JPH0251596B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（発明の目的） 本発明は、酒類又は酒類のもろみ中に含まれ、
酒質の劣化の原因となる尿素を分解するためのウ
レアーゼの製造法に関するものである。 （従来の技術及び問題点） 酒類及び発酵食品は、発酵に関与する酵母及び
糸状菌の代謝生産物として尿素が含まれている。
例えば、清酒中には数ppmから50ppm程度の尿素
が含まれている。尿素が多くなるような発酵条件
で製造した清酒は苦味や雑味が多く、貯蔵熟成中
に着色しやすく、老香（ひねか）も発生しやす
い。 また、酒類中から発ガン性物質とされているカ
ルバミン酸エチルが検出されている（J.Agric.
food Chem.、24、323（1976））。カルバミン酸エ
チルの生成系路の一つとして、酒類中の尿素とエ
タノールから非酵素的に生成する系が考えられて
いる。 酒質の安定化のため、尿素を酒類から除去する
手段として発明者らの一人はウレアーゼ活性を有
する酵素剤を酒類に添加する方法を発明した（特
許公告 昭56−20830）。通常、ウレアーゼの多く
は中性〜微アルカリ性に反応至適PHをもち、酒類
やもろみのような酸性かつアルコール存在下では
ほとんど活性を示さず、しかも不安定であること
が知られている（Eur.J.Biochem.、73、185
（1977）、The Enzymes 3rd ed.4、１（1971））。 酸性領域に反応至適PHをもつウレアーゼとして
ラクトバチルス・フアーメンタム
（Lactobacillus fermentum）の生成するウレア
ーゼが知られている（Appl.Environ.Microbiol.、
37、379（1979））。しかし、本菌は嫌気性菌であ
り、培養効率は著しく悪く、また、耐熱性である
ため、清酒の火入れ後もその活性が残存すること
が問題である。 （問題点を解決するための手段） そこで、本発明者らは、酒類に使用するに適す
るウレアーゼの特性として、下記の条件を設定
し、それに適するウレアーゼを生産する微生物を
広く自然界より検索した。 本発明の目的とする微生物の条件 酸性領域のPHで活性を示すウレアーゼを生産
する。 高濃度アルコール存在下で活性を示すウレア
ーゼを生産する。 培養効率のよい好気性菌である。 微生物の生産したウレアーゼは反応終了後速
やかに失活する性質を有する。 なお、前記の条件は、尿路に感染した細菌の
ウレアーゼの作用で生じたアンモニアが尿道結石
の原因の一つである（家庭薬研究No.４、３
（1985））といわれていることから、酒類に添加し
たウレアーゼ活性は目的の反応が終了後、火入れ
等により容易に失活することが実用上望ましい。 以上の条件を満たす菌株として、シユードモナ
ス属に属する一菌株（U2838）が岡山県の土壌か
ら分離された。本菌株を液体培養又は固体培養
し、生産されたウレアーゼを必要に応じ精製して
酒類中の尿素を分解除去するための酵素剤として
利用することができる。本菌株は微工研菌寄第
9793号（FERM Ｐ−9793）として工業技術院微
生物工業研究所に寄託されている。 本発明の菌株の菌学的性質の検討には微生物の
分類と同定下巻（長谷川武治編著、学会出版セン
ター）、医学細菌同定の手びき（Cowan and
Steel著、坂崎利一訳、近代出版）及び新細菌培
地学講座・上（坂崎利一著、近代出版）に記載さ
れている方法及び培地組成を用いた。 Ａ 形 態 (1) 細胞の形：桿菌 (2) 細胞の大きさ：0.5〜0.8ミクロン×1.5×
4.0ミクロン (3) 細胞の多形性の有無：なし (4) 運動性：あり (5) 鞭毛の着生状態：極鞭毛 (6) 胞子の有無：なし (7) グラム染色性：陰性 (8) 抗酸性：なし Ｂ 各種培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養：コロニーの生育状況は
適度、形状は円形、隆起は突円状、周縁は全
縁、色状は淡褐色。 (2) 肉汁寒天斜面培養：生育状態は適度、表面
の状態は円滑、色状は淡褐色、光沢は半透
明、形状は糸状。 (3) 肉汁液体培養：混濁の程度は適度、液面の
生育は絮状、沈殿を生じる。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養：液化せず (5) リトマス・ミルク：リトマスを還元する。 Ｃ 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元：− (2) 脱窒反応：− (3) MRテスト：− (4) VPテスト：− (5) イン．ドールの生成：− (6) 硫化水素の生成：− (7) デンプンの加水分解：− (8) クエン酸の利用Koserの培地：＋ (9) 〃 Christensenの培地：＋ (10) 硝酸塩の利用：＋ (11) アンモニウム塩の利用：＋ (12) 色素の生成：水溶性蛍光色素生成あり（シ
ユードモナスＰ寒天培地） (13) ウレアーゼ：＋ (14) オキシダーゼ：＋ (15) カタラーゼ：＋ (16) 生育できるPH範囲：５〜９ (17) 生育限界最高温度：33℃ (18) ４℃における生育：＋ (19) 酸素に対する態度：好気性 (20) Ｏ−Ｆテスト：オキシデイテイブ (21) 糖から酸及びガスの生成

【表】

【表】 (22) カゼインの分解：− 以上の菌学的性質に従い、本発明の菌株U2838
株の分類学的地位をバージエイズ・マニユアル・
オブ・デターミネイテブバクテリオロジー
（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology）第８版に基づいて検索した結果、
この菌株はグラム陰性桿菌、極鞭毛を有し、
運動性がある、好気性、カタラーゼ及びオキ
シダーゼ陽性、グルコースを酸化的に分解する
ことから、シユードモナス（Pseudomonas）属
に含まれる細菌であると考えられる。 本菌株の培養は通常行われている通気撹拌培
養、振とう培養、静置培養などの液体培養法もし
くは固体培養法を用いて行うことができる。 培地組成としては、炭素源としてグルコース、
シユクロース、デンプンなど、窒素源としてペプ
トン、酵母エキス、尿素、硫安など、無機塩とし
てリン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カル
シウムなど、その他必要に応じてZn²⁺、Cu²⁺、
Fe²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Mo⁶⁺などの微量金属やパ
ントテン酸、ビオチン、チアミン、ビタミンB₁₂
などのビタミン、メチオニン、シスチン、トリプ
トフアン、アルギニン、ヒスチジンなどのアミノ
酸、EDTAなどのキレート剤を適宜加えたもの
を用いるが、通常の培養にはブイヨンなどの天然
培地が簡便である。培地のPHは、5.5〜7.8の間で
ウレアーゼの生産にほとんど影響しないが、やや
酸性側の方が望ましい。培養温度は生育できる範
囲ならとくに限定されないが、30℃付近か30℃よ
りもやや低めの温度が望ましい。培養はいずれの
培養法においても５〜72時間行う。 このような方法で得られた培養物からウレアー
ゼを採取するには、はじめに遠心分離法やロ過法
により培養物を遠沈上澄と菌体に分画する。得ら
れた菌体をガラスビーズ法、フレンチプレス法、
超音波処理法、浸透圧シヨツク法、リゾチーム処
理、有機溶媒処理、自己溶解法などを単独あるい
は組合せて菌対破砕を行い、菌体残渣を除去する
ことにより粗酵素標品を得ることができる。 更に、必要に応じた濃縮標品や精製標品を得る
ためには、限外ロ過、透析、塩析、溶媒沈殿、イ
オン交換クロマトグラフイー、ゲルロ過クロマト
グラフイー、吸着クロマトグラフイー、等電点沈
殿など周知の精製方法を単独あるいは組合せて達
成することができる。このようにして精製された
本菌株のウレアーゼの酵素学的性質は以下のとお
りである。 熱安定性 0.1Mコハク酸緩衝液（PH4.5）及び20％
（Ｖ／Ｖ）エタノール含有0.1Mコハク酸緩衝液
（PH4.5）中で30〜70℃、15分間処理し、各温度
における残存活性を測定した。エタノール無添
加では40℃まで安定であつたが、エタノール含
有条件では温度が上昇するに従つて急速に失活
し、45℃では完全に失活した。（図１） 至適温度 0.1Mコハク酸緩衝液（PH4.3）及び20％
（Ｖ／Ｖ）エタノール含有0.1Mコハク酸緩衝液
（PH4.3）中における至適温度はエタノール無添
加では40℃付近、エタノール含有条件では25℃
付近にある。（図２） PH安定性 0.1Mコハク酸緩衝液（PH３〜７）及び20％
（Ｖ／Ｖ）エタノール含有0.1Mコハク酸緩衝液
（PH３〜７）中で８℃、24時間処理後の残存活
性はエタノール無添加ではPH５付近、エタノー
ル含有条件ではPH6.5付近が最も安定である。
（図３） 至適度PH 0.1Mコハク酸緩衝液における至適PHは、エ
タノール無添20％エタノール含有の両条件下、
PH５付近である。（図４） エタノール耐性 ０〜30％（Ｖ／Ｖ）のエタノールを含有した
0.1Mコハク酸緩衝液（PH4.3）中での酵素活性
は10％付近まで安定であり、20％エタノール含
有条件でもエタノール無添加の場合の80％以上
の活性を示す。 尿素に対するKm値 20％エタノール含有0.1Mコハク酸緩衝液
（PH4.3）30℃におけるKm値は約13ｍＭである。 分子量 ゲルロ過担体としてTSKgel G3000SWXL
（MW＜５×10⁵）φ7.8ｍ×30cmカラムを用い、
0.05M酢酸ナトリウム緩衝液（PH5.6）−10％グ
リセロール−１ｍMEDTA−0.05％NaN₃の組
成の緩衝液を0.2ml／minの流速で流す高速液
体クロマトグラフイーを行い、各種標準タンバ
ク質との相対溶出保持時間から分子量を算出し
た結果、本酵素の分子量は約370000であつた。 基質特異性 20％エタノール含有0.1Mコハク酸緩衝液
（PH4.3）における基質特異性を調べた結果、30
℃、10分間の反応でアンモニアを生成した基質
は尿素のみであつた。（第１表）

【表】 また、尿素を基質とした場合、２ｍＭのアセ
トヒドロキサム酸の存在によりウレアーゼ活性
は88％阻害された。この阻害の程度はナタ豆よ
り得られているウレアーゼＳ（ベーリンガー・
マンハイム 山之内）の阻害度（87.9％）とほ
ぼ同程度であつた。 以上の酵素活性は特に断わらない限り、0.25ml
の40％エタノール含有コハク酸緩衝液（PH4.3）、
0.15mlの２％尿素液を混合した反応液に0.10mlの
酵素液を加え、30℃で10分間インキユベーシヨン
を行つた後に、メソツズ・オブ・バイオケミカ
ル・アナリシス（Methods of Biochemical
Analysis）第17巻313頁（1969年）に記載のベル
トロー（Berthlot）反応により生じた青色を625n
ｍの波長の吸光度を測定し、同時に塩化アンモニ
ウムを標準物質として作成した検量線から酵素活
性を算出した。酵素の活性単位（ユニツト）は尿
素分解量μmol／分として定義した。 （発明の効果） 本発明の生菌体及びウレアーゼ標品を用いるこ
とにより、清酒など醸造酒中の尿素がほとんど完
全に分解されることが認められた。また、清酒な
どの醸造酒あるいはウイスキーなどの蒸留酒用も
ろみ等に本ウレアーゼ標品を添加しても同様な効
果が認められた。 なお、生菌体及びウレアーゼ標品を常法により
固定化したものを用いて清酒等を処理しても尿素
の除去が可能である。 次に、本発明の実施例を示す。 実施例 １ 本菌株を常法により殺菌したブイヨンに接種
し、30℃で24時間振とう培養した培養物から遠心
分離して得た菌体を蒸留水で３回洗浄したものに
培養液に対し10倍濃縮になるように懸濁した。こ
の懸濁液0.1mlを清酒（アルコール分18.9％、日
本酒度＋８、酸度2.1、アミノ酸度1.4）10mlに添
加した。このときのウレアーゼ活性は0.22U／ml
と算出された。15℃で保存し、経常的に清酒中の
尿素濃度を尿素定量試薬キツト（東洋醸造社製）
を用いて測定した結果、12日後尿素は不検出とな
つた。（図６） 実施例 ２ ５mlのブイヨンをＬ字管に入れ、120℃にて10
分間オートクレーブ殺菌したものに、本菌株を１
白金耳ずつ接種し、30℃で15時間振とう培養した
ものを、100mlのブイヨンを500ml容坂口フラスコ
に入れ、120℃にて10分間オートクレーブ殺菌し
たもの５本に１mlずつ接種し、30℃で16時間振と
う培養した。培養物を8000rpm10分間遠心して菌
体を集め、300mlの蒸留水で洗浄後、遠心により
菌体を集め、40mlの50ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（PH7.0）−0.1ｍＭジチオスレイトール（DTT）
−１ｍMEDTAに懸濁した菌体をフレンチ・プ
レスを用い20000psiの条件で破砕した。菌体破砕
物を遠心し、その上澄液を50ｍＭリン酸ナトリウ
ム緩衝液（PH6.0）−10％グリセロール−１ｍ
MEDTA（緩衝液Ａ）に対して透析した。 透析後の粗酵素溶液20mlを陽イオン交換カラム
（TSKgelSP5PW、φ21mm×15cm）に吸着させ、
３ml／minの速度で高速液体クロマトグラフイー
を行つた。粗酵素溶液を吸着後緩衝液Ａを30分間
流し、その後、緩衝液Ａに0.5Mになるように
NaClに関して直線勾配をつけて90分間溶出を行
い、９mlずつ分取した。ウレアーゼ活性はフラク
シヨンNo.27を中心に溶出した。部分精製されたウ
レアーゼ活性は培養液の約6.8倍（3.9U／ml）に
上昇し、回収は46％であつた。 実施例 ３ 実施例２で得た部分精製ウレアーゼを0.05U／
mlになるように実施例１で用いた清酒に添加し、
15℃で保存し、清酒中の尿素濃度を経時的に測定
した。また、ウレアーゼ添加清酒を60℃で20分間
火入れしたものについても尿素の濃度を測定し
た。約12日の保存により清酒中の尿素はウレアー
ゼによりほとんど分解されたが、ウレアーゼ添加
した清酒を火入れするとウレアーゼ活性は完全に
失活した。（図７）

【図面の簡単な説明】

図１は部分精製ウレアーゼの熱安定性、図２は
至適温度、図３はPH安定性、図４は至適PH、図５
はエタノール耐性を示したグラフである。図６は
生菌体を清酒に添加した場合の尿素の分解を経時
的に測定したグラフ、図７は清酒に部分精製した
ウレアーゼを添加したときの清酒中の尿素濃度の
変化を示すグラフである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ シユードモナス属に属し、酸性領域に反応至
   適PHをもつウレアーゼ生産能を有する菌株を培養
   して、菌体内及び／又は培養液中にウレアーゼを
   生産せしめ、これを採取することを特徴とするウ
   レアーゼの製造法。