5mMメルカグトエタノールを含む0
.OIMIJン酸ナトリウム緩衝液に溶解後回緩衝液に
対して一夜透析し、精製酵素標品を得る。
化ナトリウム及び5mMメルカグトエタノールを含む0
.OIMIJン酸ナトリウム緩衝液に溶解後回緩衝液に
対して一夜透析し、精製酵素標品を得る。
(9) 分子量
ケ゛ル瀘過法によってめた分子量は工8万であった@
00 等電点
pH3,5〜100のキャリアアンホラインを用いたア
イソエレクトリックフォーカソング法によって測定した
等電点け4.3であった。
イソエレクトリックフォーカソング法によって測定した
等電点け4.3であった。
以上の理化学的性質のうち、本酵素は特に基質特異性が
従来のアミノアシラーゼと異なる。すなわち、従来のア
ミノアシラーゼのほとんどは脂肪族アシルアミノ酸に対
してのみ高分解活性を示し、芳香族アシルアミノ酸を分
解するものは微生物起源のものにいくつか知られている
にすぎない。そして、この芳香族アシルアミノ酸を分解
するものはいずれもアシル−D−アミノ酸をも分解する
。
従来のアミノアシラーゼと異なる。すなわち、従来のア
ミノアシラーゼのほとんどは脂肪族アシルアミノ酸に対
してのみ高分解活性を示し、芳香族アシルアミノ酸を分
解するものは微生物起源のものにいくつか知られている
にすぎない。そして、この芳香族アシルアミノ酸を分解
するものはいずれもアシル−D−アミノ酸をも分解する
。
一方、本酵素はN−ベンゾイルグリシンなどの芳香族ア
シルアミノ酸に対しては高分解活性を示すがN−アセチ
ルグリシンなどの脂肪族アフルアミノ酸をほとんど分解
せず、N−ベンゾイル−D−アラニンなどのアシル−D
−アミノ酸に対する分解活性も低い。
シルアミノ酸に対しては高分解活性を示すがN−アセチ
ルグリシンなどの脂肪族アフルアミノ酸をほとんど分解
せず、N−ベンゾイル−D−アラニンなどのアシル−D
−アミノ酸に対する分解活性も低い。
また、本発明者らの既出願のものは芳香族アシルアミノ
酸に対して高分解活性を有するが、この酵素はそのうち
で特にN−ベンゾイル−し−アラニンに対する分解活性
が高く、N−ベンゾイルグリシンに対する活性はあまり
大きくない。しかるに、本酵素は、芳香族アシルアミノ
酸のなかでも特にN〜ベンゾイルグリシンに対する分解
活性が大きく、このような酵素は従来知られていなかっ
たのであるから、本酵素は明らかに新規である。
酸に対して高分解活性を有するが、この酵素はそのうち
で特にN−ベンゾイル−し−アラニンに対する分解活性
が高く、N−ベンゾイルグリシンに対する活性はあまり
大きくない。しかるに、本酵素は、芳香族アシルアミノ
酸のなかでも特にN〜ベンゾイルグリシンに対する分解
活性が大きく、このような酵素は従来知られていなかっ
たのであるから、本酵素は明らかに新規である。
本発明の酵素は、例えば本発明者らが北海道の土壌から
分離した微生物シュードモナス・プチダ(Pseudo
monas putida ) A C692−3から
産生させることができる。このンユードモナス・グチダ
扁C692−3は工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研菌寄第7082号(FERM−P 7082)とし
て寄託されている。
分離した微生物シュードモナス・プチダ(Pseudo
monas putida ) A C692−3から
産生させることができる。このンユードモナス・グチダ
扁C692−3は工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研菌寄第7082号(FERM−P 7082)とし
て寄託されている。
シュードモナス・プチダA C692−3の菌学的性質
を次に示す。
を次に示す。
1形態(肉汁寒天培地、28℃24時間培養)(1)細
胞の形及び大きさ HJ胞は桿状(0,8〜1.OXl、3〜16ミクロン
)であり、多形性は示さない。
胞の形及び大きさ HJ胞は桿状(0,8〜1.OXl、3〜16ミクロン
)であり、多形性は示さない。
(2)運動性あシ。鞭毛は単極鞭毛であり、複数本形成
する。
する。
(3)胞子:形成しない
(4)グラム染色性:陰性
2生育状態
(1)肉汁寒天平板培養
コロニーは円板状で、金縁、半透明、軟質であり、表面
は光沢がある。可溶性色素は産生じない。コロニ〜の大
きさは直径1,8〜2.2關である。
は光沢がある。可溶性色素は産生じない。コロニ〜の大
きさは直径1,8〜2.2關である。
(2)肉汁寒天斜面培養
線状に良好に生育し、軟質である。表面は光沢がある。
凝縮水でも良く生育する。可溶性色素は産生じない。
(3)肉汁液体培養
適度に生育し、混濁する。沈渣を生ずる。
膜は形成しない。
(4)肉汁ゼラチン穿刺培養
表層部分で増殖するが液化しない。沈渣を生ずる。
(5)リドマスミルク
液化及び凝固しない。PHは微アルカリ性。
3、生理学的性質
(1)硝酸塩の還元:陽性
(2)脱窒反応:陰性
(3) M Rテスト:陰性
(4)vpテスト°陰性
(5)インドールの生成:陰性
(6)硫化水素の生成:陰性
(7)デンプンの加水分解:陰性
(8)クエン酸塩の利用:陽性
(9)無機窒素源の利用:硝酸塩及びアンモニウム塩の
いずれも利用する。
いずれも利用する。
00色素の生成:キングB培地で黄色螢光色素を培地中
に生成する。
に生成する。
0])ウレアーゼ:陰性
0→オキシダーゼ:陽性
(+1カタラーゼ;陽性
Oψ生生育変度4〜39℃
最適生育温度=25〜30℃
αυ酸素に対する態度:好気性
(IQ OF試験:酸化型
(171糖からの酸の生成
り−グルコース、D−Qラクトース、L−アラビノース
、D−キシロース、D−7ラクトース及びD−マンノー
スから酸を生成するが、マルトース、トレハロース、シ
ョ糖、イノシトール、D−マンニトール、乳糖、D−ノ
ルビトール及び可溶性f7ノノからは酸を生成しない。
、D−キシロース、D−7ラクトース及びD−マンノー
スから酸を生成するが、マルトース、トレハロース、シ
ョ糖、イノシトール、D−マンニトール、乳糖、D−ノ
ルビトール及び可溶性f7ノノからは酸を生成しない。
以上の諸性質をパーツエイズ・マニュアル・オノ・デタ
ーミネイティブ・バクテリオロノー(Bergeys
Mannual of、Determinative
Bacteriology )第8版、1974版の記
載と照合した結果、本菌はシー−トモナス属に属し、そ
のなかで7−−ドモナス・プチダの性質と極めてよく一
致するところから、本望をシー−トモナス・プチダと同
定した。
ーミネイティブ・バクテリオロノー(Bergeys
Mannual of、Determinative
Bacteriology )第8版、1974版の記
載と照合した結果、本菌はシー−トモナス属に属し、そ
のなかで7−−ドモナス・プチダの性質と極めてよく一
致するところから、本望をシー−トモナス・プチダと同
定した。
このような微生物を培養して本発明の酵素を産生させる
方法は微生物を培養する一般的な方法に準じて行なうこ
とができる。すなわち、培地には炭素源、窒素源、無機
塩類、その他の栄養物質などを含有するものを用いる。
方法は微生物を培養する一般的な方法に準じて行なうこ
とができる。すなわち、培地には炭素源、窒素源、無機
塩類、その他の栄養物質などを含有するものを用いる。
炭素源としては、グルコース、麦芽糖のような糖類、グ
リセロールのようなアルコール類を使用できるが、馬尿
酸とかN−ベンゾイルアラニンのような本酵素の誘導基
質が特に効果的である。窒素源としては硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウムなどの無機態の
ものでもよく、酵母エキス、肉エキス、Kゾトンのよう
な有機態のものでもよい。無機塩類としては塩化ナトリ
ウムのほかには、リン酸2カリウム、リン酸2ナトリウ
ム、硫酸マグネシウム等の通常の無機塩を使用すること
ができる。
リセロールのようなアルコール類を使用できるが、馬尿
酸とかN−ベンゾイルアラニンのような本酵素の誘導基
質が特に効果的である。窒素源としては硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウムなどの無機態の
ものでもよく、酵母エキス、肉エキス、Kゾトンのよう
な有機態のものでもよい。無機塩類としては塩化ナトリ
ウムのほかには、リン酸2カリウム、リン酸2ナトリウ
ム、硫酸マグネシウム等の通常の無機塩を使用すること
ができる。
培養方法としては、通常は液体培養が好ましく、15〜
37℃、好ましくは25〜35℃、PH5〜8で10〜
50時間好気的条件下で培養する。この培養によって本
酵素の大部分は菌体内に蓄積される。
37℃、好ましくは25〜35℃、PH5〜8で10〜
50時間好気的条件下で培養する。この培養によって本
酵素の大部分は菌体内に蓄積される。
培養終了後は培養物をそのま捷酵素源として牙1用して
もよいが、通常は分離精製を行なう。分tel方法とし
ては、1ず菌体を遠心等の常法により分離し、磨砕、リ
ゾチーム等の溶菌酵素による溶菌、超音波処理、圧力/
ヨツク法、自己消化法等によって菌体を破壊し、酵素を
抽出する。破壊した菌体残渣を分離して酵素抽出液を得
、硫酸アンモニウム等を用いる塩析法、アセトン、エタ
ノール等ヲ用いる溶媒沈澱法、セファデックス、セファ
ロースダル等を用いるダル涙過法、イオン交換樹月旨等
を用いる吸着法等を適宜組合せて精製を行ない、目的と
する純度の酵素標品を得る。
もよいが、通常は分離精製を行なう。分tel方法とし
ては、1ず菌体を遠心等の常法により分離し、磨砕、リ
ゾチーム等の溶菌酵素による溶菌、超音波処理、圧力/
ヨツク法、自己消化法等によって菌体を破壊し、酵素を
抽出する。破壊した菌体残渣を分離して酵素抽出液を得
、硫酸アンモニウム等を用いる塩析法、アセトン、エタ
ノール等ヲ用いる溶媒沈澱法、セファデックス、セファ
ロースダル等を用いるダル涙過法、イオン交換樹月旨等
を用いる吸着法等を適宜組合せて精製を行ない、目的と
する純度の酵素標品を得る。
本発明の酵素はN−ベンゾイルグリシン及びN−ベンゾ
イル−L−アラニンをよく分解するところに特徴があり
、アンノオテンシンエ変換酵素の活性測定法及びカルぎ
キシ4fチダーゼAの活性測定法などに有用である。
イル−L−アラニンをよく分解するところに特徴があり
、アンノオテンシンエ変換酵素の活性測定法及びカルぎ
キシ4fチダーゼAの活性測定法などに有用である。
以下実施例を示す。
実施例
グルコース1%、イア’)ン1%、肉エキス0.5゛チ
、塩化ナトリウム03%、酵母エキス0.25 %、リ
ン酸2カリウム0.05%及び硫酸マグネシウム0.0
5%からなルpH7,0ノ培地200 rttlを50
0ru/!容三角フラスコに分;主し、120℃で20
分間加熱して滅菌した。冷却後、シュードモナス・プチ
ダ篇C692−3(微工研菌寄第7082号)を接種し
、28℃で20時間振i培養して種培養液とした。
、塩化ナトリウム03%、酵母エキス0.25 %、リ
ン酸2カリウム0.05%及び硫酸マグネシウム0.0
5%からなルpH7,0ノ培地200 rttlを50
0ru/!容三角フラスコに分;主し、120℃で20
分間加熱して滅菌した。冷却後、シュードモナス・プチ
ダ篇C692−3(微工研菌寄第7082号)を接種し
、28℃で20時間振i培養して種培養液とした。
本培養の培地として、馬尿酸1%、酵母エキス0.3%
、硝酸ナトリウム02係、リン酸2カリウム0.1%、
塩化ナトリウム0.05%及び硫酸マグネシウム0.0
5%からなるpH7,0の培地601を901容ツヤ−
ファーメンタ−に仕込み、120℃で20分間滅菌した
。冷却後、種培養液1.21全接種し、28℃で20時
間通気攪拌培養を行なった。その間、通気量は0.5υ
?7mとし、攪拌羽根の回転数は300 rpmとした
。
、硝酸ナトリウム02係、リン酸2カリウム0.1%、
塩化ナトリウム0.05%及び硫酸マグネシウム0.0
5%からなるpH7,0の培地601を901容ツヤ−
ファーメンタ−に仕込み、120℃で20分間滅菌した
。冷却後、種培養液1.21全接種し、28℃で20時
間通気攪拌培養を行なった。その間、通気量は0.5υ
?7mとし、攪拌羽根の回転数は300 rpmとした
。
培養終了後、培養液を遠心して700gの湿菌体を得た
。この菌体を0.1M塩化ナトリウムを含む0.01M
リン酸すトリウム緩衝液(pH7,0)31に懸濁し、
グイノーミル(KDL型)を用いて:300 Orpm
、流量30 ++4’minで菌体を破砕した。
。この菌体を0.1M塩化ナトリウムを含む0.01M
リン酸すトリウム緩衝液(pH7,0)31に懸濁し、
グイノーミル(KDL型)を用いて:300 Orpm
、流量30 ++4’minで菌体を破砕した。
遠心して菌体残渣を除き、酵素抽出液354を得た。
0.1M塩化ナトリウムを含むリン酸ナトリウム緩衝液
PH7,0で平衡化しだDEAEセルロース1kg?こ
の酵素抽出液に加え、6℃で2時間攪拌して酵素を吸着
させた。このDEAEセルロースを同緩衝液で充分に洗
浄し、0.25 M塩化ナトリウム及び5mMメルカノ
トエタノールを含むリン酸ナトリウム緩衝液(pH7,
0)21で本酵素を溶出した。溶出液に硫酸アンモニウ
ムを40%飽和になるように加え、生じた沈澱を集めた
。この沈澱を、少量の0.1M塩化ナトリウム及び5m
M メルカゾトエタノールを含む0.01 M IJン
酸ナナトリウム緩衝液 pH7,0)に溶解し、同緩衝
液に対して一夜透析した。透析物を同緩衝液で平衡化し
たセファロースCL−6Bのカラムに流してケ8ルp過
を行なった。
PH7,0で平衡化しだDEAEセルロース1kg?こ
の酵素抽出液に加え、6℃で2時間攪拌して酵素を吸着
させた。このDEAEセルロースを同緩衝液で充分に洗
浄し、0.25 M塩化ナトリウム及び5mMメルカノ
トエタノールを含むリン酸ナトリウム緩衝液(pH7,
0)21で本酵素を溶出した。溶出液に硫酸アンモニウ
ムを40%飽和になるように加え、生じた沈澱を集めた
。この沈澱を、少量の0.1M塩化ナトリウム及び5m
M メルカゾトエタノールを含む0.01 M IJン
酸ナナトリウム緩衝液 pH7,0)に溶解し、同緩衝
液に対して一夜透析した。透析物を同緩衝液で平衡化し
たセファロースCL−6Bのカラムに流してケ8ルp過
を行なった。
得られた活性区分に硫酸アンモニウムを20%飽和にな
るように加え、生じた沈澱を遠心して除去した。上清に
さらに硫酸アンモニウムを40%飽和になるように加え
、生じた沈澱を遠心分離した。
るように加え、生じた沈澱を遠心して除去した。上清に
さらに硫酸アンモニウムを40%飽和になるように加え
、生じた沈澱を遠心分離した。
この沈澱を少量の同緩衝液に溶解し、同じ緩衝液に対し
て一夜透析して、比活性560単位/ダ(蛋白)の精製
酵素標品470,000単位を収率60チで得た。
て一夜透析して、比活性560単位/ダ(蛋白)の精製
酵素標品470,000単位を収率60チで得た。
第1図は本酵素の至適PHを示す曲線を表わしたもので
あり、第2図はPH安定性を示す曲線を表わしたもので
ある。第3図は作用適温を、そして第4図は熱安定性を
それぞれ示すものである。 特許出願人 富士レビオ株式会社 代理人弁理士田中政浩 第1図 H 第 2 図 H 第3図 i&□C 第4図 羞 l′C 第1頁の続き 0発 明 者 上岡淳子 宇部市大字中野開作字七の割46 4−1富士レビオ株式会社宇部 研究所内 0発 明 者 西本啓司 宇部市大字中野開作字七の割46 4−1富士レビ4株式会社宇部 研究所内 0発 明 者 元木義信 宇部市大字中野開作字七の割46 4−1富士レビオ株式会社宇部 研究所内
あり、第2図はPH安定性を示す曲線を表わしたもので
ある。第3図は作用適温を、そして第4図は熱安定性を
それぞれ示すものである。 特許出願人 富士レビオ株式会社 代理人弁理士田中政浩 第1図 H 第 2 図 H 第3図 i&□C 第4図 羞 l′C 第1頁の続き 0発 明 者 上岡淳子 宇部市大字中野開作字七の割46 4−1富士レビオ株式会社宇部 研究所内 0発 明 者 西本啓司 宇部市大字中野開作字七の割46 4−1富士レビ4株式会社宇部 研究所内 0発 明 者 元木義信 宇部市大字中野開作字七の割46 4−1富士レビオ株式会社宇部 研究所内
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 N−ベンゾイルグリシン及びN−ベンゾイル−L−アラ
ニンを分解し、N−ベンゾイルグリシンを分解する活性
がN−ベンゾイル−L−アラニンを。 分解する活性よシ大きく、かっ、N−アセチルグリシン
及びN−ベンゾイル−D−アラニンを分解する活性がい
ずれもN−ベンゾイルグリシンを分解する活性のl/2
0以下であることによって特徴づけられたアミノア7ラ
ーゼ
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58120255A JPS6012977A (ja) | 1983-07-04 | 1983-07-04 | アミノアシラ−ゼ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP58120255A JPS6012977A (ja) | 1983-07-04 | 1983-07-04 | アミノアシラ−ゼ |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6012977A true JPS6012977A (ja) | 1985-01-23 |
JPH0337B2 JPH0337B2 (ja) | 1991-01-07 |
Family
ID=14781668
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP58120255A Granted JPS6012977A (ja) | 1983-07-04 | 1983-07-04 | アミノアシラ−ゼ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6012977A (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6144350B2 (ja) | 2013-09-13 | 2017-06-07 | 富士フイルム株式会社 | レーザー彫刻用フレキソ印刷版原版の製造方法、フレキソ印刷版の製版方法、および、レーザー彫刻用樹脂組成物 |
-
1983
- 1983-07-04 JP JP58120255A patent/JPS6012977A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0337B2 (ja) | 1991-01-07 |
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