DE3248427A1

DE3248427A1 - Verfahren zur gewinnung von tyramin-oxydase

Info

Publication number: DE3248427A1
Application number: DE19823248427
Authority: DE
Inventors: Kazuo Matsuura; Hideo Shizuoka Misaki; Eiichi Yoshino
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1981-12-28
Filing date: 1982-12-24
Publication date: 1983-11-24
Also published as: JPS58116679A; FR2519649B1; US4496655A; FR2519649A1; JPH0134036B2

Description

Hamburg, 23. Dezember 1982 265182

Priorität: Oapan, 28. 12. 1981

Pat.Anm.Nr. 56-209676

Anmelder;

Toyo Jozo Kabushiki Kaisha 632-1, Mifuku, Ohito-cho, Tagata-gun, Shizuoka-ken, 3apan

Verfahren zur Gewinnung von Tyramin-Oxydase

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Tyramin-Oxydase durch Fermentation.

Tyramin-Oxydase hat eine spezifische Wirkung auf Tyramin (p-Hydroxyphenylethylamin) und katalysiert eine Reaktion, bei der aus einem Mol Tyramin, einem Mol Sauerstoff und

-Z-

elnam Mol Wasser ein Mol p-Hydroxybenzylaldehyd, 1 Mol Wasserstoffperoxid und ein Mol Ammoniak gebildet werden. Dieses Enzym wirkt nicht auf L-Leucyltyramin, und demzufolge läßt es sich gut verwenden für die klinische Diagnose von Leucinaminopeptidase (LAP) - Aktivität in Serum. Wenn man ein synthetisches L-Leucyltyramin-Substrat mit LAP behandelt, wird Tyramin freigesetzt, das durch Tyramin-Oxydase oxidiert wird; und wenn man den dabei verbrauchten Sauerstoff oder das entwickelte Wasserstoffperoxid oder Ammoniak mittels üblicher elektrischer, colorimetrischer oder fluorometrischer Analysenmethoden msßtechnisch bestimmt, kann man auf LAP prüfen. Tyramin-Oxydase greift das synthetische Substrat nicht an, sie wirkt nur auf Tyramin, und infolgedessen läßt sich LAP-Aktivität exakt messen.

Über Herstellungsverfahren für Tyramin-Oxydase wurde bereits in J. Bacteriol., 127 (1), 24-31 (1976), Igaku to Seibutsugaku (Medical and Biological Sciences, in Japanisch), 91 (4), 233-236 (1975), J.Bacteriol. 145 (2), 796-802 (1981) und Agr. Biol. Chem. , 31 (8), 897-901 (1967) berichtet.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Tyramin-Oxydase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Tyramin-Oxydase produzierenden Mikroorganismus der Gattung Arthrobacter in einem Nährmedium züchtet und aus der Kulturbrühe Tyramin-Oxydase isoliert. Wie gefunden wurde, läßt sich Tyramin-Oxydase besonders vorteilhaft aus einem solchen Mikroorganismus der Art B-0813, der aus einer von der Kanogawa Sewage Plant, Toyo Jozo K.K., Ohito-cho, Tagata-gun, Shizuoka-ken, Japan, gesammelten Bodenprobe isoliert wurde, erfindungsgemäß gewinnen.

Λ-

Taxonomische Eigenschaften des Mikroorganismus Arthrobacter sp. B-0813 FERM-P No« 6240 sind die folgenden.

(I) Morphologische Eigenschaften:

Folgende Beobachtungen wurden nach dem Züchten auf einem Bouillon-Agar-Nährboden bei 30 C während 6-24 Stunden gemacht.

Jugendliche Zellen, die nach 6-stündiger Bebrütung entstanden waren, hatten die Gestalt gerader oder leicht gebogener Stäbchen oder kurzer Stäbchen mit runden Kanten, die einzeln, im Doppel oder als kurze Ketten vorlagen und 0,4 χ 0,5 - 1,2 ,um gross waren.

Ältere Zellen, nach Bebrüten über eine Zeitspanne von 24 Stunden, waren kugelförmig oder bildeten kurze Stäbchen mit runden Kanten;■ sie lagen einzeln, gedoppelt oder kurzkettig vor und waren 0,4 χ 0,4 - 0,5 ,um gross.

Die Zellen waren polar oder subpolar begeißelt mit beweglichen Geißeln; keine Sporenbildung, Gram-positiv, manchmal je nach dar Zuchtungsdauer Gram-negativ, und die Färbung auf Sä ure festigkeit war negativ.

(II) Wachstum auf verschiedenen Medien:

Folgende Beobachtungen wurden gemacht, wenn auf verschiedenen Medien bei 30 C während 1 - 7 Tagen gezüchtet wurde.

Bouillon-Agar-Platte: rund, glatter Rand, eben, grau-weiß

bis hell-gelb nach wenigen Tagen

Züchtung.
Bouillon-Schrägagar : gutes Wachstum, faserförmiges Wachstum,

grau-weiß bis hell-gelb, keine Bildung

von löslichem Pigment.

BCP-Mi lch-Nahrmedi urn; Züchtung während 14 Tagen mit Zusatz

von Bromkresolblauj schwach alkalisch keine Peptonisatlons-Koagulation.

(III) Physiologische Eigenschaftens

Nitratreduktion: -t-

Denitratreaktion;

MR-Test:

VP-Te st: - -

Indol-Bildung: -

H-S-Bildung:

Stärkehydrolyse: +

Citrat-Nutzung:

Simons-Mediums ■ -5-

Chrystenssen-Medium: +

Nitrat-Nutzung: +

Ammonium-Nutzung: ^

Bildung von löslichem _

Pigment:

Urease:	-	Medium)	9,5
SSR-Medium;	-	Medium:	42°C
Chry ste nsse n-Me di um:	+
Oxydase:	5,5 -		NT (alk
Katalase :	10 -		: 0
Wa chs t ums-p H:	aerob		NH₄H₂PO₄
Wachstums-Tamperatur:	OF-Test (Hugh-Leifson-Medium):		MgSO₄.7H₂O
Natur:	OF-Test (modifiziertes
	Modifiziertes

Ig, KCl 0,2 g,

0„2 g, Hefeextrakt Ig,

Agar 3g", BTB (Bromthymolblau,10%) 10 ml, destilliertes Wasser 1000 ml

pH 7,0,

-χ-

Säurebildung aus Zucker (basal-Medium oder modifiziertes Medium wurden benutzt; es wurde keine Gasbildung beobachtet) :

Säurebildung: Cellobiose, D-Fructose , D-Glucose ,

Glycerin, Maltose, D-Mannose, Me Ie zi tose, Trehalose .

Keine Säurebildung: Adonit, L-Arabinose, Dulcit, Mesoerythrit,

Fucose, D-Galactose, Inosit, Inulin, Lactose, D-Mannit, Raffinose, L-Rhamnose, Sälicin, L-Sorbose, Sorbit, Stärke, Saccharose, D-Xylose.

Esculin-Zersetzung:

Cellulose-Zersetzung: -

Guanin- und Cytosin-Gehalte in DNA betrugen 62,7% (Tm-Methode).

Gemäß den zuvor angegebenen taxonomischen Eigenschaften zeigt die Art B-0813; positive Gram-Färbung, Beweglichkeit durch polare oder subpolare Begeißelung, jugendliche Zellen (nach etwa 6-stündiger Bebrütung) stäbchenförmig oder kurz stäbchenförmig mit abgerundeten Kanten, gerade oder gebogen, 0,4 χ 0,5 - 1,2 ,um groß, alte Zellen (nach mehr als 24 s-tündiger Bebrütung) kurz stäbchenförmig oder kugelförmig, 0,4 χ 0,4 - 0,5 ,um groß, oxidative Zersetzung von Zucker in einem Pepton-haltigen Medium, positive Katalase , negative Oxydase und nicht auxotroph. Als Ergebnis, bestimmt gemäß Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8.Auflage (19 74) , gahört die Art B-0813 zu der Gattung Arthrobacter in die Familie der Corynebacteriaceae. De ma nt sprechend wurde die Art B-0813 als Arthrobacter sp. B-0813 bezeichnet. Dieser Mikroorganismus wurde hinterlegt im Fermentation Institute, Agency of Industrial Technology and Science, MITI, Japan, und ist dort der permanenten Kulturkollektion als FERM-P No. 6240 zugeordnet.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann vorteilhaft diese Art, Arthrobacter so. B-O813 FERM-P So. 6 240 verwendet werden. Beschränkt ist das erfindungsgemiße Verfahren auf diese Art nicht, vielmehr lassen sich beliebige andere Tyramin-Oxydase produzierende Arten der zuvor angegebenen Gattung benutzen.

Bei einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde ein Medium mit 0,8% Sojabohnenöl, 1,0 % Maisquellwasser, 1,0% Fleischextrakt, 0,5% PoIypepton, 0,3% NaCl und 0,15% ß-Phenylethylamin (pH 7,5) eingesetzt, und darin wurde der Mikroorganismus aerob im Submersverfahren bei 30 C 20 Stunden lang gezüchtet.

Die b-iochemischen Eigenschaften des Enzyms waren die folgenden.

(1) Enzymatisehe Wirkung:

Wirkung.auf Tyramin; keine Wirkung auf L-Leucyltyramin. Das Enzym katalysierte eine Reaktion, bei der 1 Mol p-Hydroxybenzylaldehyd, 1 Mol Wasserstoffperoxid und 1 Mol Ammoniak aus 1 Mol Tyramin, 1 Mol Sauerstoff und 1 Mol Wasser gebildet wurden.

(2) P ruf methode für das Enzym:

Zu einem Reaktionsgemisch (0,5 ml) , das aus den nachfolgend aufgeführten Bestandteilen bestand und durch Zugabe von Wass-er auf 1,0 ml aufgefüllt worden war, wurda Enzymlösung ( 0,05 ml ) zugageben, und das Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 37°C bebrütet. 1% Cetylpyridinchlorid (2,0 ml, pH 7,0) wurde zugegeben, um die Reaktion abzustoppen.

- if -

Bestandteile

0,2 M Ph-osphatpuffer (pH 7,5) 0,1 ml

0,2% Phenol 0,1 ml

0,3% 4-Aminoantipyrin 0,1 ml

(500 U/ml) Peroxydase (Meerrettich) 0,1 ml

1 mM Tyramin 0,1 ml (0,1 mM)

Für eine Kontrollprobe wurde anstelle von Enzymlösung Wasser (0,1 ml) zugegeben.

Die meßtechnische Bestimmung des Reaktionsgemisches erfolgte bei 490 mn.

Nach folgender Gleichung wurde die Enzym-Aktivität berechnet,

.- 49Onm 3 1

U/ml = χ

... _v 1 0,05 (ml) 10 (min.)

^Lti ^x 2

worin Δ 49Onm der Absorptionswert bei A49Onm während Minuten und f das Verdünnungsverhältnis bedeuten.

(3) Molekulargewicht:

48000 (Gelfiltrationsmathode mittels perlförmigem Material zur Gelchromatographie auf Basis modifizierter Agarose (Handelsbezeichnung "Sepharose CL-6B") )

(4) Isoelektrischer Punkt:

pH 4,23 (Elektrophorese unter Verwendung von Ampholite als Träger) .

(5) Km-We rt:

2/7 χ 1O~ M (Tyramin) .

. 9·

(6) pH-Optimum:

Das pH-Optimum wurde bestimmt durch Untersuchung der Enzym™ Aktivität in Acetat-Puffer, Glycin-HCl-Puffer, Dimethylglutarat-NaOH-Puffer, Tris-HCl-Puffer, Phosphat-Puffer und Glycin-NaOH-Puffer. In Fig. 1 ist das pH-Optimum des Enzyms veranschaulicht, und man erkennt, daß der optimale pH-Wert bei annähernd pH 7,0 liegt.

(7) Temperatur-Optimum:

Für diese Untersuchung wurde der pH-Wert des Reaktionsgemische s auf pH 7,5 eingestellt, und es wurde bei verschiedenen Temperaturen geprüft. Das Ergebnis ist in Fig. 2 veranschaulicht, und man erkennt, daß die optimale Temperatur bei annähernd 45 C lag.

(8) pH-Stabilität:

Es wurde zu Puffern verschiedenen pH-Wertes, und zwar Acetat-Puffer, Dimethylglutaryl-NaOH-Puffer, Phosphat-Puffer und Tris-HCl-Puffer Enzymlösung zugegeben, dann wurde 60 Minuten lang bei 37 C bebrütet, und anschließend wurde die verbliebene Aktivität getestet. Die Ergebnisse sind in Fig. veranschaulicht, und man erkennt, daß das Enzym bei pH 6-8 stabil ist.

(9) Wiremstabilität:

In dem bei der Prüfmethode benutzten Reaktionsgemisch wurde das Enzym bei pH 7,5 5 Minuten lang bei 3O-7O°C erwärmt, und dann wurde die verbliebene Enzym-Aktivität getestet. Das Ergebnis ist in Fig. 4 veranschaulicht_f und man erkennt, daß das Enzym bis zu 45 C stabil war.

(10) Einwirkung verschiedener Substanzen:

Die Einwirkung verschiedener Substanzen auf die Aktivität von Tyramin-Oxydase ist in der nachfolgenden Tabelle 1 veranschaulich

Tabelle

Substanz: Zugegebene Menge Relative

Aktivität(%)

NaN.

NaMoO.

KCN NH₄Cl

LiCl CoCl₂

MnCl₂

CaCl₂

BaCl₂

p-Chlormercuribenzoat (PCMB) EDTA FMN Ce tylpyridinchlorid FAD

Cetyltrimathylammoniumchlorid 0,025 mM

Cation FB (Handelsname) Laurylbsnzolsulfonat (LBS) Bridge 35 (Handelsname) Triton X-IOO (Handelsname) Kontrollprobe (kein Zusatz)

Wie in Tabelle 1 zu erkennen, bewirkt der Zusatz von Flavinmononuclaotid eine Zunahme der Aktivität des Enzyms.

5	mM	98,3
ti	Il	39,7
Il	Il	100,0
Il	Il	96,6
Il	Il	82,8
Il	Il	86,2
Il	Il	82,8
Il	Il	86,2
Il	Il	96,6
0	,2 mM	79,3
5	mM	100,0
0	,01 mM	108,8
0	,025 mM	0,0
0	,1 mM	75,4
0	,025 mM	0,0
		21,3
0	,05 mM	63,9
0	,025 mM	96,7
0	,025 mM	96,7
0		100,0

- JÄ -

(11) Substrat-Spezifizität:

Die Substrat-Spazifizität wurde durch Zugabe verschiedener Substrate in das Reaktionsgemisch gemessen. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 2 zusammengestellt.

Tabelle 2

Substrat Relative Aktivität (%)

Tyramin 100,0

ß-Phenylethylamin 5 4,7

p-Chlorphenylethylamin 47,9

n-Butylamin 45,3

Methylamin 0,0

Eth-ylamin . 0,0

Benzylamin 0,0

Aminosäuren 0,0

Aminosäuren: L-Tryptophan, Valin, Phenylalanin, Arginin,

Lysin, Histidin, Alanin, Isoleucin, Threonin, Serin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Methionin, Tyrosin, D-Glutaminsäure, D-Phenylalanin, D-Alanin, DL-Isoleucin, DL-Valin, DL-Tryptophan,

Aus Tabelle 2 ist ersichtlich, daß das erfindungsgemäß vorteilhaft verwendbare Enzym spezifische Aktivität auf Tyramin zeigt und gewisse Aktivität auf ß-Phenylethylamin, p-Chlorphenylethylamin und n-Butylamin hat. Gegenüber sonstigen Aminen und Aminosäuren hat dieses Enzym keine Wirkung.

- ja -

Beispiel

In einen 500 ml fassenden Erlenmeyerkolben wurde ein Medium (100 ml, pH 7,5) mit 0,8% Sojabohnenöl, 1,0% Maisquellwasser, 0,1% Fleischextrakt, 1,0% Polypepton, 0,3% NaCl und 0,15% ß-Phenylethylamin eingebracht, und es wurde 20 Minuten lang bei 120 C sterilisiert. Es wurde mit Arthrobacter sp. B-0813 FERM-P No. 6 240 beimpft, und dann wurde 20 Stunden lang bei 30 C bebrütet und so das Impfmaterial für den technischen Prozess hergestellt.

In einen 30 Liter Rüttel-Fermenter wurde das Nährmedium (20 Liter) , das die gleichen Bestandteile enthielt und dem zusätzlich 0,2% eines Antischaununittels (Silicon AF-145 , Handels-produkt der Firma Asahi Chem.) zugesetzt worden war, eingefüllt, und es wurde mit dem Impfmaterial aus zwei der zuvor erwähnten Erlenmeyerkolben beimpft. Dann wurde unter Rühren mit 250 UpM und unter Belüftung mit 20 Liter/Min. 20 Stunden lang aerob bebrütet. Die Tyramin-Oxydase-Aktivität der Kulturbrühe betrug 1,3 U/ml.

Wenn dem Medium Tyramin oder Butylamin zugesetzt wurden, konnte, wie beobachtet wurde, im Vergleich zu der ohne Zugabe dieser Amine erzielbaren Ausbeute eine etwa 200-fach grössere Ausbaute an Enzym erzielt werden. Die Zugabemenge dafür beträgt 0,1 - 0,2%, vorzugsweise 0,15%.

Die Züchtungstemparatur liegt im allgemeinen bei 25 - 35°C, und die Fermentationszeit beträgt 10 - 30 Stunden.

In dieser Weise gewonnene Kulturbrühe (etwa 20 Liter, 26000 U) wurde 15 Minuten lang mit 5000 UpM zentrifugiert. Das separierte Material wurde mit 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) gewaschen, und man erhielt die Mycel- bzw. Bakterienmasse. Diese wurde in 20 mM Phosphatpuffer ( pH 7,5, 4 Liter), worin EDTA (5 mM) und Lysozym (1 mg/ml) enthalten waren, eingegeben, und

die Zellen wurden aufgelöst. Nach der Bakteriolyse wurde das Lysat 15 Minuten lang mit 5000 UpM zentrifugiert, und es wurde die überstehende Flüssigkeit gewonnen ο Dazu wurde gesättigte Ammoniumsulfatlösung bis zu einem Verhältnis von 40%V/V gegeben, und der gebildete Niederschlag wurde entfernt. Es wurde weitere gesättigte Ammoniumsulfatlösung zugegeben, bis 90%V/V, bezogen auf die ursprüngliche überstehende Lösung, erreicht war. Die dabei in der Lösung gebildete Ausfallung wurde auf eine Schicht aus Diatomeenerde (Handelsbezeichnung "Radiolite") aufgegossen, die Diatomeenerde, suspendiert in gesättigtem Ammoniumsulfat, wurde durch ein auf einem Trichter befindliches Filterpapier hindurchfiltriert, und dabai wurde eine 2 cm dicke Schicht aus Diatomeenerde gebildet. Anschließend wurde die Ausfällung gesammelt und dazu die Oberfläche der Schicht abgekratzt. Die Ausfällung wurde in 20 mM Phosphatpuffer ( pH 7,5, 500 ml ) gelöst und 15 Minuten lang mit 5000 UpM zentrifugiert. Mittels Ultrafiltrationsmambran (Handelsbezeichnung XM-50, Produkt der Firma Amicon Co.) wurde die überstehende Lösung konzentriert, und es wurde über eine Säule aus Ionenaustauscherharz (Handelsbezeichnung "Sephadex G-25") entsalzt. Das Eluat· wurde auf eine Säule ( 7 χ 34 cm ) aus DEAE-Sepharose CL-6B aufgegeben, und es wurde mit 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,5, 1 Lit.) und 1,0 M Phosphatpuffer (pH 7,5, 1 Lit.) mit linearem Gradient eluiert. Die bei dar Konzentration von 0,5 - 0,7 M eluierten Fraktionen wurden gesammelt und durch Ultrafiltrationsmembran XM-50 konzentriert. Die konzentrierte Lösung wurde an einer Säule aus Sepharose CL-6B mit 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) mittels Gelfiltration entsalzt. Das Eluat wurde lyophilisiert, und es wurde Tyramin-Oxydase in Pulverform erhalten (6,7 g, 0,5 U/mg) .

In der beiliegenden Zeichnung sind biochemische Eigenschaften des erfindungsgemäß gewonnenen Enzyms veranschaulicht. Es zeigen:
Fig. 1 das pH-rOptimum,

Fig. 2 das Temperatur-Optimum,

Fig. 3 die pH-Stabilität und

Fig. 4 die Wärme-Stabilität.

In allen Figuren ist auf der Ordinate die relative Aktivität in % abgetragen. Fig. 1 zeigt auf der Abszisse den pH-Wert. Parameter sind die verschiedenen im einzeln benannten Puffer, Fig. 2 zeigt auf der Abszisse die Temperatur in °C.
Fig. 3 zeigt auf der Abszisse den pH-Wert. Parameter sind
die verschiedenen im einzelnen benannten Puffer. Die Meßwerte wurden nach Bebrüten der Enzymlösung in diesen Puffern bei 37 C während 60 Minuten gewonnen.
Fig. 4 zeigt auf der Abszisse die Temperatur in C.
Die Meßwerte wurden nach Erwärmen der Enzymlösung bei pH 7,5 auf 30-70 C, während 5 Minuten gewonnen.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Gewinnung von Tyramin-Oxydase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Tyramin-Oxydase produzierenden Mikroorganismus der Gattung Arthrobacter in einem Nährmedium züchtet und aus der Kulturbrühe Tyramin-Oxydase isoliert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus der Gattung Arthrobacter einen Mikroorganismus der Art Arthrobacter sp. B-0813 FERM-P No. 6240 ve rwe nde t.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2 ₁ dadurch gekennzeich-net, daß man ein Nährmedium verwendet, das ß-Phenyleth-ylamin enthält.