JPH0218067B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明はクレアチンアミジノハイドロラーゼの
製造法、特に本発明はアクチノバチルス
（Actinobacillus）属に属し、クレアチンアミジ
ノハイドロラーゼ生産能を有する菌株によるクレ
アチンアミジノハイドロラーゼを製造する方法に
関する。 従来技術とその問題点 クレアチンおよびクレアチニンは人間の血液ま
たは尿中に見出され、その量を迅速かつ正確に検
出測定することは人間の病気例えば尿毒症、慢性
腎炎、急性腎炎、巨人症、強直性筋異栄養症等を
診断するのに非常に重要である。 クレアチンおよびクレアチニンの定量法として
は(1)ピクリン酸を用いるヤツフエ反応に基づく化
学的定量法および(2)クレアチニンデイミナーゼを
用いる酵素的定量方法が知られている。この中上
記(1)の方法は煮沸操作を必要とすること、および
クレアチンおよびクレアチニンに対する特異性が
低い等の欠点を有している。また上記(2)の方法は
内因性アンモニアの作用を受けるので正確性に欠
ける等の問題点があり、迅速かつ正確な方法とは
いえない。 上記(1)および(2)に代える方法としてクレアチニ
ンアミドハイドロラーゼおよびクレアチンアミジ
ノハイドロラーゼを用いる酵素的定量方法があ
る。これらの中クレアチンアミジノハイドロラー
ゼはクレアチンを加水分解してサルコシンと尿素
を生成させる酵素である。従つて生成するサルコ
シンをサルコシンデヒドロゲナーゼまたはサルコ
シンオキシダーゼを用いる方法により測定すれば
人間の血液中または尿中のクレアチンの量を知る
ことができ、上述した各種の病気の診断に利用す
ることができる。 クレアチンアミジノハイドロラーゼは微生物界
に広く見出されており、既に工業的にも製造さ
れ、臨床検査試薬として使用されている。 クレアチンアミジノハイドロラーゼを生産する
菌株としては今までに次の如き菌株が知られてい
る。 シユードモナス・アエルギノーサ
（Pseudomonas aeruginosa）（Kopper，P.H.；
Robin，L.；Arch.Biochem.第26巻、第458頁、
1950年）。 シユードモナス・オバリス（Pseudomonas
ovalis）（Appleyard，G.；Wood，D.D.；J.Gen.
Microbiol.第14巻、第351頁、1956年）。 シユナードモナス・プチダ（Pseudomonas
putida）（Yoshimoto，T.；Oka，I.；Tsuru，
D.；Arch.Biochem.Biophys.第177巻、第508頁、
1967年）。 アースロバクター・ウレアフアシエンス
（Arthrobacter ureafaciens）（Kaplan，A.；
Naugler，D.；Mol.Cell.Biochem.第３巻、第９
号、1974年）。 フラボバクテリウム（Flavobacterium）属、
コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、マ
イクロコツカス（Micrococeus）属（特開昭51−
118884号）。 アルカリゲネス（Alcaligenes）属、ペニシリ
ウム（Penicillium）属（特開昭47−43281号）。 しかしながら上述した公知の各種菌株から製造
されたクレアチンアミジノハイドロラーゼは至適
PH範囲が7.5〜8.5と非常に狭く、熱安定性が40℃
以下であつて熱に対して不安定であり、Km値が
例えば2.9×10^-2Mと大きく、PH安定性も4.5〜8.5
で狭いという欠点を有していた。このため至適PH
範囲が広く、熱安定性が優れ、しかもKm値の小
さいクレアチンアミジノハイドロラーゼが求めら
れている。 発明の目的 本発明は従つて至適PH範囲が広く、熱安定性に
すぐれ、Km値の小さいクレアチンアミジノハイ
ドロラーゼを得ることになる。 発明の構成 本発明はアクチノバチルス（Actinobacillus）
属に属し、クレアチンアミジノハイドロラーゼ生
産能を有する菌株を栄養培地に培養し、培養物中
にクレアチンアミジノハイドロラーゼを生成蓄積
せしめ、これを採取することからなるクレアチン
アミジノハイドロラーゼの製造法にある。 本発明で使用する菌株はアクチノバチルス
（Actinobacillus）属に属する菌株であるならば
何れでも良いが、特に本発明者等が福井県敦賀市
内の土壤より採取したアクチノバチルス
（Actinobacillus）属に属するアクチノバチルス
（Actinobacillus）CRH−1271が好ましい。 上記アクチノバチルス（Actinobacillus）
CRH−1271株の菌学的性質を以下に示す。 (a) 形態 肉汁寒天培地に30℃で20時間培養して、大きさ
（0.3〜0.5μ）×（0.5〜1.0μ）の桿菌であり、グラム
染色は陰性であり、運動性はない。 (b) 各培地における生育状態 (1) 肉汁寒天平板培養 30℃、48時間で直径３〜５mmの円形のコロニ
ーを形成する。表面は平滑で光沢があり、隆起
は凸円状、コロニーは均質不透明でクリーム色
で、可溶性色素は形成しない。 (2) 肉汁寒天斜面培養 30℃、20時間で糸状良好な生育を示す。コロ
ニーはクリーム色でバター質である。 (3) 肉汁液体培養 30℃、16時間振盪培養にて生育し、濁化す
る。 (4) 肉汁ゼラチン穿刺培養 30℃、16時間培養で生育し、ゼラチン液化能
はない。 (5) リトマス・ミルク 酸性となり、凝固反応を生ずる。 (c) 生理学的性質 (1) 硝酸塩の還元；陽性 (2) 脱窒反応；陰性 (3) MRテスト；陰性 (4) VPテスト；陰性 (5) インドールの生成；陰性 (6) 硫化水素の生成；陰性 (7) デンプンの加水分解；陰性 (8) クエン酸の利用；陰性 (9) 無機窒素源の利用；陽性 (10) 色素の生成；なし (11) ウレアーゼ；陽性 (12) オキシダーゼ；陽性 (13) カタラーゼ；陽性 (14) 生育の範囲；生育温度15〜45℃、至適温度
25〜35℃、生育PH5.0〜8.0、至適PH6.0〜7.5 (15) 酸素に対する態度；好気性 (16) Ｏ−Ｆテスト；発酵 (17) 糖からの酸の生成；Ｌ−アラビノース、Ｄ
−ガラクトース、麦芽糖、シヨ糖、乳糖、トレ
ハロース、Ｄ−ソルビツト、Ｄ−マンニツト、
イノシツト等から酸を生成する。 (18) その他 アルギニンの分解；陽性。リジンの脱炭酸反
応；陽性。オルニチンの脱炭酸反応；陰性。 上記菌学的性質の同定のための実験方法は主と
して長谷川武治編著、「微生物の分類と同定」学
会出版センター（1975年）によつて行なつた。ま
た分類同定の基準としてバージーズ・マニユア
ル・オブ・デターミネイテイブ・バクテリオロジ
ー第８版（1974年）を参考にした。 上記文献および上記菌学的性質からCRH−
1271株はアクチノバチルス（Actinobacillus）属
に属するとみなされる。しかしながら上記文献に
は上記菌種の菌学的性質は多くは記載されていな
い。アクチノバチルス・エクリー
（Actinobacillus equuli）とよく一致するが、ゼ
ラチンの液化能の点において相異が認められる。
従つて本菌株はアクチノバチルス
（Actinobacillus）属CRH−1271株と命名した。
本菌は工業技術院微生物工業研究所に微生物受託
番号微工研菌寄第7721号として寄託されている。 本発明方法を実施するに当つては、通常の栄養
培地を使用できるが、好ましくはクレアチニン、
クレアチンまたはそれらの誘導体を用いて培養す
るのが好ましい。培地の炭素源としては、クレア
チニン、クレアチン、グルコース、シユクロー
ス、フラクトース、澱粉、廃糖蜜、アルコール
類、有機酸類が利用でき、天然栄養源としてはペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイー
プリカー等が利用でき、窒素源としてはクレアチ
ニン、クレアチン、アンモニア、硫安、硝安、塩
安、尿素等が利用でき、無機塩類としてはリン酸
カリカム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸
マグネシウム等が利用できる。これらの栄養源は
それぞれ単独に用いることもできまた組合せて用
いることもできる。 菌株を培養するに当つては、通常振盪培養また
は通気撹拌培養で行なうことができる。一般に培
養温度は25〜35℃、培地PHは6.5〜7.5であるのが
好ましく、通常１〜２日間培養を行なうと、菌体
中にクレアチンアミジノハイドロラーゼが生成蓄
積する。培養条件は使用する菌株、培地組成など
に応じ、クレアチンアミジノハイドロラーゼの生
産量が最大になるように設定することは当然であ
る。 本発明の方法によつて生成蓄積されたクレアチ
ンアミジノハイドロラーゼを採取するに当つて
は、培養液を遠心分離、過等の操作により、培
養液から菌体を集め、集めた菌体をビース破砕も
しくは超音波破砕等の操作をして菌体中からクレ
アチンアミジノハイドロラーゼを取り出す。かく
して得られた粗酵素液からクレアチンアミジノハ
イドロラーゼを単離するに当つては、通常の酵素
精製に使用される方法を使用できる。例えば塩
析、有機溶媒沈澱、透析、等電点沈澱、イオン交
換法、ゲル過等の方法を組合せて使用できる。
例えば粗酵素液を遠心分離し、上清を得る。さら
にその上清の硫安塩析画分（0.35〜0.55飽和）を
得る。一夜透析後、DEAE−セフアロースCL
4Bイオン交換体に吸着、溶出させる。活性画分
を濃縮後、セフアアクリルS200のゲル過を行
なうことにより高度に精製されたクレアチンアミ
ジノハイドロラーゼを単離することができる。 本発明方法により得られるクレアチンアミジノ
ハイドロラーゼの酵素化学的および理化学的性質
は次のとおりである。 (1) 作用： 本発明の酵素は１モルのクレアチンを加水分
解して、１モルのサルコシンと１モルの尿素を
生成する。 (2) 基質特異性： クレアチンに特異的に作用する。 (3) 至適PH： 本発明の酵素の至適PHは第１図の曲線で表わ
される如く、PH7.0〜9.0に高い活性を有してい
る。 (4) 至適温度： 本発明の酵素の至適温度は第２図の曲線で表
わされる如く、35℃〜45℃にある。 (5) PH安定性： 本発明の酵素を25℃で、それぞれのPHで17時
間処理したときのPH安定性を第３図に示す。第
３図より明らかな如く、本発明の酵素はPH4.5
〜8.5の間で安定である。 (6) 熱安定性： 本発明の酵素をPH7.5でそれぞれの温度で30
分間処理したときの熱安定性を第４図に示す。
第４図から明らかな如く、本発明の酵素は50℃
まで安定である。 (7) 阻害剤： 下表１に示す如く、硝酸銀、塩化水銀、硫酸
銅で阻害された。

【表】 (8) Km値： 本発明の酵素のKm値は約1.9×10^-2Mであ
る。 (9) 分子量： 本発明の酵素は、セフアアクリルＳ−200を
用いたゲル過法で約100000である。 (10) 酵素活性測定法： 本発明の酵素活性の測定は下記条件で１分間
に１マイクロモルの黄色色素を生成する酵素活
性を１単位とする。 試 薬： (A) 0.1Mクレアチン溶液（1.49ｇのクレアチン
を50ｍＭリン酸緩衝液PH7.5に溶解し、100ml
とする）。 (B) DAB溶液（2.0ｇのｐ−ジメチルアミノベン
ズアルデヒドを100mlのジメチルスルホキシ
ドに溶解させた後、濃塩酸15mlを加える）。 (C) 酵素溶液（酵素標品を予め氷冷した50mMリ
ン酸緩衝液PH7.5で1.0〜4.0U／mlに稀釈す
る）。 手 順： １ 試験管に上記基質溶液(A)0.9mlを入れ、37℃
で予備加温する。 ２ 上記酵素溶液(C)0.1mlを加え反応を開始する。 ３ 37℃で正確に10分間反応させた後、上記
DAB溶液(B)2.0mlを加えて反応を停止させる。 ４ 25℃で20分間放置後、435nmにおける吸光度
を測定する（OD_test）。 ５ 盲検は上記基質溶液(A)0.9mlを37℃で10分間
放置後、上記DAB溶液(B)2.0mlを加えて混和
し、次いで酵素溶液(C)0.1mlを加えて調製する。
以下同様に25℃で20分間放置後、435nmにおけ
る吸光度を測定する（OD_blaok）。 計算式： Ｕ／ml＝△OD（OD_test−OD_blaok）×3.0（ml）稀釈培
数／0.321×1.0×10（分）×0.1（ml）＝△OD×9.35×
稀釈培数 0.321＝黄色色素のミリモル分子吸光係数
（cm²／μM） 1.0＝光路長（cm） 実施例の説明 以下に本発明によるクレアチンアミジノハイド
ロラーゼの製造法を実施例を挙げて説明する。％
は他に特記せぬ限り（ｗ／ｖ）％である。 実施例 １ 培地組成 0.2％クレアチン、0.5％ポリペプトン、0.5％
酵母エキス、1.4％K₂HPO₄、0.3％KH₂PO₄、
0.01％MgSO₄・7H₂O、PH7.0 上記の培地50mlを500mlの坂口フラスコに入れ、
121℃で10分間オートクレーブ殺菌する。アクチ
ノバチルス（Actinobacillus）CRH−1271（微工
研菌寄第7721号）の１白金耳を上記培地に接種
し、30℃、20時間振盪培養し、種培養液とする。
別に同条件にて殺菌した培地６を含む10容ジ
ヤーフアメンターへ上記種培養液50mlを接種す
る。300rpm、通気量３／min、30℃で16時間
培養する。得られた培養液のクレアチンアミジノ
ハイドロラーゼ活性は0.8U／mlであつた。培養
液６を遠心分離し、菌体を集め50mMリン酸緩
衝液に懸濁し、１としてビーズ破砕機（ダイノ
ミルKDL）により破砕する。菌体破砕液を遠心
分離し、上清を得る。上清液に0.35飽和になるよ
う硫安を加え、遠心分離し、上清を得る。その上
清液にさらに0.55飽和になるよう硫安を加え遠心
分離し、沈澱物を得る。50mMリン酸緩衝液PH
7.5、250mlに再溶解する。再溶解液を50mMリン
酸緩衝液PH7.5で平衝化したセフアデツクスＧ−
25カラム（２）で脱塩する。脱塩液をDEAE−
セフアロースCL−4Bカラム50mlに吸着させ、
0.4M NaClにて溶出する。溶出液を限外過に
て濃縮し、セフアアクリルＳ−200カラムにて分
子篩を行なう。活性画分の比活性は18.1U／mg蛋
白であつた。 発明の効果 本発明方法により得られるクレアチンアミジノ
ハイドロラーゼは熱安定性が50℃まで安定であ
り、至適PHが7.0〜9.0と広く、Km値も1.9×
10^-2Mと小さくすぐれており、かつPH安定性も
4.5〜8.5で従来のものより広い。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明により得られたクレアチンアミ
ジノハイドロラーゼのPHと活性の関係を表わし、
第２図は温度と活性の関係を表わし、第３図は25
℃でそれぞれのPHで17時間処理したときのPHと活
性の関係を表わし、第４図はPH7.5でそれぞれの
温度で30分処理したときの温度と活性の関係を表
わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アクチノバチルス（Actinobacillus）属に属
   し、クレアチンアミジノハイドロラーゼ生産能を
   有する菌株を栄養培地に培養し、培養物中にクレ
   アチンアミジノハイドロラーゼを生成蓄積せし
   め、これを採取することを特徴とするクレアチン
   アミジノハイドロラーゼの製造法。 ２ 菌株がアクチノバチルス（Actinobacillus）
   CRH−1271である特許請求の範囲第１項記載の
   製造法。