DE2842940C2 - Verfahren zur Gewinnung von Sarcosin-Oxidase - Google Patents

Verfahren zur Gewinnung von Sarcosin-Oxidase

Info

Publication number
DE2842940C2
DE2842940C2 DE2842940A DE2842940A DE2842940C2 DE 2842940 C2 DE2842940 C2 DE 2842940C2 DE 2842940 A DE2842940 A DE 2842940A DE 2842940 A DE2842940 A DE 2842940A DE 2842940 C2 DE2842940 C2 DE 2842940C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
sarcosine
sarcosine oxidase
bacillus
formation
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
DE2842940A
Other languages
English (en)
Other versions
DE2842940A1 (de
Inventor
Yoshifumi Shizuoka Horiuchi
Shigeru Ikuta
Kazuo Matsuura
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Asahi Kasei Corp
Original Assignee
Toyo Jozo KK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toyo Jozo KK filed Critical Toyo Jozo KK
Publication of DE2842940A1 publication Critical patent/DE2842940A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2842940C2 publication Critical patent/DE2842940C2/de
Expired legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • C12N9/0032—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/832—Bacillus

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Sarcosin -;- H2O + O2*=* Glycin + HCHO + H2O2.
Dieses Enzym ist aus der Leber oder der Niere von Mäusen oder aus Kulturmassen von Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium hergestellt worden.
Es wurde nun gefunden, daß ein Enzym, das die oben beschriebene Reaktion katalysiert, von einem Bakterienstamm Β-06ί Sder Gattung Bacillus, der aus einer in Sasaki, Fukuchiyama, Kyoto (Japan) gesammelten Erdprobe isoliert worden ist, erzeugt wird. Es wurde das gereinigte Er.zyip isoliert Der Stamm B-0618 hat die folgenden taxonomischen Eigenschaften:
A) Makroskopische Beobachtung auf verschiedenen Medien, 18- bis 24stündige Kultivierung bei 30° C. 1. Bouillonagar-Schrägkultur
Wachstum: Gut, fadenförmig
Farbe der Kolonien: Grauweiß bis hellbraun
Fast kein diffundierbares Pigment
2. Glucosebouillonagar-Schrägkultur
Wachstum: Gut, fadenförmig
Färb·■· der Kolonien: Grauweiß bis hellbraun
Wenig diffundierbares Pigment
3. Bouillonbrühe
Kulturbrühe: Trüb und Sediment
keine Bildung von Häutcnen
4. Lakmusmilch
Alkalisierung in etwa 1 bis 2 Wochen
5. Bouiliongelatine-Stab
Wachstum: Wächst auf der Oberfläche, schwache, aber trichterartige Verflüssigung B) Mikroskopische Beobachtung
1. Gestalt und Größe der Zellen: Große und gerade Stäbe, 1,0—1,5 χ 2,0—5 μπι, runde Ecken, einfache oder doppelte Bindungen, manchmal kurze Bindungen
2. Polymorphismus: Nein
3. Motilität: Wimperartige Bewegung (beobachtet auf Bouillonagar-Schrägmedium bei 26°C, 18stündige Kultivierung)
4. Sporen: Zylindrisch oder elliptisch, an der Mitte oder nahe an der Kante der Zelle. Kein Quellen durch die Sporen, 0,8—1,0 χ 1,2—1,6 μπι
5. Gram'sche Färbung: Positiv
6. Säureechte Färbung: Negativ
C) Physiologische Eigenschaften:
Nitratreduktion: Negativ
Denitrifizierungsreaktion: Negativ
MR-Test: Negativ
VP-Test: Negativ
Indolbildung: Negativ
Hydrogensulfatbildung: Positiv
Stärkehydrolyse: Negativ
Gelatinehydrolyse: Positiv
Caseinhydrolyse: Negativ
Esculinhydrolyse: Negativ
Cellulosehydrolyse: Negativ
Citratverwertung
Simons-Medium: Negativ
Christensen-Medium: Positiv
Nitratverwertung: Positiv
Ammoniumvcrwertung: Negativ
Bildung von Ammonium aus Nitrat: Positiv
Wachstums-pH: pH 6,4 bis 9,6
Wachstumstemperatur: 10 bis 42°C Halogentoleranz: NaCl 6,0% Verhalten in Sauerstoff; aerob O— F-Test (Hugh Leifson-Medium): NT
O— F-Test*): O (oxidative Zersetzung)
*) O—F-Testmedium: Modifiziertes Medium
Aufgrund der Tatsache, daß aus Glucose keine Säure gebildet wurde und daß aus einem anderen Saccharid keine oder nur eine schwache Säurebildung erfolgte, wurde Glycerin als Zucker verwendet NH4H2PO4 1,0 g, KC! 0,2 g, MgSO4 · 7 H2O 0,2 g, Hefeextraktpulver 1,0 g, Agarpulver 3,0 g, Bromthymolbiau (10%ige wäßrige Lösung) 10 ml, destilliertes Wasser 1000 ml, pH 7,2 bis 7,4.
Säure- und Gasbildung aus Zucker**). (Keine Gasbildung wurde beobachtet).
Dulcit: — 15
Galactose: —
Inoch: —
Mannit: + (Säure)
Melibiose: —
Saiicin: — 20
Stärke: -
Xylose: —
>Oa ■ 7 H2O 02 g, Hefeextraktpulver 1,0 g. Agarpulver 3,0 g, B-omthymolblau (10%ige wäßrige Lösung) 10 ml, destilliertes Wasser 1000 ml, pH 72 bis 7,4 10 g Zucker wurden zugesetzt
Unter Berücksichtigung der Angaben von Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Auflage, 1974, wird der Stamm B-0618 mit den oben angegebenen taxonomischen Eigenschaften, insbesondere der Eigenschaften, daß er grampositiv ist, daß ein sporenbildender großer Bazillus vorliegt daß es sich um wimpernartig bewegende aerobe Bakterien handelt daß eine Säurebildung aus Glucose erfolgt, als ein Stamm zur Art Bacillus betrachtet
Nachstehend wird ein Vergleich des Stamms B-0618 mit den anderen ähnlichen Bakterien Bacillus badius, Bacillus freudenreichii und Bacillus macroides durchgeführt
Bacillus badius ATCC-14574 (Typkultur) Bacillus freudenreichii ATCC-7053 (N'iehitypkuitur, nichturspriingiicher Stamm) Bacillus macroides ATCC-12905 (Typkultur)
L-Arabinose: — Cellobiose: —
Erythrit: — Fructose: + (Säure)
Glucose: — Glycerin: + (Säure)
Lactose: — Maltose: —
Mannose: — Malecitose: —
Raffinose: — L-Rhamnose:
L-Sorbose: — Sorbit:
Saccharose: — Trehalose: —
**) Grundmedium NH4H2PO4 1,0 g, KCl 02 g. Mg
O-F-Test
O-F-Test
Katalase
Oxidase
Urease
Gelatineverflüssigung Stärkehydrolyse Esculinhydrolyse Indolbildung H2S-Bildung Acetonbildung MR-Test
Nitratreduktion Citratverwertung
Stamm Bacillus Bacillus Bacillus Bemerkungen
B-0618 badius freuden macroides
ATCC-14574 reichii ATCC-12905
ATCC-7053
keine keine keine keine Hugh
Säure Säure Säure Säure Leifson-
bildung bildung bildung bildung Medium
0 0 keine keine O-F-Test-
Säure Säure medium
bildung bildung wie oben
beschrieben
(Fortsetzung)
Stamm Bacillus Bacillus Bacillus Bemerkungen
B-0618 badius freuden- macroides
ATCC-14574 reichii ATCC-12905
ATCC-7053
Bildung von Säure aus Zuckern
Arabinose — — — —
Fructose + — — —
Galactose — — — —
Glucose — — — —
Glycerin + +*) — — spätere
Alkalinisrg.
Inosit — — —
Lactose — — — —
Maltose — — — —
Mannit + — — —
Sorbit — — — —
Saccharose — — — —
Trehalose — — ' — —
Xylose — — — —
Die charakteristischen Eigenschaften auf Bouillonmedium waren wie folgt.
Stamm B-0618: Schwaches Wachstum, wollartiges Sediment
ATCC-14574: Gieichförmig trüb, teilweises Sediment
ATCC-7053: Schwaches Wachstum, wollartiges Sediment
ATCC-12905: Schwaches Wachstum, gleichförmig trüb, teilweises Sediment
Es ergibt sich daher, daß die taxonomischen Eigenschaften des Stammes B-0618 sich in mehreren Punkten von denjenigen vergleichbarer Stämme in der folgenden Weise unterscheiden.
Bacillus badius ATCC-14574:
Bildung von Urease, Säurebildung aus Glycerin (Säurebildung und spätere Alkalinisierung) und Mannit. Bacillus freudenreichii ATCC-7053:
Wachstum auf flüssiger Kultur und Ureasebildung (geringfügig ähnlich), Esculinhydrolyse, Säurebildung aus Fructose, Glycerin und Mannose. Der Stamm ATCC-7053 ist weder eine Typkultur noch ein ursprünglicher Stamm. Er kann daher nicht mit dem Stamm B-0618 identifiziert werden. Somit kann der Stamm nicht zu einer neuen Art gehören.
Der Stamm B-0618 wird daher als Bacillus sp. angesehen und als Bacillus sp. B-0618 bezeichnet. Dieser Stamm wurde beim Institute for Microbial Industry and Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, mit der Hinterlegungsnummer FERM-P Nr. 4049 hinterlegt. Diese Hinterlegung wurde vom FRI direkt in die Hinterlegung FERM BP-750 umgewandelt.
Aufgabe der Erfindung ist es. ein weiteres billiges Verfahren zur Herstellung des Enzyms Sarcosin-Oxidase zur Verfügung zu stellen.
Die Lösung dieser Aufgabe, also die Erfindung, ist im Patentanspruch angegeben. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält das Kulturmedium Creatin.
Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigt F i g. 1 den optimalen pH-Wert der Sarcosin-Oxidase,
F i g. 2 die optimale Temperatur der Sarcosin-Oxidase,
F i g. 3 die pH-Stabilität der Sarcosin-Oxidase,
F i g. 4 die Wärmestabilität der Sarcosin-Oxidase,
F i g. 5 das Ergebnis der quantitativen Analyse von Sarcosin durch Bestimmung von Formaldehyd, F i g. 6 das Ergebnis der quantitativen Analyse von Sarcosin durch Bestimmung von Hydroperoxid.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird Bacillus sp. B-0618 in einem herkömmlichen Medium für die Bildung von Antibiotika oder Enzymen gezüchtet Für die technische Herstellung ist eine belüftete Untertauchkultur bevorzugt.
Vorzugsweise kann ein herkömmliches Medium für Mikroorganismen verwendet werden. Als Stickstoffquellen können assimilierbare Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser. Sojabohnenpulver, Pepton, Fleischextrakte, Hefeextrakte, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid od. dgl, verwendet werden. Assimilierbare Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Melassen, Stärkehydrolysate u. dgl, können vorzugsweise verwendet werden. Verschiedene anorganische Salze, wie Natriumchlorid. Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat Kaliumhydrogenphosphat oder KaIiumdihydrogenphosphat. werden gegebenenfalls verwendet Die Zugabe von Creatin zu dem Medium, vorzugsweise von 03 bis 1 %, stimuliert die Bildung von Sarcosin-Oxidase.
Die Kultivierungstemperatur kann innerhalb der Bereiche für das Wachstum von Mikrobenzeüen und die
Produktion eines Enzyms variiert werden. Sie beträgt vorzugsweise 26 bis 33°C. Die Kultivierungszeit kann je nach den Bedingungen variiert werden. Gewöhnlich beträgt sie 15 bis 25 Stunden. Die Kultivierung sollte naturgemäß beendigt werden, wenn die Sarcosin-Oxidase-Produktion praktisch vollständig ist.
Sarcosin-Oxidase liegt in den Zellen der Mikroorganismen vor.
Die Extraktion der Sarcosin-Oxidase aus der Kulturmasse kann beispielsweise wie folgt geschehen. Die Kulturmasse wird zentrifugiert und die nassen Zellen werden in einem Puffer, wie einem tris-HCI-Puffer, suspendiert und durch Behandlung mit Lysozym, Beschallung oder mit einer französischen Presse aufgebrochen. Dir io erhaltene rohe Sarcosin-Oxidase wird durch herkömmliche Isolierungs- und Reinigungsmethoden für Proteine und Enzyme gereinigt. So wird z. B., nachdem erforderlichenfalls die Nukleinsäure durch Zugabe von Protaminsulfat entfernt worden ist, vorzugsweise eine fraktionierte Ausfällung mit Aceton, Methanol, Äthanol oder Isopropanol und ein Aussalzen mi!. Ammoniumsulfat durchgeführt. Eine weitere Reinigung kann beispielsweise durch eine Chromatographie erreicht werden, bei der die rohe Sarcosin-Oxidase in tris-HCI-Puffer aufgelöst wird iind unter Verwendung von Anionenaustauschern, beispielsweise eines Diäthylaminoäthylcellulose- oder -dextrangels und von Gelfiltrationsmitteln, wie Dextrangel oder Polyacrylamidgel, Chromatographien wird. Gereinigte Sarcosin-Oxidase kann als lyophilisiertes Pulver gelagert werden.
Die erfindungsgemäß gewinnbare Sarcosin-Oxidase hat die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:
1. Enzymwirkung
1 Mol Sarcosin verbraucht 1 Mol H2O und 1 Mol Sauerstoff und es erzeugt 1 Mol Glycin, 1 Mol Formaldehyd und 1 MoI Wasserstoffperoxid. Das Enzym katalysiert die Oxidation von Sarcosin unter Bildung von Glycin und Formaldehyd.
CH3NHCH2COOH + O2 + HiO-H2NCH3COOH + HCHO + H2O2
Die Enzymuntersuchung wird wie folgt durchgeführt.
Zu einem Reaktionsgemisch (0,5 ml), bestehend aus 0,2 Mol tris-HCL-Puffer (pH 8,0,0,05 ml), r-Aminoantipyrin (3 mg/ml, 0,05 ml), 0,2% Phenol (0,05 ml), Peroxidase (0,5 mg/ml, 0,05 ml), 1 Mol Sarcosin (0,1 ml) und destilliertem Wasser (0,2 ml), wird die Enzymlösung (10 μΐ) gegeben. Es wird 5 min bei 37°C inkubiert. Äthanol (2,1 ml) wird zugesetzt, um die Reaktion zu beendigen. Die Bildung von Wasserstoffperoxid wird kolorimetrisch mittels der Absorption bei 480 nm gemessen.
Eine Einheit (1 Einheit, 1 E) der Enzymaktivität ist als diejenige Enzymmenge definiert, die 1 μίτι Wasserstoffperoxid/min erzeugt.
35 2. Substratspezifität
Zu einem Reaktionsgemisch (0,5 ml), bestehend aus 0,2 Mol tris-HCI-Puffer (pH 8,0,0,05 ml), 4-Aminoantipyrin (3 mg/ml, 0,05 ml), 0,2% Phenol (0,05 ml), Peroxidase (0,5 mg/ml, 0,05 ml), destilliertem Wasser (0,2 ml) und den folgenden Substraten (0,5 Mol, 0,20 ml), wird Sarcosin-Oxidase (0,5 Einheit) und es wird 5 min bei 37° C inkubiert. Äthanol (2,5 ml) wird zugesetzt, um die Reaktion zu beendigen. Es wird eine kolorimetrische Bestimmung bei 480 nm durchgeführt.
Die relative Aktivität auf mehrere Substrate ist wie folgt:
3. Optimaler pH-Wert
Um einen Effekt von 4-Aminoantipyrin-Phenol-Peroxidase auf Chromogen zu vermeiden, wird die Bildung von Aldehyd nach der Acetylacetonmethode bestimmt Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. Der optimale pH-Wert beträgt 8,0 bis 95.
Substrate Relative Aktivität
Sarcosin 100,0
Cholin 0
Betain 0,03
Dimethylglycin 0,01
Glycin 0,06
Serin 0
Threonin 0
Alanin 0
Valin 0
Lysin 0,09
N- Methyläthanolamin 0
N-Dimethyläthanolamin 0
y Es werden folgende Pufferlösungen verwendet:
•'ν pH 4 bis 7: Dimethylglutaratpuffer,
n'i pH 6—8: Phosphatpuffer,
H 5 pH 7,5-9:
$ tris-HCI-Puffer,pH9-10:
I Glycin-NaOH-Pufferund
?« pH 10--11: Natriumcarbonat—Boratpuffer.
$ ίο 4. Optimale Temperatur
Etwa 50° C, wie in F i g. 2 gezeigt. Substrat: Sarcosin.
'i> 5. pH-Stabilität
p Dimethylglutaratpuffer für pH 5—7, Phosphatpuffer für pH 6—8, tris-HCl-Puffer für pH 7,5—9, Glycin-Na-
I] OH-Puffer für pH 9—10 und Natriumcarbonat-Boratpuffer für pH 10—11 werden verwendet. Zu 0,1 ml von
£? jedem Puffer werden 100 μΐ Enzymlösung (Protein 100 μίτι/ΓηΙ) gegeben und es wird 60 min bei 37°C stehenge-
"I lassen. Nach dem Einstellen des pH Wertes durch Zugabe von 1,0 Mo! tris-HCl- Puffer (ρίί 8,0, 0,3 mi) und
[·.! 20 Abnahme von 20 μΙ Probe wird die Enzymaktivität bestimmt. Sarcosin wird als Substrat verwendet. Wie in
"j* F i g. 3 gezeigt ist, beträgt der stabile pH-Wert etwa 6,0—10,0.
i; 6. Wärmestabilität
M 25 Die Wärmestabilität des Enzyms wird bestimmt, indem lOmMol tris-HCl-Puffer (0,5 ml, pH 8,0), der das
ψ. Enzym (Protein 20 μg/ml) enthält, bei verschiedenen Temperaturen 10 min unter Verwendung von Sarcosin als
'"<}, Substrat inkubiert wird. Wie in F i g. 4 gezeigt ist, ist das Enzym unterhalb etwa 40°C stabil.
t 7. Molekulargewicht
■ '■ 40 000 (gemessen nach der Gelfiltrationsmethode).
b- 8. Isoelektrischer Punkt
■p 35 4,7 (Elektrophorese unter Verwendung eines trägerartigen Ampholyte).
H 9. Identifizierung und Bestimmung der Reaktionsprodukte:
|j a) Identifizierung von Glycin
|j 40 Reaktionsgemisch
f; 0,2 Mol tris-HCl-Puffer (pH 8,0) 1,0 ml
J1 1 mMol Sarcosi;i 1,0 ml
Ij Catalase 200 u.
|| Sarcosin-Oxidase 5 u.
fl 45 Destilliertes Wasser 8,0 ml
I Insgesamt 10,0 ml
i Das obige Reaktionsgemisch (10 ml) wurde 60 min bei 37° C inkubiert Danach wurde die Reaktion abgebro-
ffi chen, indem 5 min bei 100° C erhitzt wurde. Der gebildete Niederschlag wurde abzentrifugiert und das überste-
50 hende Produkt wurde auf das lOfache konzentriert und sodann auf ein Filterpapier als Fleck aufgebracht. Ein Chromatogramm wurde mit wassergesättigtem Phenol über Nacht aufgenommen und durch Erhitzen nach Besprühen mit Ninhydrinlösung gefärbt. Der Rf-Wert betrug 0,26.
Eine authentische Probe von Sarcosin und Glycin hatte einen Rf-Wert von 0,66 bzw. 0,26. Ein Fleck, der den obigen Rf-Wert hatte, wurde daher als Glycin identifiziert.
b)
65 Das Reaktionsgemisch wurde 20 min bei 37° C inkubiert Die Reaktion wurde durch Sminütiges Erhitzen abgebrochen. Nach dem Abkühlen wurde Acetatpuffer (pH 5,5, 1,5 ml) zugesetzt Weiterhin wurde die unten beschriebene Chromogenlösung (20 ml) zugesetzt Nach einer 50minütigen Inkubierung bei 37° C wurde die Lösung kolorimetrisch bei 412 nm gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in F i g. 5 dargestellt Die Bildung
Bestimmung von Formaldehyd 0,05 ml
Reaktionsgemisch 0,10 ml
0,2 Mol tris-HCl-Puffer (pH 8,C) 20Ou.
Sarcosin mit aliquoter Konzentration 3,Ou.
Cataiase 035 ml
Sarcosin-Oxidase 2040 ml
Destilliertes Wasser
Insgesamt
von Formaldehyd entspricht der Konzentration von Sartosin.
Chrornogen
Ammoniumacetat 15 g
Essigsäure 03 ml
Acetylaceton 0,2 ml
Wasser auf 100 ml
c) Bestimmung von Wasserstoffperoxid
Wasserstoffperoxid wurde quantitativ durch Kombination von 4-Aminoantipyrin-Phenol-Peroxidase bestimmt.
Reaktiorsgemisch
0,2 Mol tris-HCl-Pufferlösung (pH 8,0) 0,05 ml
3 mg/ml 4-Aminoantipyrin 0,05 ml
0,2% Phenol 0,05 ml
0,5 mg/ml Peroxidase 0,05 ml
Sarcosin mit aliquoter Konzentration 0,10 rnl
Sarcnsin-Oxidase 3,0 u.
Destilliertes Wasser 0.2 ml
insgesamt 0,5 ml
Das Reaktionsgemisch wurde 20 min bei 370C inkubiert. Nach der Zugabe von Äthanol (2,5 ml) wurde das Gemisch kolorimetrisch bei 480 nm gemessen. Wie in F i g. 6 gezeigt ist, entspricht die Bildung von Wasserstoffperoxid der Konzentration von Sarcosin.
Wie vorstehend erläutert, katalysiert das Enzym Sarcosin-Oxidase die Oxidation, bei der Sarcosin mit Sauerstoff oxidiert wird (wobei 1 Mol Wasser pro 1 Mol Sarcosin verbraucht wird).
Es werden Glycin, Formaldehyd und Wasserstoffperoxid gebildet. Das Enzym wird daher als das Enzym EC 1.5.3.1 Sarcosin: Sauerstoff-Oxidoreductase(Demethylierung) bestätigt.
Die Sarcosin-Oxidase kann für ein enzymatisches diagnostisches Mittel eingesetzt werden, beispielsweise zur Bestimmung von Creatinin im Blut oder Urin, in Kombination mit Creatinase und Creatininase. Weiterhin kann die Sarcosin-Oxidase zur Bestimmung der Aktivität von Creatininase verwendet werden.
Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert.
35 Beispiel 1
Ein Medium (100 ml), enthaltend Creatin (03%), lösliche Fischstoffe (0,5%), Hefeextrakt (0,2%), KCI (0,3%), K2HPO4 (0,1%) und MgSO4 · 7 H2O (0,05%) in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben, vurde 20 min bei 1200C sterilisiert Ein inokulierter Bacillus sp. B-0618 wurde 1 Tag bei 300C als Impfkultur gezüchtet. Diese wurde in das gleiche sterilisierte Medium (201) in einen 30-1-Becherfermentator überführt. Es wurde 20 Std. bei 300C und bei 100 Upm sowie unter Belüften mit 20 l/min kultiviert. Die durch Zentrifugieren gesammelten Bakterienzellen (12 g) wurden mit 10 mMol Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und in der gleichen Pufferlösung suspense«. Lysozym (Endkonzentration 0,2 mg/ml) wurde zugesetzt. Es wurde 30 min bei 37° C gerührt. Das durch 15minütiges Zentrifugieren mit 5000 Upm erhaltene überstehende Produkt wurde gesammelt (Sarcosin-Oxidaseaktivität: 1400 E). Zu dem so erhaltenen überstehenden Produkt wurden 2% Protaminsulfatlösung (2,5 ml) gegeben. Der Nucleinsäureniederschlag wurde abgetrennt
Zu dem überstehenden Produkt wurde gesättigte Ammoniumsulfatlösung gegeben und der Niederschlag der Fraktionen der 50—70% Ammoniumsulfatkonzentration wurde gesammelt.
Der Niederschlag wurde in 10 mM tris-HCl-Puffer (pH 8,0, 20 ml) aufgelöst und durch eine Sephadex G-25 Säule (3^ χ 30 cm) entsalzt Die entsalzte Lösung wurde in einer DEAE-Cellulose-Säule (2,0 χ 18 cm, gepuffert mit 1OmM tris-HCl-Puffer, pH 7,0) behandelt, um das Enzym zu adsorbieren. Es wurde mit der gleichen Pufferlösung, die 0.1 Mol KCl enthielt gewaschen und mit einem Gradient von 0,1 M—0,5 M KCl-Lösung eluiert
Die aktive Fraktion, die bei 0,36 M KCl eluiert worden war, wurde gesammelt und 10 Std. lang gegen die Lösung, von 1OmM tris-HCl-Puffer (pH 8,0) dialysiert und hierauf gefriergetrocknet wodurch pulverförmige Sarcosin-Oxidase erhalten wurde.
Gesamtaktivitäi: 540 Einheiten,
Protein, 43 mg,
spezifische Aktivität: 12,7 iL/mg,
Wiedergewinnung 38,6%.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Verfahren zur Gewinnung von Sarcosin-Oxidase durch Züchten von Mikroorganismen in einem Nährmediurr. und Isolieren der Sarcosin-Oxidase aus der Kulturmasse, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus den Stamm Bacillus sp. FERM BP-750 züchtet
    Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Sarcosin-Oxidase durch Züchten von Mikroorganismen in einem Nährmedium und Isolieren der Sarcosin-Oxidase aus der Kulturmasse.
    Sarcosin-Oxidase (EC 1.53.1. Sarcosin : Sauerstoffoxidoreductase (Demethylierung)) ist ein bekanntes Enzym, von dem man annimmt, daß es auf die folgende Reaktion einwirkt:
DE2842940A 1977-10-04 1978-10-02 Verfahren zur Gewinnung von Sarcosin-Oxidase Expired DE2842940C2 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP52119776A JPS6029473B2 (ja) 1977-10-04 1977-10-04 ザルコシン・オキシダ−ゼの製法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE2842940A1 DE2842940A1 (de) 1979-04-12
DE2842940C2 true DE2842940C2 (de) 1986-09-04

Family

ID=14769924

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE2842940A Expired DE2842940C2 (de) 1977-10-04 1978-10-02 Verfahren zur Gewinnung von Sarcosin-Oxidase

Country Status (12)

Country Link
US (1) US4216292A (de)
JP (1) JPS6029473B2 (de)
AT (1) AT364878B (de)
CA (1) CA1112192A (de)
CH (1) CH645668A5 (de)
DE (1) DE2842940C2 (de)
DK (1) DK146224C (de)
FR (1) FR2405299A1 (de)
GB (1) GB2005689B (de)
HU (1) HU180306B (de)
NL (1) NL7809943A (de)
SE (1) SE432265B (de)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS568687A (en) * 1979-07-04 1981-01-29 Toyo Jozo Co Ltd Preparation of creatinase
DE3326888A1 (de) * 1983-07-26 1985-02-14 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Sarcosin-oxidase
JPS61162174A (ja) * 1985-01-11 1986-07-22 Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho 耐熱性ザルコシン・オキシダ−ゼｎ及びその製造法
DE3519218A1 (de) * 1985-05-29 1986-12-04 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim H(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)o(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts)-bildende sarcosinoxidase, ihre herstellung und verwendung
JP2593481B2 (ja) * 1987-08-10 1997-03-26 旭化成工業株式会社 サルコシンオキシダーゼの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途
US5188941A (en) * 1988-02-12 1993-02-23 Gds Technology, Inc. Enzymatic determination of theophylline
FI903958A7 (fi) * 1988-02-12 1990-08-10 Gds Tech Inc Teofyliinin entsymaattinen määritys
US7229812B2 (en) 2002-11-13 2007-06-12 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Modified sarcosine oxidase, process for producing the same and reagent composition using the same
JP4405324B2 (ja) 2003-11-18 2010-01-27 キッコーマン株式会社 改変型ザルコシンオキシダーゼ、改変型ザルコシンオキシダーゼ遺伝子及び改変型ザルコシンオキシダーゼの製造法
WO2018052005A1 (ja) 2016-09-15 2018-03-22 キッコーマン株式会社 改変型ザルコシンオキシダーゼ並びにその遺伝子及び製造法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NICHTS-ERMITTELT

Also Published As

Publication number Publication date
FR2405299A1 (fr) 1979-05-04
DK146224C (da) 1984-01-16
JPS6029473B2 (ja) 1985-07-10
NL7809943A (nl) 1979-04-06
SE432265B (sv) 1984-03-26
CH645668A5 (de) 1984-10-15
US4216292A (en) 1980-08-05
GB2005689B (en) 1982-02-10
GB2005689A (en) 1979-04-25
SE7810355L (sv) 1979-04-05
CA1112192A (en) 1981-11-10
HU180306B (en) 1983-02-28
ATA712778A (de) 1981-04-15
DE2842940A1 (de) 1979-04-12
AT364878B (de) 1981-04-15
DK146224B (da) 1983-08-01
FR2405299B1 (de) 1984-06-22
JPS5452789A (en) 1979-04-25
DK436978A (da) 1979-04-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3686597T2 (de) Uricase und verfahren zu deren herstellung.
DE2911481C2 (de) Verfahren zur Herstellung einer Pyruvatoxidase
DE2716335C2 (de) Neue Cholinoxydase und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE2842940C2 (de) Verfahren zur Gewinnung von Sarcosin-Oxidase
DE2614114B2 (de) Verfahren zur Herstellung von Kreatininamidohydrolase
DE69110386T2 (de) Glukose Dehydrogenase und Verfahren zu deren Herstellung.
DE3603257A1 (de) Thermostabile bilirubin-oxidase und verfahren zur herstellung derselben
DE3600563C2 (de)
DE2153232C3 (de) Verfahren zur Herstellung einer Amylose
DE2924470C2 (de) Lactatoxidase und ihre Herstellung
DE3024915C2 (de)
DE3153683C2 (de)
DE4445084B4 (de) Neue Kreatinamidinohydrolase und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE2733273C3 (de) Endonucleasen und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE2637671C3 (de) Verfahren zur Herstellung von Kreatinin-Desimidase auf mikrobiologischem Wege
DE2164018A1 (de) Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Uricase
DE3116856C2 (de)
DE2920764A1 (de) Glycerindehydrogenase-praeparationen, ihre herstellung und verwendung
DE2746939A1 (de) Glucose isomerierendes enzym
DE3741198C2 (de)
DE3787776T2 (de) Pyruvat-Oxidase mit hoher thermischer Stabilität, diese verwendendes analytisches Verfahren und diese enthaltende analytische Reagenzien.
DE3689181T2 (de) Thermostabile Tryptophanase, Verfahren zu deren Herstellung und thermostabile Tryptophanase erzeugender Mikroorganismus.
DE2645548C3 (de) Endonucleasen und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE2107461A1 (de) Verfahren zum Herstellen von alkali schem Dextranase Enzym
DE2751879A1 (de) Cholinoxidase, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zur bestimmung von cholin

Legal Events

Date Code Title Description
8110 Request for examination paragraph 44
D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: ASAHI KASEI KOGYO K.K., OSAKA, JP

8328 Change in the person/name/address of the agent

Free format text: KRAUS, W., DIPL.-CHEM. DR.RER.NAT. WEISERT, A., DIPL.-ING. DR.-ING. SPIES, J., DIPL.-PHYS., PAT.-ANWAELTE NIELSEN, F., DR., RECHTSANW., 8000 MUENCHEN

8339 Ceased/non-payment of the annual fee