JPS6167484A - クレアチンアミジノハイドロラ−ゼの製造法 - Google Patents
クレアチンアミジノハイドロラ−ゼの製造法Info
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- JPS6167484A JPS6167484A JP59190134A JP19013484A JPS6167484A JP S6167484 A JPS6167484 A JP S6167484A JP 59190134 A JP59190134 A JP 59190134A JP 19013484 A JP19013484 A JP 19013484A JP S6167484 A JPS6167484 A JP S6167484A
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- actinobacillus
- creatine amidinohydrolase
- amidinohydrolase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はクレアチンアミジノハイドロラーゼの製造法、
特に本発明はアクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ）属に属し、クレアチンアミジノハイドロラ
ーゼ生産能を有する菌株によるフレア千ンアミジノハイ
ドロラーゼル側＆オス古法に関する。
特に本発明はアクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ）属に属し、クレアチンアミジノハイドロラ
ーゼ生産能を有する菌株によるフレア千ンアミジノハイ
ドロラーゼル側＆オス古法に関する。
従来技術とその問題点
クレアチン詔よびクレアチニンは人間の血液または尿中
に見出され、その量を迅速かつ正確に検出測定すること
は人間の病気例えば尿毒症、慢性腎炎、急性腎炎、巨人
症、強直性筋異栄養症等を診断するの１こ非常に重要で
ある。
に見出され、その量を迅速かつ正確に検出測定すること
は人間の病気例えば尿毒症、慢性腎炎、急性腎炎、巨人
症、強直性筋異栄養症等を診断するの１こ非常に重要で
ある。
クレアチンおよびクレアチニンの定量法としては（１）
ピクリン酸を用いるヤツフエ反応に基づく化学的定量法
および（２）クレアチニンデイミナーゼを用いる酵素的
定量方法が知られている。
ピクリン酸を用いるヤツフエ反応に基づく化学的定量法
および（２）クレアチニンデイミナーゼを用いる酵素的
定量方法が知られている。
この中上記（１）の方法は煮沸操作を必要とすること、
およびクレアチンおよびクレアチニンに対する特異性が
低い等の欠点を有している。また上記（２）の方法は内
因性アンモニアの作用を受けるので正確性に欠ける等の
問題点があり、迅速かつ正確な方法とはいえない。
およびクレアチンおよびクレアチニンに対する特異性が
低い等の欠点を有している。また上記（２）の方法は内
因性アンモニアの作用を受けるので正確性に欠ける等の
問題点があり、迅速かつ正確な方法とはいえない。
上記（１）および（２）に代える方法としてクレアチニ
ンアミドハイドロラーゼおよびクレアチンアミジノハイ
ドロラーゼを用いる酵素的定量方法がある。これらの中
クレアチンアミジノハイドロラーゼはクレアチンを加水
分解してサルコシンと尿素を生成させる酵素である。従
って生成するサルコシンをサルコシンデヒドロゲナーゼ
またはサルコシンオキシダーゼを用いる方法により測定
すれば人間の血液中または尿中のクレアチンの量を知る
ことができ、上述した各種の病気の診断に利用すること
ができる。
ンアミドハイドロラーゼおよびクレアチンアミジノハイ
ドロラーゼを用いる酵素的定量方法がある。これらの中
クレアチンアミジノハイドロラーゼはクレアチンを加水
分解してサルコシンと尿素を生成させる酵素である。従
って生成するサルコシンをサルコシンデヒドロゲナーゼ
またはサルコシンオキシダーゼを用いる方法により測定
すれば人間の血液中または尿中のクレアチンの量を知る
ことができ、上述した各種の病気の診断に利用すること
ができる。
クレアチンアミジノハイドロラーゼは微生物界に広く見
出されており、既に工業的にも製造され、臨床検査試薬
として使用されている。
出されており、既に工業的にも製造され、臨床検査試薬
として使用されている。
クレアチンアミジノハイドロラーゼを生産する菌株とし
ては今までに次の如き菌株が知られている。
ては今までに次の如き菌株が知られている。
シュードモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｓｕｄｏｍｏｎ
ａｇａｅｒｕｇｉｎｏｓａ） （Ｋｏｐｐｓｒ、Ｐ、Ｈ
，ＨＲｏｂｉｎ、Ｌ、ＨＡｒｏｈ。
ａｇａｅｒｕｇｉｎｏｓａ） （Ｋｏｐｐｓｒ、Ｐ、Ｈ
，ＨＲｏｂｉｎ、Ｌ、ＨＡｒｏｈ。
Ｂｌｏｏｈｓｍ、第２６巻、第４５８頁、１９５０年）
。
。
シュードモナス・オバリス（Ｐｓｓｕｄｏａ＋ｏｎａｇ
ｏｖａｌｉｓ） （Ａｐｐｌｓｙａｒｄ、Ｇ、； Ｗｏ
ｏｄ、Ｄ、Ｄ、ｉ Ｊ、Ｇａｎ。
ｏｖａｌｉｓ） （Ａｐｐｌｓｙａｒｄ、Ｇ、； Ｗｏ
ｏｄ、Ｄ、Ｄ、ｉ Ｊ、Ｇａｎ。
Ｍｉｏｒｏｂｉｏｌ、 第１４巻、第３５１頁、１９
５６年）。
５６年）。
シュードモナス−プチダ（Ｐｍ＊ｕｄａｍｏｎａａ ｐ
ｕｔｉｄａ）（Ｙｏａｈｉｍｏｔｏ、Ｔｇ Ｏｋａ、Ｉ
、ＨＴｔｕｒｕ、Ｄ、ＨＡｒｏｈ。
ｕｔｉｄａ）（Ｙｏａｈｉｍｏｔｏ、Ｔｇ Ｏｋａ、Ｉ
、ＨＴｔｕｒｕ、Ｄ、ＨＡｒｏｈ。
Ｅｉｏｏｈａｒａ、Ｂｌｏｐｈｙａ、 ＠ ｌ ７７
巻、第５０８頁、１９７６年）。
巻、第５０８頁、１９７６年）。
アースロバクターーウレアファシエンス（Ａｒｔｈｒｏ
ｂａｏｔｓｒ ｕｒ＠ａｆａｏｉｓｎｓ ）（Ｋａ
ｐｌａｎ、Ａ、ｉＮａｕｇｌ＠ｒ、Ｄ、； Ｍｏ１．Ｃ
ｓ１１．Ｂｉｏｏｈｅｍ、第３巻、第９号、１９７４年
）。
ｂａｏｔｓｒ ｕｒ＠ａｆａｏｉｓｎｓ ）（Ｋａ
ｐｌａｎ、Ａ、ｉＮａｕｇｌ＠ｒ、Ｄ、； Ｍｏ１．Ｃ
ｓ１１．Ｂｉｏｏｈｅｍ、第３巻、第９号、１９７４年
）。
フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｏｔｅｒｉｕｍ
）属、コリネｔ４ りｆ リｆｙ Ａ （Ｃｏｒｙｎｓ
ｂａｃｔ＠ｒｉｕｍ ） ｌｉｉ、マイクロコツカス（
Ｍｉｏｒｏｏｏｏｅｕｇ ）属（特開昭５１−１１８８
８４号）。
）属、コリネｔ４ りｆ リｆｙ Ａ （Ｃｏｒｙｎｓ
ｂａｃｔ＠ｒｉｕｍ ） ｌｉｉ、マイクロコツカス（
Ｍｉｏｒｏｏｏｏｅｕｇ ）属（特開昭５１−１１８８
８４号）。
アルカリゲネＸ （Ａｌ’ｏａｌｉｇ＠ｎｅｓ ）属、
ペニシリウム（Ｐ＠ｎｉａｉｌｌｉｕｍ ）属（特開昭
４７−４３２８１号）。
ペニシリウム（Ｐ＠ｎｉａｉｌｌｉｕｍ ）属（特開昭
４７−４３２８１号）。
しかしながら上述した公知の各種菌株がら製造されたク
レアチンアミジノハイドロラーゼは至適ｐＨ範囲が７．
５〜８．５と非常に狭く、熱安定性が４０℃以下であっ
て熱に対して不安定であり、Ｋｍ値が例ｔば２．９Ｘ１
０−”と大きく、ｐＨ安定性も４．５〜８．５で狭いと
いう欠点を有していた。このため至適ｐＨ範囲が広く、
熱安定性が優れ、しかもＫＯＩ値の小さいクレアチンア
ミジノハイドロラーゼが求められている。
レアチンアミジノハイドロラーゼは至適ｐＨ範囲が７．
５〜８．５と非常に狭く、熱安定性が４０℃以下であっ
て熱に対して不安定であり、Ｋｍ値が例ｔば２．９Ｘ１
０−”と大きく、ｐＨ安定性も４．５〜８．５で狭いと
いう欠点を有していた。このため至適ｐＨ範囲が広く、
熱安定性が優れ、しかもＫＯＩ値の小さいクレアチンア
ミジノハイドロラーゼが求められている。
発明の目的
本発明は従って至適ｐＨ範囲が広く、熱安定性にすぐれ
、Ｋｍ値の小さいクレアチンアミジノハイドロラーゼを
得ることにある。
、Ｋｍ値の小さいクレアチンアミジノハイドロラーゼを
得ることにある。
発明の構成
本発明はアクチノバチルス（Ａａｔｉｎｏｂａｃｉｌｌ
ｕｇ）属に舅し、タレアチンアミジノハイドロラーゼ生
産能を有する菌株を栄養培地に培養し、培養物中にクレ
アチン、アミジノハイドロラーゼを生成蓄積せしめ、こ
れを採取することからなるクレアチンアミジノハイドロ
ラーゼの製造法にある。
ｕｇ）属に舅し、タレアチンアミジノハイドロラーゼ生
産能を有する菌株を栄養培地に培養し、培養物中にクレ
アチン、アミジノハイドロラーゼを生成蓄積せしめ、こ
れを採取することからなるクレアチンアミジノハイドロ
ラーゼの製造法にある。
本発明で使用する菌株はアクチノバチルス（Ａｃｔｉｎ
ｏｂａｏｉｌｌｕｓ ）属に属する菌株であるならば何
れでも良いが、特に本発明者等が福井県敦賀市内の土壌
より採取したアクチノバチルス（Ａａｔｉｎｏｂａｏｉ
ｌｌｕｓ＋ ）属に属するアクチノバチルス（Ａａｔｉ
ｎｏｂａｏｉｌｌｕｓ ） ＣＲＨ−１２７１が好まし
い。
ｏｂａｏｉｌｌｕｓ ）属に属する菌株であるならば何
れでも良いが、特に本発明者等が福井県敦賀市内の土壌
より採取したアクチノバチルス（Ａａｔｉｎｏｂａｏｉ
ｌｌｕｓ＋ ）属に属するアクチノバチルス（Ａａｔｉ
ｎｏｂａｏｉｌｌｕｓ ） ＣＲＨ−１２７１が好まし
い。
上記アクチノバチルス（Ａｏｔｉｎａｂａｏｉｌｌｕｓ
＋ ）ＣＲＨ−１２７１株の菌学的性質を以下に示す。
＋ ）ＣＲＨ−１２７１株の菌学的性質を以下に示す。
（鳳）形態
肉汁寒天培地に３０℃で２０時間培養して、大きさく０
．３〜０，５声’） Ｘ （０，５〜ｉ、 ｏμ）の桿
菌であり、ダラム染色は陰性であり、運動性はない。
．３〜０，５声’） Ｘ （０，５〜ｉ、 ｏμ）の桿
菌であり、ダラム染色は陰性であり、運動性はない。
（ｂ）各培地における生育状態
（１）肉汁寒天平板培養
３０℃、４８時間で直径３〜５ｍの円形のコロニーを形
成する。表面は平滑で光沢かあり、隆起は凸円状、コロ
ニーは均質不透明でクリーム色で、可溶性色素は形成し
ない。
成する。表面は平滑で光沢かあり、隆起は凸円状、コロ
ニーは均質不透明でクリーム色で、可溶性色素は形成し
ない。
（２）肉汁寒天斜面培養
３０℃、２０時間で糸状良好な生育を示す。コロニーは
クリーム色でバター質である。
クリーム色でバター質である。
（３）肉汁液体培養
３０℃、１６時間振枦培養にて生育し、濁化する。
（４）肉汁ゼラチン穿刺培養
３０℃、１６時間培養で生育し、ゼラチン液化能はない
。
。
（５）リドマス・ミルク
酸性となり、凝固反応を生ずる。
（０）生理学的性質
（１）硝酸塩の還元；陽性
（２）脱窒反応：陰性
（３） Ｍ Ｒテスト；陰性
（４） ｖ ｐテスト；陰性
（５）インドールの生成；陰性
（６）硫化水素の生成；陰性
（７）デンプンの加水分解；陰性
（８）クエン酸の利用：陰性
（９）無機窒素源の利用；陽性
ＧＯ）色素の生成；なし
Ｑｌ）ウレアーゼ；陽性
ｑつオキシダーゼ；陽性
ｑつカタラーゼ；陽性
０４）生育の範囲；生育温度１５〜４５℃、至適温度２
５〜３５℃、生育ｐＨ ５，０〜８．０、至適ｐａａ、ｏ〜７．５（１ω酸素に
対する態度；好気性 Ｑ６）ｏ ＋＋ Ｆテスト；発酵 αつ糖からの酸の生成：Ｌ−アラビノース、Ｄ−ガラク
トース、麦芽瓢 ショ糖、乳糖、トレハ ロース、Ｄ−ソルビン ト、Ｄ−マンニット、 イノジット等から酸を 生成する。
５〜３５℃、生育ｐＨ ５，０〜８．０、至適ｐａａ、ｏ〜７．５（１ω酸素に
対する態度；好気性 Ｑ６）ｏ ＋＋ Ｆテスト；発酵 αつ糖からの酸の生成：Ｌ−アラビノース、Ｄ−ガラク
トース、麦芽瓢 ショ糖、乳糖、トレハ ロース、Ｄ−ソルビン ト、Ｄ−マンニット、 イノジット等から酸を 生成する。
ｑのその他
アルギニンの分解；陽性。リジンの脱炭酸反応；陽性。
オルニチンの脱炭酸反応；陰性。
上記蘭学的性質の同定のための実験方法は主として長谷
用武治編著、［微生物の分類と同定」学会出版センター
（１９７５年）によって行なった。また分類同定の基準
としてバーシーズ・マニュアル・オブ・デターミネイテ
ィブ・バクテリオロジー第８版（１９７４年）を参考に
した。
用武治編著、［微生物の分類と同定」学会出版センター
（１９７５年）によって行なった。また分類同定の基準
としてバーシーズ・マニュアル・オブ・デターミネイテ
ィブ・バクテリオロジー第８版（１９７４年）を参考に
した。
上記文献および上記菌学的性質からＣ’ＲＨ−１２７１
株はアクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏ ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ）属に属するとみなされる。しかしながら上記文献
には上記菌種の菌学的性質は多くは記載されていない。
株はアクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏ ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ）属に属するとみなされる。しかしながら上記文献
には上記菌種の菌学的性質は多くは記載されていない。
アクチノバチルスーエクリ−（Ａａｔｉｎｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ５ｑｕｕｌｉ ）とよく一致するが、ゼラチン
の液化能の点において相異が認められる。従って本菌株
はアクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏ ｂａｃｉ ｌｌｕ
ｇ属ＣＲＨ−１２７１株と命名した。ホーは工業技術院
微生物工業研究所に微生物受託番号微工研菌寄第７７２
１号として寄託されている。
ｌｕｓ ５ｑｕｕｌｉ ）とよく一致するが、ゼラチン
の液化能の点において相異が認められる。従って本菌株
はアクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏ ｂａｃｉ ｌｌｕ
ｇ属ＣＲＨ−１２７１株と命名した。ホーは工業技術院
微生物工業研究所に微生物受託番号微工研菌寄第７７２
１号として寄託されている。
本発明方法を実施するに当っては、通常の栄養培地を使
用できるが、好ましくはクレアチニン、クレアチンまた
はそれらの誘導体を用いて積重き一＋−７ハ振り了々ｌ
Ｉｓ 槙抽ハＷ鄭砧Ｌ１プ１４クレアチニン、クレ
アチン、グルコース、シュクロース、フラクトース、澱
粉、廃糖蜜、アルコール類、有機酸類が利用でき、天然
栄養源としてはペプトン、肉エキス、酵母エキス、コー
ンステイープリカー等が利用でき、窒素源としてはクレ
アチニン、クレアチン、アンモニア、硫安、硝安、塩安
、尿素等が利用でき、無機塩類としてはリン酸カリウム
、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等
が利用できる。これらの栄養源はそれぞれ単独に用いる
こともできまた組合せて用いることもできる。
用できるが、好ましくはクレアチニン、クレアチンまた
はそれらの誘導体を用いて積重き一＋−７ハ振り了々ｌ
Ｉｓ 槙抽ハＷ鄭砧Ｌ１プ１４クレアチニン、クレ
アチン、グルコース、シュクロース、フラクトース、澱
粉、廃糖蜜、アルコール類、有機酸類が利用でき、天然
栄養源としてはペプトン、肉エキス、酵母エキス、コー
ンステイープリカー等が利用でき、窒素源としてはクレ
アチニン、クレアチン、アンモニア、硫安、硝安、塩安
、尿素等が利用でき、無機塩類としてはリン酸カリウム
、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム等
が利用できる。これらの栄養源はそれぞれ単独に用いる
こともできまた組合せて用いることもできる。
菌株を培養するに当っては、通常振掃培養ま］ たは通
気攪拌培養で行なうことができる。一般に培養温度は２
５〜３５℃、培地ｐＨは６．５〜７，５であるのが好ま
しく、通常１〜２日間培養を行なうと、菌体中にクレア
チンアミジノハイドロラーゼが生成蓄積する。培養条件
は使用する菌株、培地組成などに応じ、クレアチンアミ
ジノハイドロラーゼの生産量が最大になるように設定す
ることは当然である。
気攪拌培養で行なうことができる。一般に培養温度は２
５〜３５℃、培地ｐＨは６．５〜７，５であるのが好ま
しく、通常１〜２日間培養を行なうと、菌体中にクレア
チンアミジノハイドロラーゼが生成蓄積する。培養条件
は使用する菌株、培地組成などに応じ、クレアチンアミ
ジノハイドロラーゼの生産量が最大になるように設定す
ることは当然である。
本発明の方法によって生成蓄積されたクレアチンアミジ
ノハイドロラーゼを採取するに当っては、培養液を遠心
分離、濾過等の操作により。
ノハイドロラーゼを採取するに当っては、培養液を遠心
分離、濾過等の操作により。
培養液から菌体を集め、集めた菌体をビーズ破砕もしく
は超音波破砕等の操作をして菌体中からクレアチンアミ
ジノハイドロラーゼを取り出す。かくして得られた粗酵
素液からクレアチンアミジノハイドロラーゼを単離する
に当っては、通常の酵素精製に使用される方法を使用で
きる。
は超音波破砕等の操作をして菌体中からクレアチンアミ
ジノハイドロラーゼを取り出す。かくして得られた粗酵
素液からクレアチンアミジノハイドロラーゼを単離する
に当っては、通常の酵素精製に使用される方法を使用で
きる。
例えば塩析、有機溶媒沈澱、透析、等電点沈澱、イオン
交換法、ゲル濾過等の方法を組合せて使用できる。例え
ば粗酵素液を遠心分離し、上溝を得る。さらにその上清
の硫安塩析画分（０，３５〜０．５５飽和）を得る。２
夜透析後、ＤＩＡＩ−セファロースＣＬ４Ｂイオン交換
体に吸着、溶出させる。活性画分を濃縮後、セファアク
リル５２００のゲル濾過を行なうことにより高度に精製
されたクレアチンアミジノハイドロラーゼを単離するこ
とができる。
交換法、ゲル濾過等の方法を組合せて使用できる。例え
ば粗酵素液を遠心分離し、上溝を得る。さらにその上清
の硫安塩析画分（０，３５〜０．５５飽和）を得る。２
夜透析後、ＤＩＡＩ−セファロースＣＬ４Ｂイオン交換
体に吸着、溶出させる。活性画分を濃縮後、セファアク
リル５２００のゲル濾過を行なうことにより高度に精製
されたクレアチンアミジノハイドロラーゼを単離するこ
とができる。
本発明方法により得られるクレアチンアミジノハイドロ
ラーゼの酵素化学的および理化学的性質は次のとおりで
ある。
ラーゼの酵素化学的および理化学的性質は次のとおりで
ある。
（１）作用：
本発明の酵素は１モルのクレアチンを加水分解して、１
モルのサルコシンと１モルの尿素を生成する。
モルのサルコシンと１モルの尿素を生成する。
（２）基質特異性：
クレアチンに特異的に作用する。
（３）至適ＰＨ：
本発明の酵素の至適ｐＨは第１図の曲線で表わされる如
く、ｐＦ１７．０〜９．０に高い活性を有している。
く、ｐＦ１７．０〜９．０に高い活性を有している。
（４）至適温度：
本発明の酵素の至適温度は第２図の曲線で表わされる如
く、３５℃〜４５℃にある。
く、３５℃〜４５℃にある。
（５）ｐ Ｈ安定性：
本発明の酵素を２５℃で、それぞれのｐＨで１７時間処
理したときのｐＨ安定性を第３図に示す。ｆＪｓ図より
明らかな如く、本発明の酵素はｐＨ４，５〜８．５の間
で安定である。
理したときのｐＨ安定性を第３図に示す。ｆＪｓ図より
明らかな如く、本発明の酵素はｐＨ４，５〜８．５の間
で安定である。
（６）熱安定性：
本発明の酵素をｐＨ７，５でそれぞれの温度で３０分間
処理したときの熱安定性を第４図番こ示す。第４図から
明らかな如く、本発明の酵素は５０℃まで安定である。
処理したときの熱安定性を第４図番こ示す。第４図から
明らかな如く、本発明の酵素は５０℃まで安定である。
（７）阻害剤：
下表１に示す如く、硝酸銀、塩化水銀、硫酸銅で阻害さ
れた。
れた。
表 １
無添加 −１００
Ａ１００Ａ ｌＸｌ０ Ｍ ２．５ＨｇＣ１
ｚ ＩＸＩ Ｏ−”１ ２．７ＣｕＳＯａ Ｉ
ＸＩ Ｏ−”Ｍ １１．０（８）Ｋ ｆｆｌ値： 本発明の酵素の３Ｃｍ値は約１，９Ｘ１０ Ｍである
。
ｚ ＩＸＩ Ｏ−”１ ２．７ＣｕＳＯａ Ｉ
ＸＩ Ｏ−”Ｍ １１．０（８）Ｋ ｆｆｌ値： 本発明の酵素の３Ｃｍ値は約１，９Ｘ１０ Ｍである
。
（９）分子量：
本発明の酵素は、セファアクリルＳ−２００尤田いｆ−
１１ル？Ｆ５過烙で約１０００００である。
１１ル？Ｆ５過烙で約１０００００である。
ａΦ酵素活性測定法：
本発明の酵素活性の測定は下記条件で１分間に１マイク
ロモルの黄色色素を生成する酵素活性を１単位とする。
ロモルの黄色色素を生成する酵素活性を１単位とする。
試薬： （Ａ） ０．１ Ｍクレアチン溶液（１，４９
９のクレアチンを５ＱｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，５に溶
解し、１００ｄとする）。
９のクレアチンを５ＱｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，５に溶
解し、１００ｄとする）。
（Ｂ）ＤＡＢ溶液（２，０りのＰ−ジメチルアミノベン
ズアルデヒドを１００＊ｆ’のジメチルスルホキシドに
溶解させた 後、濃塩酸１５−を加える）。
ズアルデヒドを１００＊ｆ’のジメチルスルホキシドに
溶解させた 後、濃塩酸１５−を加える）。
（Ｃ）酵素溶液（酵素標品を予め水冷した５０ＩＴＩＭ
リン酸緩衝液ｐＨ７，５で１．０〜４、 ＯＵ ／ ｍ
ｌに稀釈する）。
リン酸緩衝液ｐＨ７，５で１．０〜４、 ＯＵ ／ ｍ
ｌに稀釈する）。
手順：
１、試験管に上記基質溶液（Ａ） ０．９ ｍｅを入れ
、３７℃で予備加温する。
、３７℃で予備加温する。
２、上記酵素溶液（Ｃ） ０．１ ｒｎｅを加え反応を
開始する。
開始する。
３．３７℃で正確に１０分間反応させた後、上記ＤＡＢ
溶液（Ｂ） ２． Ｑ ｍｅを加えて反応を停止させる
。
溶液（Ｂ） ２． Ｑ ｍｅを加えて反応を停止させる
。
４．２５℃で２０分間放置後、４３５℃ｍにおける吸光
度を測定する（ ０Ｄｔｅｓｔ、 ）。
度を測定する（ ０Ｄｔｅｓｔ、 ）。
５、盲検は上記基質溶液（Ａ） ０．９ ｍｅを３７℃
で１０分間放置後、上記ＤＡＢ溶液（Ｂ） ２．０ ｄ
を加えて混和し、次いで酵素溶液（Ｃ） ０．１ ｍｌ
を加えて調製する。以下同様に２５℃で２０分間放置後
、４３５℃ｍにおける吸光度を測定する（ ０Ｄｂｌａ
ｎｋ ） 。
で１０分間放置後、上記ＤＡＢ溶液（Ｂ） ２．０ ｄ
を加えて混和し、次いで酵素溶液（Ｃ） ０．１ ｍｌ
を加えて調製する。以下同様に２５℃で２０分間放置後
、４３５℃ｍにおける吸光度を測定する（ ０Ｄｂｌａ
ｎｋ ） 。
計算式：
％式％
０．３２１＝黄色色素のミリモル分子吸光係数（ａｉ／
ハ０１．０＝光路長（ＣＩＩ＋） 実施例の説明 以下に本発明によるクレアチンアミジノハイドロラーゼ
の製造法を実施例を挙げて説明する。
ハ０１．０＝光路長（ＣＩＩ＋） 実施例の説明 以下に本発明によるクレアチンアミジノハイドロラーゼ
の製造法を実施例を挙げて説明する。
％は他に特記せぬ限り（駕）％である。
実施例 １
培地組成 ０．２％クレアチン、０．５％ポリペプトン
、０．５％酵母エキス、１．４ ％ Ｋ、ＨＰＯ，，０，３％ ＫＭ、ＰＯ４，０，０１
１Ｍｇ ｓ ｏ ａ ＠ ７ Ｈｓ □、ｐＨ７，０上
記の培地５０ｍｅを５００ ｍｌ！の坂ロフラスコに入
れ、１２１℃で１０分間オートクレーブ殺菌する。アク
チノバチルス（Ａｏｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ）ＣＲ
Ｈ−１２７１（微工研菌寄第７７２１号）の１白金耳を
上記培地に接種し、３０℃、２０時時間幅培養し、種培
養液とする。別に同条件にて殺菌した培地６１を含む１
０／容ジヤーフアメンターへ上記種培養液５０ｄを接種
する。３００ｒｐｍ、通気量３１／ ｗｉｎ、 ３０
’ｃで１６時間培養する。得られた培養液のクレアチン
アミジノハイドロラーゼ活性は０．８ Ｕ ／ ｍｅで
あった。培養液６１を遠心分離し、菌体を集め５０１Ｉ
ＩＭ！Ｊン酸緩衝液に懸濁し、１ｊとしてビーズ破砕機
（ダイノミルＫＤＬ ）により破砕する。菌体破砕液を
遠心分離し、上清を得る。上溝液に０．３５飽和になる
よう硫安を加え、遠心分離し、上清を得る。その上清液
にさらに０．５５飽和になるよう硫安を加え遠心分離し
、沈澱物を得る。５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，５，２
５０ｍｅに再溶解する。
、０．５％酵母エキス、１．４ ％ Ｋ、ＨＰＯ，，０，３％ ＫＭ、ＰＯ４，０，０１
１Ｍｇ ｓ ｏ ａ ＠ ７ Ｈｓ □、ｐＨ７，０上
記の培地５０ｍｅを５００ ｍｌ！の坂ロフラスコに入
れ、１２１℃で１０分間オートクレーブ殺菌する。アク
チノバチルス（Ａｏｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ）ＣＲ
Ｈ−１２７１（微工研菌寄第７７２１号）の１白金耳を
上記培地に接種し、３０℃、２０時時間幅培養し、種培
養液とする。別に同条件にて殺菌した培地６１を含む１
０／容ジヤーフアメンターへ上記種培養液５０ｄを接種
する。３００ｒｐｍ、通気量３１／ ｗｉｎ、 ３０
’ｃで１６時間培養する。得られた培養液のクレアチン
アミジノハイドロラーゼ活性は０．８ Ｕ ／ ｍｅで
あった。培養液６１を遠心分離し、菌体を集め５０１Ｉ
ＩＭ！Ｊン酸緩衝液に懸濁し、１ｊとしてビーズ破砕機
（ダイノミルＫＤＬ ）により破砕する。菌体破砕液を
遠心分離し、上清を得る。上溝液に０．３５飽和になる
よう硫安を加え、遠心分離し、上清を得る。その上清液
にさらに０．５５飽和になるよう硫安を加え遠心分離し
、沈澱物を得る。５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７，５，２
５０ｍｅに再溶解する。
再溶解液を５０１！ＩＭＩＪン酸緩衝液ｐＨ７，５で平
衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２１）で脱塩
する。脱塩液をＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−４Ｂカラ
ム５０ｍｅに吸着させ、Ｑ、４ＭＮａＣ１にて溶出する
。溶出液を限外濾過にて濃縮し、セファアクリルＳ−２
００カラムにて分子篩を行なう。
衡化したセファデックスＧ−２５カラム（２１）で脱塩
する。脱塩液をＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−４Ｂカラ
ム５０ｍｅに吸着させ、Ｑ、４ＭＮａＣ１にて溶出する
。溶出液を限外濾過にて濃縮し、セファアクリルＳ−２
００カラムにて分子篩を行なう。
活性画分の比活性は１８．ＩＵ／ｇＩｙ蛋白であつ九発
明の効果 本発明方法により得られるクレアチンアミジノハイドロ
ラーゼは熱安定性が５０℃まで安定であり、至適ｐＨが
７．０〜９．０と広く、Ｋｍ値も１．９×１０−１Ｍと
小さくすぐれており、かつｐＨ安定性も４．５〜８．５
で従来のものより広い。
明の効果 本発明方法により得られるクレアチンアミジノハイドロ
ラーゼは熱安定性が５０℃まで安定であり、至適ｐＨが
７．０〜９．０と広く、Ｋｍ値も１．９×１０−１Ｍと
小さくすぐれており、かつｐＨ安定性も４．５〜８．５
で従来のものより広い。
第１図は本発明により得られたクレアチンアミジノハイ
ドロラーゼのｐＨと活性の関係を表わし、第２図は温度
と活性の関係を表わし、第３図は２５℃でそれぞれのｐ
ＦＩで１７時間処理したときのｐＨと活性の関係を表わ
し、第４図はＰＨ７，５でそれぞれの温度で３０分処理
したときの温度と活性の関係を表わす。
ドロラーゼのｐＨと活性の関係を表わし、第２図は温度
と活性の関係を表わし、第３図は２５℃でそれぞれのｐ
ＦＩで１７時間処理したときのｐＨと活性の関係を表わ
し、第４図はＰＨ７，５でそれぞれの温度で３０分処理
したときの温度と活性の関係を表わす。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ
）属に属し、クレアチンアミジノハイドロラーゼ生産能
を有する菌株を栄養培地に培養し、培養物中にクレアチ
ンアミジノハイドロラーゼを生成蓄積せしめ、これを採
取することを特徴とするクレアチンアミジノハイドロラ
ーゼの製造法。 ２、菌株がアクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ）ＣＲＨ−１２７１である特許請求の範囲第１項
記載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59190134A JPS6167484A (ja) | 1984-09-11 | 1984-09-11 | クレアチンアミジノハイドロラ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59190134A JPS6167484A (ja) | 1984-09-11 | 1984-09-11 | クレアチンアミジノハイドロラ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6167484A true JPS6167484A (ja) | 1986-04-07 |
| JPH0218067B2 JPH0218067B2 (ja) | 1990-04-24 |
Family
ID=16252957
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59190134A Granted JPS6167484A (ja) | 1984-09-11 | 1984-09-11 | クレアチンアミジノハイドロラ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6167484A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2619123A1 (fr) * | 1987-08-04 | 1989-02-10 | Toyo Jozo Kk | Acide desoxyribonucleique portant l'information genetique de la creatinase |
-
1984
- 1984-09-11 JP JP59190134A patent/JPS6167484A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2619123A1 (fr) * | 1987-08-04 | 1989-02-10 | Toyo Jozo Kk | Acide desoxyribonucleique portant l'information genetique de la creatinase |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0218067B2 (ja) | 1990-04-24 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |