JPS58141798A - ポリアミンの分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ンの分析法に関する．ｄｌｌＪアミンは、生物界に広く
分布しているが、増殖の著しい細胞中に含量が高く、特
に腫瘍細胞中での含量が高いことから医学上でｘ蟹視さ
れている．また、癌患者の体液例えば血液、尿等の中の
４リアミン含量は健康人に比べて高いことが、／ｑ’７
，を年ラッセル等により示された。それ以後、癌と体液
中のポリアミンの濃度との相関性が多くの研究者によっ
て調べられ、ラッセル等の研究結果の妥当性が確かめら
れている。

しかし乍ら、体液中のポリアミンの定量は、そのＩｌ＆
が低いことと４リア（ン以外の種々の夾雑物が含まれて
いることから非常に困難である。

現在、最も信頼性の高いポリアミン定量法は、高速液体
クロマトグラフィーを使用する方法である。しかし、こ
の方法を使った分析所要時間は一検体について、一時間
以上であるために、研究レベルまでの分析法としての域
を脱していな１０一方、体液中のボリアオン負度を迅速
に分析することを目的として酵素法が注目されている．
酵素法によるポリアミン定量分析の原理Ｆｉ、ポリアミ
ン分解酵素を用いてポリアミンより検出容易な生成物を
得て、その生成物を検出するものである。

しかし、酵素法によるｌリアミン定量においてポリアミ
ン分解酵素として何を選択するかが問題となる。その一
つとして、グトレオン・オキシダーゼが挙げられる。グ
トレミン・オキシダーゼなる＃素は、足立婦により、ミ
クロコツカスΦｏ　−ゼウス中に見出されている〔アグ
リカルテャラル０イオロジカル・ケ２ストリー・３０巻
、／２θコ（／９６＆））。しかし、上記ミクロコツカ
ス拳ローゼウスから得られる酵素を酵素法によるポリア
ミン足置に適用する場合、次の欠点を有する。

即ｔ）、（１１ミク關コツカス・ローゼウスは菌体内に
蓄積するプトレシン−オキシダーゼの量が夕立く、＃素
の調製が煩雑である。（２）ミクロコツカス拳ローゼウ
スの細胞ｍは非常に強固であり、―体内からプトレシン
・オキシダーゼを抽出する際、特殊な機器を使って麺体
ｔ−破砕し酵素を抽出しなければならない。（３）ミク
ロコツカス・ローゼウスから得られるプトレシン・オキ
シダーゼのプトレシンに対するミカエリス定数随値が比
較的大きい（／　、　２　ｘ　／　０−’　Ｍ　）のた
め、非常に微量のポリアミン（／　０−’〜／　０−”
　Ｍ　）を定量する場合に酵素反応速度が遅くなり、従
って定量時間が長くなるという欠点がある。

本発明者等は、上記３点の欠点すなわちプトレシン・オ
キシダーゼの収率が低いこと、自体の破砕が困難である
こと、及びプトレシンに対するミカエリス定数にｍ値が
大きいことを解決するために、各種微生物中のプトレシ
ン・オキシダーゼの検策會行い１．ミクロコツカス・ロ
ーゼウス系のものに比較して、酵素生産性が３０倍以上
＾＜、ｉｍ体内の酵素比活性が３倍以上高く、さらに細
胞破砕が容易なために酵素精製が容易であり、酵素回収
量が多いシトレシン・オキシダーゼの製造方法を発明し
、先に提案した（特願昭３　！；　−９２７９２号、特
開昭５７−　　　　　号）。

本発明は、上記の製造方法により得られるミクロコツカ
ス・フラピメス系のプトレシン・オキシダーゼを用いる
ポリアミンの分析法である。

一般に、酵素法によるポリアミン定量分析は、例えば尿
中のポリアミンを適当な吸着体に吸着させた後、脱着剤
を用いてポリアミンを脱着し、得られたポリアミン溶液
に酵素を作用させて生じる過酸化水素を比色定量して行
なわれる。然るに、酵素として、ミクロコツカス・７ラ
ビダス系のプトレシン・オキシダーゼを用いた場合、脱
着剤として従来使用されている塩酸、硫酸などの酸溶液
あるいは食塩を代表とする塩類を含有する水溶液ヲ用い
ると、スペルミジンなどポリアミンの種類ＶＣよっては
、比色定量における発色強度が不安定で、且つ再埃性が
ないという欠点があることが判明した。

本発明は、かかるｔ＋Ｕａを解決すべくなされたもので
ある。

即ち、本発明は、ポリアミンを鉄層させた吸着体から脱
着剤を用いてポリアミンを脱着し、得られたポリアミン
溶液に酵素全作用させて生じる過甑化水１ｇを検出して
行なうポリアミンの分析法において、脱着剤として、ト
リクロロ酢ｉｌｌを用い、且つ酵素としてミクロコツカ
ス・フラビメス系のプトレシン・オキシダーゼを用いる
ことを特徴とするポリアミンの分析法である。

ポリアミンとしては、スペルミジン、プトレシン、スペ
ルミンなどが挙げられるが、本発明を用いて特に有効な
のは、スペルミジンであって、以下、スペルミジンをポ
リアミンの代表として説明する。

スペルミジン例えば尿中スペルミジンに酵素を作用させ
て生成する過酸化水素を、比色定量する際には、発色の
妨害物質を除去する目的で、スペルミジンを含有する尿
を適当な吸着体に接触させてスペルミジンを吸着させ、
発色妨害物質を分離除去した後に、脱着剤により、発色
妨害物質を含まないス（ル建ジン溶液を得て行なう。

吸着体としては、特に限定されず、陽イオン交換樹脂、
セルロースイオン交換体その他が挙げられるが、好まし
くは、陽イオン交換樹脂が用いられる。陽イオン交換樹
脂としては、通常の各種陽イオン交換樹脂が用いられる
が、比較的温和な条件でスペルミジンを脱着させる仁と
ができるという理由で、カル？ンｒＲＷの弱酸性陽イオ
ン交換樹−が特に好ましく用いられる。また、尿試料と
しては、採尿されたままの未逃理尿でもよいが、例えば
、アシルＩリアミン拳アミＹヒＶロラーゼ（特開昭５ｂ
−ｉｌＩダｏｇｇ　＞を用いて加水分解処理した尿を用
いてもよい。

本発明の最大の特徴は、酵素としてミクロコツカス−７
ラビダス系のプトレシン・オキシダーゼを用いることと
共に、脱着剤としてトリクロロ酢酸を用いることである
。トリクロロ酢酸は、通常の市販品あるいは生化学用特
級のものなどが任意に用いられ、その濃度としては、通
常Ｏ−７〜／、ＯＮであるが、特に０．２〜０．６；Ｎ
のものが好ましく用いられる。トリクロロ酢酸の使用量
は、通常吸着体／容に対して２〜３０容の範囲である。

また、トリクロロ酢酸を用いて、脱着する方法は、従来
の塩酸、硫酸などを用いる場合と同様に、ポリアミンを
＃’！ｉｆさせた吸着体をカラム等に充積し、脱着剤ｔ
カラム上部から供給して行うとよい。トリクロロ酢酸を
用いて脱着して得られたスペルミジン鹸敵にミクロコツ
カス・フラビダス系のプトレシン・オキシダーゼを作用
嘔せる。

ミクロコツカス・７ラビダス系のプトレシン嗜オキシダ
ーゼとは、ミクロコツカス・フラビダスの培養物から得
られるプトレシン・オキシダーゼであって、その製造方
法の概略は後述するが、その詳細は、前記したように本
発明−者等が先に提案し、Ｉ￥ｊ開昭！；７−／ざ９ざ
ダ号として金知である。ミク０：ｒ７カス＠７ラビダｙ
、　（Ｍｌｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　Ｆｌａｖｌ　−ｄｕｓ
　）　Ｆｉ、上記の特開昭ｓｑ−ｉｔｒｑｇＩＩ号に記
載されるように、本発明者等が見出したミクロコツカス
属に属する新種と認められるものであって、新しく命名
し、微生物保管委託申請書受理番号５６３３として工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託しているものである
。

トリクロロ酢酸を用いて脱着して得られ九スペルミジン
溶液に建クロコツカス・７ラビダス系のシトレシン・オ
キシダーゼの酵素を作用させる際Ａ常は、トリス（ヒト
四キシメチル）アミツメメン溶液などのアルカリ溶液で
スペルミジン浴液を中和して後に、該酵素を作用させる
とよｉ０トリス（ヒト四キシメチル）アンツメタン溶液
のａｉ１度としては、一般に、０．２〜コ、θモル濃度
のものが好ましく用いられる。

また、スペルミジン溶液にミクロコツカス・７ラビダス
系のプトレシン・オキシダーゼを作用させる際の反応条
件は、特に限定されないが１反応液ＯｐＨカフ　、　０
−ｆｆ　、　ｊ特に’７．ｊ　〜ｔ、Ｏであることが反
応速胛が速いという点で好ましい。その他の条件として
はｆＩ！度が７０〜ダ０℃特に−〇〜３ｋ”Ｃの条件を
満足するようにして行う方が好ましい。トリクロロ酢酸
を用いて脱着して得られたス（ルミジン溶液にミクロコ
ツカス・フラビメス系のプトレシン・オキシダーゼを作
用１せると、スペルミジン浴液中に含まれるスペルミジ
ンの量卸ち、尿中に含まれていたスペルミジンの量にろ
じて、過酸化水素が生成する。この過陵化水素を過当な
試薬で比色定量すればよい。試薬としては、通常、クー
アミノアンチピリン／ジクロルフェノール／ペルオキシ
ダーゼ系のものが好まシく使用される。

本発明の効果上の最大の特徴は、比色定量において、発
色強度が安定化し、且つ再現性が得られることである。

即ち、電クロコツカス・７ラビダス系のプトレシン・オ
キシダーゼは、前記したように、酵素生産性、酵素比活
性及び細胞破砕の点で有利であるが、これを用いた場合
、脱着剤として、従来使用されている塩酸、硫酸などの
＊＊液あるいは食塩などの塩類水溶液を用いると発色強
度が不安定で、再現性がなく、比色定量により、尿中に
含まれるスペルミジンの量を分析することは、実際上、
不可能である。然るに、脱着剤として、トリクロロ酢酸
を用いた場合は、尿中に含まれるスペルミジンの量に比
例した発色強度が常に得られるものである。建クロコツ
カス・７ラビダス系のシトレシン・オキシダーゼを用い
た場合のこのような特異な現象は、全く意外である。こ
のような特異な現象がみられる理由は、明らかでないが
、本発明者等は、一応次のように推測している。すなわ
ちミクロコツカス・７ラビメス系のプトレシン・オキシ
ダーゼは、通常の条件下ではスベルミジンのコ級アンノ
基のみを酸化するのではなく、末端の７級アミノ基も酸
化するが、トリクロロ酢酸存在下では、スペルミジンの
コ級アンノ基のみを選択的に酸化し、スペルミジンｌ当
量に対して安定にｌ当量の過酸化水素を発生させるもの
と推定している。

また、本発明で用いるミクロコツカス・７ラピダスの―
学的性３Ｉは、以下に示す通りである。尚、色の表示は
「色の規準Ｊ　　（Ｅ１本色彩社発行、１ｑｓｉ年版）
に従った。

口ｉ形態 培地として肉汁および肉汁寒天培地を使用した。

■　細胞の形および大きさ 球形。培養初期から中期にかけて二連球となる。Ｏ，Ｓ
〜θ、　９　ｐｒｎ　（直径）Ｑ）細胞の多形性　　　
′ なし ■　運勢性 なしく鞭毛なし） ｑ）胞子 なし ■　ダラム染色性 陽性 ■　抗酸性染色 陰性 （２）　　各培地における生育状態 ■　肉汁寒天平板培養 生育良好、円形、凸状、不透明、にぶ色（ｄｕｌｌ　ｙ
ｅｌｌｏｗ　）　、可溶性色素の生産ナシ。

０　肉汁寒天斜面培養 生育良好、線状に生育、不透明、ｌ’Ｌぶ黄（ｄｕｌｌ
　ｙｅｌｌｏｗ　）　、可溶性色素の生成なし。

■　肉汁液体培養 生育良好、均一に混濁、菌膜の形成なし、沈でんの生成
なし、セグメントの生成なし。

■　肉汁ゼラ□チン穿刺培養 表面に生育、生育中程度、ゼラチンの液化なし。

■　リドマス・ミルク培養 アルカリ性、ばルクの液化と凝固はともになし。

１３＋　　生理学的性質 ■　硝酸塩の還元　　　　　　　陽性 ■　脱窒反応　　　　　　　　　陰性 り）　　ＭＲテスト　　　　　　　　陰性り）　ＶＰテ
スト　　　　　　　　陰性Ｃｙ　　インドールの生成　
　　　　陰性９　硫化水素の生成　　　　　　陰性 ■　デンプンの加水分解　　　　陰性 ■　クエン酸の利用　　　　　　陽性 ■　無機輩素源の利用　　　　　陽性 ［相］　色素の生成　　　　　　　　陰性Ｏウレアーゼ
の生成　　　　　陽性 Ｏオキシダーゼ　　　　　　　陰性 ０　カタラーゼ　　　　　　　　陽性 ０　生育の範囲 ｐＨ！；、０−１０．０ 温度　コＯ〜３ｇ℃ ＠　酸素に対する勤縦　　　　　好気性＠　　Ｏ−Ｆテ
スト（Ｈｕｇｈ　Ｌｅｌｆｓｏｎ法）糖を分解しない ０　糖類からの酸の生成 すべての糖類についてガスの発生Ｆｉ被観察れず また、ミクロコツカス・フラビダスから、プトレシン・
オキシダーゼを得るには以下のようにすればよい。

まず上記の微生物をプトレシンを含有する培地下、酵素
などを生産する通常の方法で培養する。

培養の形態は液体通気培養が有利である。培地の栄養源
としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使
用される。炭素源としては同化可能な膨化水素であれば
良く、例えばグルコース、糖蜜、グリセリンなどが使用
される。窒素源としては、利用可能な窒素化合物であれ
ば良く、例えばイブトン、酵母エキス、肉エキス、コー
ン、ステイーピ、リカー、硫安、塩安などが使用される
。

その他、食塩、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、リン
＃絽−カリウム、リン酸第二カリウムなどの塩類が会費
に応じて使用される。

また、培地中にプトレシンあるいはスペルミジンを添加
せしめて、培養時プトレシン・オキシダーゼの生ＷｊＬ
能を上昇せしめることが好ましい。添加するプトレシン
とスペルミジンを比較した場合、価格と１トレシン−オ
キシダーゼの生産能の上昇効果の点から１トレシンの方
が有利である。プトレシンあるいはスペルミジンの添加
量としてはＯ，ＯＳ〜／・０１１の範囲で、好ましくは
θ、／〜θ、ｊ％程１に添加される。培養、温度は１が
発育しプトレシン・オキシダーゼを生産する範囲内で良
いが、好ましくはコＳ〜３５℃である。培養時＠は喰件
によって多少異なるが、通常Ｓ〜３０時間程度であって
、菌の生育が定常相（５ｔａｔｌｏｎａｒｙｐｈａｓｅ
　）に遅し次時期に培養を終了すればプトレシン・オキ
シダーゼ生産が最高に達する。かくして得られた培養物
中においてプトレシン・オキシダーゼ社その菌体内に含
有、蓄積される。

この様にして得られた培養物中よりプトレシン・オキシ
ダーゼを抽出し、粗製のプトレシン・オキシダーゼ含有
液を得るためには、例示すれば、まず培養物を遠心分離
尋の手段で固液分離し、得られる湿菌体を会費に応じて
リン酸緩ａｍやトリス−塩酸緩衝液などに懸濁せしめ、
次いで超音波破砕処理やダイノミルによる破砕処理リゾ
チーム処理などの一体処理手段を適宜選択組合せて、一
体内よｐプトレシン・オキシダーゼを抽出し、粗製のプ
トレシン・オキシダーゼ含有液を得る。

さらにこの粗製プトレシン・オキシダーゼ含有液を公知
の蛋白質、酵素などの単離、ｎ製手段を使用して処理す
ることにより精製されたプトレシン・オキシダーゼを得
ることが出来る。

次に、実施例及び比較例を挙げるが、本発明は、これら
に限定されるものではない。

実施例−７ 尿ｌＯθＪを採取し、／Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨｆ
、Ｏ）を用いてＰＨを７０ｇに調整した後、Ｊ＊０００
ｒｐｍで１０分間の遠心分離により沈殿物を除去した上
清に、最終濃度がコＯｓＭとなるようにスペルミジン水
溶液を添加した。

このよう和して調製し九尿試料溶液１ｍを陽イオン交換
樹脂パイオレツク７０（）々イオ・ラド社製、カルーン
酸Ｗ）のミニカラム（樹脂量０．２ｕ　）　Ｋ通過させ
た。

イオン交換水Ｓ、θＶでミニカラムを洗浄後、０．２Ｎ
トリクロロ酢酸で溶出し、溶出液３．ＯＶを得た。

溶出液中のスペルミジンをミクロコツカス・フラビダス
より精製したプトレシン・オキシダーゼを用いて酵素的
定量を行った。検出はプレトシン・オキシダーゼがス（
ルミジンに作用して生成する過酸化水素をダーアミノア
ンチ♂リン／ジクロルフェノール／ベルオキシ〆−ゼ系
で発色せしめることにより行った。

アッセイ液 ０．１Ｍトリス塩酸緩衝液　　　　７０融合　グーアミ
ノアンチピリン　　　　　ｌコ呼ジクロルフェノール　
　　　　　　９０ｇ哩ベルオキシダー−に１１４報 プレトシン・オキシダーゼ　　　　　　１００ｕｎ　ｌ
　ｔ　ｓ溶出液／、０ａｔｌｉＣθ、ｊＭ）リス溶液ｏ
、ｉｓＶを加えて中和した後、上記アッセイ液／、０＊
ｔを加えて３θ℃で反応させ、ｊ　／　Ｑ　ｎｍ　の吸
光度二〇Ｄ５１４を測定した。その結果、第１表に示す
ように反応開始後約３０分で一定の吸光度を示すように
なり、その値は６０分後でも便化せず安定であった。

また、第１−図に吸光度の経時変化の様子を示す。

比較例−７ 実施例−ｌに示した中でｏ、：ｔ’ｘトリクロロ酢酸を
０．コＮ塩酸に代えた以外は実施例に示したと同一の操
作を行ない、！ｒ　／　４’　ｎｍ　の吸光度：００５
１４を測定したと仁ろ、第２表に示すように”！１４は
一定値を示さず吸光度は反応開始後６θ分でも増加し続
けていた。

また、吸光度の経時変化の様子を第１−図に示す。

実施例−一 実施例−／に示した中で最終スイルミジン濃度をＯ％ｌ
θ、コθ、３θ、ダθ及びｊθ＃Ｍと便化させた以外は
実施例−／に示したものと同一の操作を行なって、３０
分後の！ｒ　／　ＩＩ　ｎｍ　の吸光度；０Ｄ５１４を
測定した結果は第３表の通りであった。

゛スペルミジン濃度Ｏの場合の吸光度０．０２２をブラ
ンク値として、スイルミジン濃度：Ｃ（ｍＭ）とｏＯ５
１４との関係式を求めた結果口１式のようになった。

実施例−３ 実施例−／に示した中で、添加するスイルミジン濃度を
未知濃度とした以外は実施例−７に示したものと同一の
操作を行なって、３０分後のｓｉｌＩｎｍ　の吸−光度
：ＯＤ５，４を求め、実施例−コで求めた（１）式の検
量１ｓｔ用いて尿中スペルミジンの定量を行なった。

また、同時に、トリクロロ酢酸によって脱着されたスペ
ルミジン溶液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）で分析することにより、尿中スペルミジン濃度を求め
た。

これら両者の分析結果を第ダ表に示した。

＠ダ表

【図面の簡単な説明】

第１図は、脱着剤として０．２Ｎトリクロロ酢酸及び０
．２Ｎ塩酸を使用した場合の呈色安定性を比較した本の
である。 第１図 ０　　７０　２０　３０　　　４５　　　６０８１応吟
ｒ１（分り 手続補正書 昭和５７年６月之メ日 特許庁長官若杉和夫殿 １、事件の表示 昭和５７年特許願第２２６９９号 ２、発明の名称 ポリアミンの分析法 ３、補正をする者 事例どの関係　　特許出願人 住　　　　所　山口県徳山市御影町１番１号徳山曹達株
式会社東京本部特許情報部 電話　５９１−９３６１ ４、補正命令の日付　　　自　発 、１′□ ｂ、補正の対象 明りＩｌ書の［発明の詳細な説明］及び「図面の簡単な
説明１の欄　　　　　、イ１７フ２．１６、補正の内容 （１）明細書第２頁３行目の「ｔ９’ｒｓ年」を「１９
７１年」Ｋ補正する。 （２）　　同第３頁の３行目と４行目の「プトレミン」
を「プトレシン」Ｋ補正する。 （３）同第３頁７行目の「イオロジカル」を「ノクイオ
ｐジカル」に補正する。 （４）同第４：ｉｊ９行目の「横葦」を「検索」に補正
する。 （５）同第４頁１５行目の「号」を「１８９８４号」に
補正する。 （６）　　同第７頁１２行目の１１．　ＯＮであるが、
特に０．２〜０．５ＮＪを１”　１．０　Ｍであるが、
特に０．２〜０．５ＮＪに補正する。 （７）　　同第１０頁１５行目の「プトレシン」を「プ
トレシン」に補正する。 （８）同第１５頁４〜５行目の「コーン、ステイーピ、
リカー」を「コーン・ステイープ・リカー」に補正する
。 （９）　　同第１６頁１２行目の「処理リゾチーム」を
「処理、リゾチーム」に補正する。 ０１　　同第１７頁８行目の「ノくイオレツク７０」を
「バイオレックス７０」に補正する。 αυ　同第１７頁１２行目のＩＯ，２ＮＪを「０．２Ｍ
ＪＫ補正する。 ａり　　同第１７頁１６行目の「プレトシン」を「プト
レシン」に補正する。 αｊ　同第２０頁４行目の「０．２ＮＪをｌ’−０，２
Ｍ」に補正する。 Ｉ　同第２４頁２行目の［ｍ　Ｍ　ＪをｒμＭＪＫ補正
する。 αジ　同第２５頁、１０行目の１０．２ＮＪを「０．２
Ｍ」に補正する。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 …　−リアミンをｙ＆着させた吸着体から脱着剤を中い
   てポリアミンを脱着し、得られた４リアミン溶液に酵素
   を作用させて生じる過酸化水素を検出して行なうポリア
   ミンの分析法において、脱着剤としてトリクロロ酢酸を
   用い、且つ酵素としてミクロコツカス・フラビダス系の
   プトレシンやオキシダーゼを用いることを特徴とする欽
   すアミンの分析法。 偉１　ポリアミンがスペルミジンである特許請求の範囲
   第０１項記載の分析法。 （３１ａ着体が陽イオン交換樹脂である特許請求の範囲
   第（１１項記載の分析法。