JPS6117465B2

JPS6117465B2 -

Info

Publication number: JPS6117465B2
Application number: JP54085260A
Authority: JP
Inventors: Shigeru Ikuta; Kazuo Matsura; Hideo Misaki
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1979-07-04
Filing date: 1979-07-04
Publication date: 1986-05-07
Also published as: DE3024915C2; DE3024915A1; JPS568687A; FR2460328B1; US4420562A; FR2460328A1

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、クレアチナーゼ（Creatinase）の製
造法に関する。クレアチナーゼは、酵素番号3.5.3.3、クレアチ
ン・アミジノヒドロラーゼ（Creatine amidino−
hydrolase）として、クレアチン＋H₂O→尿素＋ザルコシンの反応を触媒する酵素であり、従来シユードモナ
ス属（Pseudomonas）、フラボバクテリウム属
（Flavobacteuium）などに属する微生物から得ら
れていたにすぎなかつた。本発明者らは、京都府福山市下佐々木のなす畑
の土壌より分離したバチルス（Bacillus）属に属
する細菌Ｂ−0618菌株が、その菌体内に、上記の
反応を触媒するクレアチナーゼを生産することを
見い出し、該酵素を得た。上記の細菌Ｂ−0618菌株の肉眼的および顕微鏡
的観察に基く各種培地上における培養の特徴は、
次の記載する通りである。Ａ肉眼的観察 30℃ 18〜24時間培養の結果、次の通りであ
る。肉汁寒天斜面培地生育は良好で、線状に生育する。灰白色〜淡
褐色を呈する。可溶性色素は殆んど産生しな
い。グルコース肉汁寒天斜面培地生育は良好で、線状に生育する。灰白色〜淡
褐色を呈する。可溶性色素はあまり産生しな
い。肉汁液体培地一様に混濁する。菌膜は形成しない。沈澱を
生じる。リトマスミルク培地１〜２週間後アルカリ性となる。肉汁ゼラチン高層培地上部のみ生育し、液化は弱いがロート状に液
化する。Ｂ顕微鏡的観察細胞の形、大きさ大きく、直すぐな桿菌で、大きさは1.0〜1.5
×2.0〜５μｍで、端は丸い。単独または２連
で、たまに短連鎖する。細胞の多形性なし運動性周鞭毛で運動する（肉汁寒天斜面培地で、26
℃、18時間培養）。胞子菌体（細菌）の中央または端に近い所に、円
柱状または卵形（楕円形）の胞子を形成する。
胞子によつて菌体（細胞）は膨隆しない。胞子
の大きさは0.8〜1.0×1.2×1.6μｍである。グラム染色陽性抗酸性染色陰性Ｃ生理学的性質硝酸塩の還元陰性脱窒反応陰性 MRテスト陰性 VPテスト陰性インドールの生成陰性硫化水素の生成陽性スターチの加水分解陰性ゼラチンの加水分解陽性カゼインの加水分解陰性エスクリンの加水分解陰性セルロースの加水分解陰性クエン酸の利用シモンズ（Simons）培地陰性クリステンゼン（Christensen）陽性硝酸塩の利用陽性アンモニウム塩の利用陰性硝酸塩よりアンモニアの生成陽性生育PH範囲 PH6.4〜9.6で生育する。生育温度範囲 10〜42℃で生育する。耐塩性 Nacl 6.0％まで生育する。酸素に対する態度好気性Ｏ−Ｆテスト（Hugh Leifson培地） NT Ｏ−Ｆテスト（本菌株はグルコースより酸を産生
せず、また他の糖類も酸を産生しないか酸を産生
しても弱いため、糖類としてグリセリンを用い、
NH₄H₂PO₄1.0ｇ、KCl0.2ｇ、MgSO₄7H₂O0.2
ｇ、イーストエキス粉末1.0ｇ、細菌用寒天末3.0
ｇ、BTB（10％水溶液）10ml、蒸留水1000ml、
PH7.2〜7.4の基礎培地を用いた）Ｏ（酸化）糖より酸およびガスの産生Ｌ−アラビノース − セロビオース − ヅルシトール − エリスリトール − フラクトース＋（酸）ガラクトース − グルコース − グリセリン＋（酸）イノシトール − ラクトース − マルトース − マンニトール＋（酸）マンノース − メレジトース − メリビオース − ラフイノース − Ｌ−ラムノース − サリシン − Ｌ−ソルボース − ソルビトール − スターチ − シユクロース − トレハロース − キシロース − （ガスは産生しない）なお、上記方法においては、基礎培地として、
NH₄H₂PO₄1.0ｇ、KCl0.29ｇ、MgSO₄7H₂O0.2
ｇ、イーストエキス粉末1.0ｇ、細菌用寒天末3.0
ｇ、BTB（10％水溶液）10ml、蒸留水1000ml、
PH7.2〜7.4を用い、これに糖を10ｇ添加して行な
つたものである。以上の性状において、本菌Ｂ−0618が、グラム
陽性の芽胞を形成する大きな桿菌で、周毛で運動
する好気的な細菌で、グルコースより酸を産生し
ない点を、バージーズ・マエユアル・オブ・デイ
タミネイテイブ・バクテリオロジイ−（Ber−
ger′sManual of Determinatire Bacteriology）
８版（1974）により対比すればバチルス
（Bacillus）属に属する細菌であると認められ、
さらに本菌Ｂ−0618と、性状がよく一致している
と認められるバチルス・バデイウス（Bacillus
badius）、バチルス・フレウデンレイチイ
（Bacillus freudenr−eichii）およびバチルス・
マクロイデス（Baci−llus macroides）との比較
を行なうため、次の菌株との比較を行なつた。バチルス・バデイウスATCC−14574（本菌
は、ATCCにおけるタイプ・カルチヤーである）
（以下14574と略す）バチルス・フレウデレイチイATCC−7053（本
菌は、ATCCにおけるタイプ・カルチヤ−でもな
く、オリジナル・ストレインでもない）（以下
705.3と略す）バチルス・マクロイデスATCC−12905（本菌
は、ATCCにおけるタイプ・カルチヤ−である）
（以下12905と略す）なお、ATCCとはザ・アメリカン・タイプ・カ
ルチヤー・コレクシヨン（The American Type
Culture Collection）の略号である。

【表】

【表】なお、１）においては、Hugh Leifson培地を
用いたことを示す。２）においては、上述したＯ−Ｆテストに使用
した培地を用いたことを示す。 ※においては、酸の産生において、酸を産生す
るが、後にアルカリ性となることを示す。またブイヨン培地での生産性は次の通りであ
る。本菌Ｂ−0618 生育弱く、柔毛状沈澱を生ずる。 14574 一様に混濁、一部沈澱を生ずる。 7053 生育弱く、柔毛状沈澱を生ずる。 12905 生育弱く、一様に混濁、一部沈澱を生ずる。以上の比較実験の結果、本菌Ｂ−0618は、バチ
ルス・バデイウスATCC−14574とはウレアー
ゼ・グリセリンより酸の産生（酸を産生するが、
後にアルカリ性となる点）、マンニトールより酸
の産生の点で多少異なり、バチルス・フレウデン
レイチイATCC−7053とは液体培地での生育様子
やウレアーゼ産生の点から、より類似している
が、エスクリン加水分解、フラクトース、グリセ
リン、マンニトールなどの糖より酸の産生の点で
多少異なり、さらに該菌はタイプ・カルチヤーで
なく、さらにオリジナル・ストレインでもないこ
とより、本菌Ｂ−0618は同定困難であり、また新
種とするのも不適当であり、よつて本菌Ｂ−0618
をバチルス・エス・ピー（Bacillus sp）Ｂ−
0618と命名し、本菌は工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第4049号（FERM−ＰNo.
4049）として寄託されている。本発明は、上記の知見に基いて完成されたもの
で、バチルス属に属するクレアチナーゼ生産菌を
培地に培養し、その培養物からクレアチナーゼを
採取することを特徴とするクレアチナーゼの製法
である。本発明における使用菌としては、上記のバチル
ス・エスピー・Ｂ−0618はその一例であつてこの
菌だけでなくバチルス属に属する菌でクレアチナ
ーゼを生産する菌は、すべて本発明において使用
できる。もちろん、微生物は、自然的、人工的に
変異を起こし易く、本菌も例外ではないが、これ
らの変異株であつてもクレアチナーゼの生産能力
を失わない限り、本発明に使用し得るものであ
る。本発明を実施するに当つて、まずバチルス属に
属するクレアチナーゼ生産菌を、抗生物質、酵素
などを生産する通常の方法で培養する。培養の形
態は液体培養でも固体培養でもよいが、工業的に
はクレアチナーゼ生産菌の細胞をその生産用培地
に接種し、深部通気撹拌培養を行なうのが有利で
ある。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用
いられるものが広く使用されるものが広く使用さ
れる。窒素源としては利用可能な窒素化合物であ
ればよく、例えばコーン・スチープ・リカー、大
豆粉、ペプトン、種々の肉エキス、酵母エキス、
硫安、塩化アンモニウムなどが使用される。炭素
源としては、同化可能な炭素化合物であればよ
く、グルコース、糖蜜、グリセリン、スターチ加
水分解などで使用される。その他、食塩、塩化カ
リウム、硫酸マグネシウム、リン酸第一カリウム
リン酸第二カリウムなどの塩類が必要に応じて使
用される。また培地中にクレアチンを添加せしめ
て、培養時クレアチナーゼの生産能を上昇せしめ
ることが好ましく、好ましくは0.5〜１％程度添
加される。培養温度は菌が発育し、クレアチナーゼを生産
する範囲内で適宜変更し得るが、特に好ましくは
26〜33℃である。培養時間は条件によつて多少異
なるが、通常15〜25時間程度であつて、クレアチ
ナーゼが最高力価に達する時期をみはからつて適
当な時期に培養を終了すればよい。かくして得ら
れた培養物中において、クレアチナーゼはその菌
体内に含有、蓄積されている。この様にして得られた培養物中よりクレアチナ
ーゼを抽出し、粗製のクレアチナーゼ含有液を得
るために、例示すれば、まず培養物を固液分離
し、得られる湿菌体を、必要に応じてリン酸緩衡
液やトリスー塩酸緩衡液などに懸濁せしめ、次い
でリゾチーム処理、超音波処理や、フレンチプレ
ス処理などの菌体処理手段を適宜選択組合せて、
菌体内よりクレアチナーゼを抽出し、粗製のクレ
アチナーゼ含有液を得る。次いでこの粗製のクレアチナーゼ含有液を、さ
らに公知の蛋白質、酵素などの単離、精製手段を
用いて処理することにより精製されたクレアチナ
ーゼを得ることができる。例えば、粗製のクレア
チナーゼ含有液に、必要に応じて硫酸プロタミン
水溶液を加えて核酸などを除去し、これにアセト
ン、メタノール、エタノール、イソプロパノール
などの有機溶媒を加えて分別沈澱せしめるか、硫
安などを加えて塩析せしめるかして水溶液から沈
澱せしめ、回収すればよい。さらにこの沈澱物を
精製するに際し、例えば電気泳動法などにて単一
のスポツトを示すまでに精製すればよく、その精
製手段としては目的とするクレアチナーゼの性質
を利用した手段を用いればよく、例えば上記の沈
澱物をトリスー塩酸緩衝液などの媒体に溶解し、
ジエチルアミノエチルーセルロースやジエチルア
ミノエチルーデキストランゲル架橋体などの陰イ
オン交換体、デキストランゲル、ポリアクリルア
マイドゲルなどのゲル過剤によるクロマトグラ
フ法を行なえばよい。またこれらの手段を適宜組
合せて精製すればよく、次いでこれを空凍結乾燥
などの手段により乾燥してクレアチナーゼの精製
粉末を得る。次いで本発明によつて得られるクレアチナーゼ
は、以下に述べる力価の測定法に基いて測定さ
れ、またその理化学的性質を有するものである。 (1) 力価の測定法 0.2Mリン酸緩衝液（PH7.5）0.05ml、50ｍＭク
レアチン0.45mlによりなる反応液0.5mlに、酵素
液10μを添加し、37℃、５分間反応させた後、
0.5mlのPCMB溶液（0.5mM）を加えて反応を停
止せしめ、反応により生成したザルコシンを、ザ
ルコシンオキシダーゼ（E.C.1.5.3.1）を用いて
定量する。0.2Mトリス−塩酸緩衝液（PH8.0）0.1
ml、0.3％４−アミノアンチピリン0.05ml、0.2％
フエノール0.05ml、0.5mg／mlペルオキシダーゼ
0.05ml、30U.／mlのザルコシンオキシダーゼ0.1
ml、蒸留水0.15mlよりなる定量用試薬液0.5mlを
上記反応液に加え、37℃、20分間反応させた後蒸
留水1.5mlを加えて、500nmにて比色し、生成し
た過酸化水素量を求める。この過酸化水素量か
ら、クレアチナーゼの作用により生成したザルコ
シン量を求める。酵素活性は、１分間に１μmoleのザルコシン
を生成する酵素量を１単位（1U.）とする。 (2) 作用１モルのクレアチンより、１モルの水を消費し
て、１モルの尿素および１モルのザルコシンを生
成する。 (3) 至適PH クレアチナーゼの至適PHは、7.5〜9.0付近と認
められる。（第１図）使用した緩衝液は、PH5.0〜7.0：ジメチルグル
タル酸緩衝液、PH6.0〜7.5：リン酸緩衝液、PH7.5
〜9.0：トリス−塩酸緩衝液、PH9.0〜10.0：グリ
シン−水酸化ナトリウム緩衝液である。 (4) PH安定性各PHの緩衝液に酵素を加え、37℃にて60分間放
置した後、その残存活性を測定した。使用した緩
衝液は前記のものと同様である。第２図に示す通
り、クレアチナーゼはPH6.0〜9.0付近で安定であ
る。 (5) 熱安定性クレアチナーゼの10mMリン酸緩衝液（PH
7.5）溶液１mlを、各温度にて10分間処理し、前
記の力価の測定法に従つて残存活性を測定した。
第３図に示す通り、クレアチナーゼは40℃付近以
下で安定であると認められる。 (6) 至適温度第４図に示す通り、クレアチナーゼの反応の至
適温度は40℃付近と認められる。 (7) 分子量約74000（ゲル過法により測定） (8) 等電点 PH4.9付近（キヤリア・アンホライトを用いた
等電点分画法により測定）以上の通り、本発明の酵素クレアチニナーゼ
は、クレアチンに作用せしめる際に、水を消費し
て、尿素およびザルコシンを生成せしめることよ
り、酵素番号３，５，３，３クレアチン・アミジ
ノヒドロラーゼとして分類される酵素と認められ
る。本発明のクレアチナーゼは、酵素的臨床診断
剤、例えばクレアチニナーゼ、ザルコシンオキシ
ダーゼと組合せて血清や尿中のクレアチニンの測
定に利用され、またクレアチニナーゼの活性測定
などへの利用などの種々の有用性を有しているも
のである。次に実施例を挙げて本発明を具体的に述べるが
本発明は何んらこれにより限定されるものではな
い。実施例１クレアチン0.5％、魚肉エキス0.5％、酵母エキ
ス0.2％、KCI0.3％、K₂HPO₄0.1％、
MgSO₄7H₂O0.05％よりなる培地100ml（PH7.0）
を500ml容三角フラスコに加え、120℃、20分間滅
菌処理し、次いでこれにバチルス・エス・ビー・
Ｂ−0618（Bacillus sp Ｂ−0618，FERM−ＰNo.
4049）を接種し、30℃１日培養して種菌を得た。次いでこの種菌を、上記と同一組成を有する培
養液20を有してなる滅菌後の30容ジヤーフア
メンターに移植し、30℃、20時間、200rpm、20
／minの滅菌空気の条件下通気撹拌培養し、得
られる培養液を遠心分離して集菌し、その湿菌体
12ｇを分取し、この菌体を10mMリン酸緩衝液
（PH7.0）で洗浄後同一緩衝液に懸濁せしめ、これ
にリゾチーム（最終濃度0.2mg／ml）を加え、37
℃、30分間処理し、次いでこの溶液を5000rpm15
分間遠心分離して上清液を回収した（クレアチナ
ーゼの酵素活性800U）。得られた上清液に、２％
硫酸プロタミン水溶液2.5mlを加えて遠心して核
酸成分を除去した後、これに飽和硫安を加えて、
硫安濃度50％〜70％の画分にて沈澱する沈澱物を
回収し、この沈澱物を10mMトリス−塩酸緩衝液
（PH8.0）20mlに溶解し、この溶液をセフアデツク
スＧ−25（フアルマシア社製）を充填したカラム
（径3.5cm×30cm）にて脱塩し、次いで10mMトリ
ス−塩酸緩衝液（PH8.0）で平衝化したDEAE−
セルロース（ブラウン社製）を充填したカラム
（径2.0cm×18cm）にチヤージせしめ、0.1MKCl含
有の同一緩衝液にて洗浄後、KCl0.1M〜0.5Mの
濃度勾配で溶出せしめ、そのKCl0.3Mによる溶出
の活性画分を回収し、次いでこの活性画分は限外
過器（アミコン社製）を用いて濃縮した後
10mMリン酸緩衝液（PH7.5）に対して、10時間
透析せしめ、この溶液を凍結乾燥してクレアチナ
ーゼの粉末（全活性220U.、蛋白質38mg、比活性
5.8U.／mg、回収率27.5％）を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はクレアチナーゼの至適PHを示し、第２
図はクレアチナーゼのPH安定性を示し、第３図は
クレアチナーゼの熱安定性を示し、第４図はクレ
アチナーゼの至適温度を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

１バチルス属に属するクレアチナーゼ生産菌を
培地に培養し、その培養物からクレアチナーゼを
採取することを特徴とするクレアチナーゼの製造
法。