JPH0134036B2

JPH0134036B2 -

Info

Publication number: JPH0134036B2
Application number: JP56209676A
Authority: JP
Inventors: Eiichi Yoshino; Kazuo Matsura; Hideo Misaki
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1981-12-28
Filing date: 1981-12-28
Publication date: 1989-07-17
Also published as: JPS58116679A; FR2519649B1; DE3248427A1; FR2519649A1; US4496655A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、発酵法によるチラミンオキシダーゼ
の製造法に関するもので、さらに詳しくは、アー
スロバクター属に属するチラミンオキシダーゼ生
産菌を培養し、その培養物からチラミンオキシダ
ーゼを採取するチラミンオキシダーゼの製造法に
関するものである。チラミン（Ｐ―ヒドロキシフエニルエチルアミ
ン）オキシダーゼはチラミン（Ｐ―ヒドロキシフ
エニルエチルアミン）に対して強く作用し、その
酵素作用としては、１モルのチラミン、１モルの
酸素と１モルの水から、１モルのｐ―ヒドロキシ
ベンジルアルデヒド、１モルの過酸化水素と１モ
ルのアンモニアを生ずる反応を触媒するもので、
かつＬ―ロイシル―チラミンに作用しないので、
血清中のロイシンアミノペプチダーゼ（LAP）
活性測定に有用な診断用酵素である。すなわち、
LAPに合成基質であるＬ―ロイシル―チラミン
を作用させ、そのLAP活性により、合成基質よ
り生成されるチラミンに、このチラミンオキシダ
ーゼを作用させ、次いで、この反応系において消
費される酸素、または生成される過酸化水素やア
ンモニアの成分を、公知の電気的測定手段、過酸
化水素に対する呈色手段、螢光手段などに基いて
定量し、LAPの活性測定をすることができる。
この場合、チラミンオキシダーゼはその合成基質
にはなんら作用せず、LAP活性に基いて合成基
質より生成するチラミンにのみ作用するために、
きわめて正確にLAP活性測定をすることができ
る。このチラミンオキシダーゼの製造法に関して
は、J.Bacteriol.、127(1)、24〜31（1976）、医学と
生物学、91(4)、233〜236（1975）、J.Bacteriol.、
145(2)、796〜802（1981）、Agr.Biol.Chem.、31
(8)、897〜901（1967）等に報告されている。本発明者らは、上記チラミンオキシダーゼを生
産する微生物について探索を進めた結果、静岡県
田方郡大仁町の東洋醸造株式会社狩野川廃水処理
場の活性汚泥より分離したアースロバクター
（Arthrobacter）属に属するＢ―0813株がチラミ
ンオキシダーゼを生産することを見い出し、本発
明を完成するに到つたのである。本発明のアースロバクター・エスビー・Ｂ―
0813（Arthrobacter sp.B―0813）（微工研菌寄第
6240号）の菌学的性状は次のとおりである。 () 形態学的性状肉汁寒天培地上で30℃、６〜24時間培養し、
観察した所見は下記のとおりである。約６時間培養後の若い細胞は、真直ぐまたは
やや曲つた桿菌または短桿菌で端は丸く、単
独、二連または短連鎖をなしており、その大き
さは0.4×0.5〜1.2μmである。24時間以上培養
した古い細胞は、球ないし短桿菌で端は丸く、
単独、二連または短連鎖をなしており、その大
きさは0.4×0.4〜0.5μmである。菌は極毛また
は亜極毛を有し、運動性があり、芽胞を形成せ
ず、グラム染色は陽性であるが、培養時間によ
り陰性を示すことがある。また抗酸性染色は陰
性を示した。 () 培養性状各種培地上で30℃、１〜７日間培養した所見
は下記のとおりである。肉汁寒天平板培地；円形で縁が滑らかで平坦
な湿潤性のある集落を形成し、色相は灰白色よ
り時間の経過（数日後）と共に橙黄色に変色す
る。肉汁寒天斜面培地；線状に良好に生育し、色
相は平板培地同様、灰白色より橙黄色となり、
可溶性色素は産生しない。肉汁液体培地；生育は弱いが、液は一様に混
濁し、菌膜は形成しない。ミルク培地；ブロムクレゾールパープル
（BCP）を指示薬として添加し、14日間培養す
ると、培地はアルカリ性となるが、凝固ペプト
ン化は認められなかつた。 () 生理的性状硝酸塩の還元陽性脱窒反応陰性 MRテスト陰性 VPテスト陰性インドールの生成陰性硫化水素の生成陰性澱粉の加水分解陽性クエン酸の利用シモンズ培地陽性クリステンゼン培地陽性硝酸塩の利用陽性アンモニウム塩の利用陽性色素の生成可溶性色素は生成しないウレアーゼ SSR培地陰性クリステンゼン培地陰性オキシダーゼ陰性カタラーゼ陽性生育のPH範囲 5.5〜9.5 生育温度範囲 10〜42℃ 酸素に対する態度好気性 OFテスト（Hugh―Leifson培地）
NT（アルカリ性になる） OFテスト（変法培地）０ (注)変法の培地は、NH₄H₂PO₄1ｇ、KCl0.2
ｇ、MgSO₄・7H₂O0.2ｇ、イーストエキ
ス１ｇ、寒天３ｇ、BTB（ブロムチモール
ブルー）（10％）10ml、糖10ｇを1000mlの
蒸溜水に溶解調製した。PH7.0 糖より酸の産生（基礎培地、変法培地を
使用）（ガスは産生しない）酸を産生するものセロビオース、Ｄ―フラクトース、Ｄ―グ
ルコース、グリセリン、マルトース、Ｄ―
マンノース、メレジトース、トレハロース酸を産生しないものアドニトール、Ｌ―アラビノース、ヅルシ
トール、mesoエリスリトール、フコース、
Ｄ―ガラクトース、イノシトール、イヌリ
ン、ラクトース、Ｄ―マンニトール、メリ
ビオース、ラフイノース、Ｌ―ラムノー
ス、サリシン、Ｌ―ソルボース、ソルビト
ール、スターチ、サツカロース、Ｄ―キシ
ロースその他エスクリン、セルロースの分解能は認め
られず、DNAのグアニン、シトシン含量は62.7
％（Tm法による）であつた。上記のように、本菌株はグラム陽性で、陰毛ま
たは亜極毛で運動し、形状は若令菌（約６時間培
養）は桿状または短桿状で端は丸く、真直ぐか曲
つており、大きさは0.4×0.5〜1.2μmで、老令菌
（24時間以上培養）になると短桿状または球状で、
大きさは0.4×0.4〜0.5μmに変化する。また、糖
をペプトンを含まない培地において酸化的に分解
し、カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰性を示し、
栄養要求性は認められない。よつて、本菌株はそ
の性状より、バージーズ・マニユアル・オブ・デ
ターミネイテイブ・バクテリオロジー
（Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology）８版（1974）によれば、コリネ
ホーム・グループ・バクテリア（Coryneform
Group Bacteria）のアースロバクター属
（Arthrobacter）に属するものと認められる。よ
つて、本菌株をアースロバクター・エスピー・Ｂ
―0813と称することとし、工業技術院微生物工業
技術研究所に寄託した（微工研菌寄第6240号）。本発明における使用菌としては、上記したアー
スロバクター・エスピー・Ｂ―0813のみでなく、
アースロバクター属に属しチラミンオキシダーゼ
を生産する菌であれば、すべて用いることができ
る。本発明において使用する培地としては、大豆油
0.8％、コーンスチープリカー1.0％、肉エキス1.0
％、ポリペプトン0.5％、NaCl0.3％、β―フエニ
ルエチルアミン0.15％よりなるPH7.5の培地が好
ましく、30℃で20時間、通気撹拌培養を行なう。
これによつて、培養菌体中にチラミンオキシダー
ゼが生成蓄積される。得られる酵素の諸性質を示すと次のとおりであ
る。 (1) 作用チラミンに作用し、Ｌ―ロイシルチラミンに
作用しない。１モルのチラミン、１モルの酸素と１モルの
水から、１モルのｐ―ヒドロキシベンジルアル
デヒド、１モルの過酸化水素と１モルのアンモ
ニアを生ずる反応を触媒する作用を有する。 (2) 酵素活性の測定法下記の反応組成液0.5mlに酵素液0.05mlを加
え、全量をH₂Oで1.0mlとなし、37℃において
10分間反応させた後、１％セチルピリジニウム
クロライド（PH7.0）を反応停止液として2.0ml
加え、反応を止める。 0.2Mリン酸バツフアーPH7.5 0.1ml 0.2％フエノール 0.1〃 0.3％４―アミノアンチピリン 0.1〃（50U／ml）パーオキシダーゼ（西洋ワサ
ビ） 0.1〃 1mMチラミン 0.1（0.1mM）対照液として、酵素液の代りにH₂O0.1mlを
加え、490nmにおける吸光度を測定した。酵素
活性標示は次の計算式により算出した。Ｕ／ml＝△490nm／12×１／２×３／0.05（ml）×１
／10（min）×ｆ (注) △490nmは反応時間10分間における △490nmにおける吸光度を示す。ｆは稀釈
率を示す。 (3) 分子量 48000〔セフアローズCL―6B（商品名）ゲル
過法による。〕 (4) 等電点 PH4.23（キヤリア・アンフオライトを用いた
電気泳動法による。） (5) Km価 2.7×10^-5M（チラミンに対し） (6) 至適PH 酵素活性測定法の反応液のPHを酢酸バツフア
ー、グリシン―HClバツフアー、ジメチルグル
タル酸―NaOHバツフアー、Tris―HClバツフ
アー、リン酸バツフアー、グリシン―NaOH
バツフアーにより、それぞれ37℃において測定
した結果を第１図に示したが、PH7.0附近が最
もよく作用する。 (7) 至適温度酵素活性測定法の反応液のPHを7.5とし、温
度を変え測定した結果を第２図に示したが、温
度45℃附近が最もよく作用する。 (8) PH安定性酵素液を100mMの種々バツフアー、酢酸バ
ツフアー、ジメチルグルタル酸―NaOHバツ
フアー、リン酸バツフアー、Tris―HClバツフ
アーによりPHを変え、37℃、60分処理後の残存
活性を測定した結果を第３図に示したが、PH６
〜８の間で安定である。 (9) 熱安定性酵素活性測定法のPHを7.5とし、30℃より70
℃までの各温度において、５分間加熱処理を行
なつた後、残存活性量を測定した結果を第４図
に示したが、45℃までは安定であつた。 (10) 種々の物質に対する影響上記の酵素活性の測定法を利用して、種々添
加物を加えて、チラミンオキシダーゼのチラミ
ンに対する酵素活性を測定した結果を下表に示
す。【表】なお、補酵素フラビンモノヌクレオチドを加
えると、本酵素の活性は増加された。基質特異性上記酵素活性の測定法を利用して、その反応液
中のチラミンの代りに、次表に示す種々の基質を
用いて、チラミンに対する相対活性を求めた。【表】【表】上記結果に示すように、この酵素は、チラミン
に対して特に高い活性を示し、またβ―フエニル
エチルアミン、ｐ―クロロフエニルエチルアミ
ン、ｎ―ブチルアミンに高い活性を示し、その他
のアミンおよびアミノ酸にまつたく活性を示さな
い。次に、本発明の実施例を挙げて説明する。実施例１大豆油0.8％、コーンスチープリカー1.0％、肉
エキス1.0％、ポリペプトン1.0％、NaCl0.3％、
β―フエニルエチルアミン0.15％、PH7.5の培地
100mlを500ml容三角フラスコに加え、120℃で20
分間加圧殺菌する。冷却した後、アースロバクタ
ー・エスピー・Ｂ―0813を植付け、30℃で20時間
培養して種培養物を作つた。次いで、上記と同一
培地に消泡剤（シリコンAF―145：旭化学工業社
製）を0.2％添加後、加熱殺菌した培地20を30
容ジヤーフアーメンターに採り、前記種培養物
２本約200mlを移植する。250rpm、20／minの
通気撹拌条件下で、20時間培養を行なつた。得ら
れた培養物のチラミンオキシダーゼ力価換算値は
1.3U／mlであつた。なお、培地にβ―フエニルエチルアミンを加え
たが、チラミンやブチルアミンなどを加えると、
無添加に比べ約200倍以上酵素の収率が向上する。
この添加量は培地に対し0.1〜0.2％、特に0.15％
程度が最も好ましい結果が得られた。また、一般
に培養温度は25〜35℃、培養時間は10〜30時間で
ある。実施例２実施例１に示した方法によつて得られた培養物
約20（26000U）を、5000rpmで15分間遠心分
離し、分離物を20mMリン酸第１カリウムバツフ
アー（PH7.5）で洗浄し、遠心分離し、菌体を得
た。この菌体を、エチレンジアミンテトラアセチ
ツクアシツド（EDTA）5mM、リゾチーム１
mg／mlを含有する20mMリン酸第１カリウムバツ
フアー（PH7.5）４中に加え溶解した後、
5000rpmで15分間遠心分離をして上澄液を回収し
た。この上澄液に飽和硫酸アンモニア溶液を40％
Ｖ／Ｖを加えて沈澱物を除去し、さらに、これに
最初の上澄液量に対し90％Ｖ／Ｖの飽和硫酸アン
モニア溶液を加え沈澱物を析出せしめた。次いで
これを、別に調製した硅藻土（ラジオライト、昭
和化学社製）含有飽和硫酸アンモニア懸濁液を
紙を敷いたヌツチエに流して吸引して得られた約
２cmの厚さの層にしたラジオライト上に加えて、
取（ラジオライトの表面部のかき取り）した。
これを500mlの20mMリン酸第１カリウムバツフ
アー（PH7.5）に加えて沈澱物を溶解した後、
5000rpmで15分間遠心分離して上澄液を回収し、
該上澄液を限外過膜XM―50（アミコン社製）
で濃縮し、さらに脱塩するためにセフアデツクス
Ｇ―25のカラムにチヤージして、その流出液を回
収した。この回収液をイオン交換樹脂DEAE―セ
フアロースCL―6Bのカラム（径７cm×34cm）に
チヤージし、20mMリン酸第１カリウムバツフア
ー（PH7.5）と1.0Mリン酸第１カリウムバツフア
ー（PH7.5）の各１を用いる直線濃度勾配にて
溶出せしめ、その0.5から0.7Mの濃度で溶出され
た区分を回収し、回収液を限外過膜XM―50で
濃縮した後、脱塩のためにセフアロースCL―6B
のカラム〔20mMリン酸第１カリウムバツフアー
（PH7.5）〕にチヤージしてゲル過し、その流出
液を回収し、回収液を凍結乾燥してチラミンオキ
シダーゼの粉末6.7ｇ（0.5U／mg）を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で得られるチラミンオキシダー
ゼの至適PHの測定結果を示すグラフ、第２図は同
至適温度の測定結果を示すグラフ、第３図は同PH
安定性の測定結果を示すグラフ、第４図は同熱安
定性の測定結果を示すグラフである。

Claims

【特許請求の範囲】１アースロバクター属に属するチラミンオキシ
ダーゼ生産菌を培養し、その培養物からチラミン
オキシダーゼを採取することを特徴とするチラミ
ンオキシダーゼの製造法。２アースロバクター属に属するチラミンオキシ
ダーゼ生産菌がアースロバクター・エスピー・Ｂ
―0813株である特許請求の範囲第１項記載のチラ
ミンオキシダーゼの製造法。３チラミンオキシダーゼ生産菌の培養に際し、
β―フエニルエチルアミンを含有する培地を用い
る特許請求の範囲第１項記載のチラミンオキシダ
ーゼの製造法。