DE69110386T2

DE69110386T2 - Glukose Dehydrogenase und Verfahren zu deren Herstellung.

Info

Publication number: DE69110386T2
Application number: DE69110386T
Authority: DE
Inventors: Shigenori Emi; Michiyo Minami; Atsushi Sogabe; Yukihiro Sogabe
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1990-09-25
Filing date: 1991-09-20
Publication date: 1995-11-09
Anticipated expiration: 2011-09-21
Also published as: JP2850515B2; EP0477788A1; DE69110386D1; EP0477788B1; US5298411A; JPH04135487A

Description

Hintergrund der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Glucose- Dehydrogenase, die für die Glucosebestimmung in klinischen Labortests verwendbar ist, und auf ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Vorangetrieben durch die derzeitige Verbreitung klinischer Untersuchungen besteht eine große Nachfrage nach Glucose-Dehydrogenasen, die für die Glucosebestimmung verwendbar sind. Von den Gebieten klinischer Untersuchungen wird insbesondere auf dem Gebiet der Trockenchemie die Entwicklung einer Glucose-Dehydrogenase mit ausgezeichneter thermischer Stabilität gewünscht.
Zur Zeit verfügbare Glucose-Dehydrogenasen, die für klinische Untersuchungen verwendbar sind, sind die von der Gattung Bacillus abgeleitete Glucose-Dehydrogenase (EC1.1.1.47) und die von der Gattung Cryptococcus abgeleitete Glucose-Dehydrogenase (EC1.1.1.119). Erstere ist ein Enzym, das die Reaktion β-D-Glucose + NAD(P)&spplus; T D-δ-Gluconolacton + NAD(P)H + H&spplus; katalysiert, und letztere ist ein Enzym, das die Reaktion D-Glucose + NADP&spplus; T D-δ-Gluconolacton + NADPH + H&spplus; katalysiert. Für die Verwendung bei klinischen Untersuchungen ist die Glucose- Dehydrogenase (EC1.1.1.47), die sowohl NADP als auch NAD als Coenzym verwenden kann, gegenüber der Glucose-Dehydrogenase (EC1.1.1.119) vorzuziehen, welche ausschließlich NADP als Coenzym verwenden kann.
Jede zur Zeit auf dem Markt erhältliche Glucose-Dehydrogenase (EC1.1.1.47) ist jedoch hitzeinstabil, und die Entwicklung einer Glucose-Dehydrogenase mit größerer thermischer Stabilität als Enzym für klinische Untersuchungen, insbesondere für die Trockenchemie, ist wünschenswert.
Während man als Herkunft der konventionellen Glucose-Dehydrogenase (EC1.1.1.47) verschiedene Bakterien, wie die Gattung Bacillus, und Tierlebern (siehe Koso Handobukku, 9th ed., S. 19, Asakurashoten) kannte, ist keine von der Gattung Pseudomonas abgeleitete NAD(P)-abhängige Glucose-Dehydrogenase bekannt. Darüber hinaus ist die bekannte Glucose-Dehydrogenase, die von den Bakterien, die zur Gattung Pseudomonas gehören, erzeugt wird, eine NAD(P)-unabhängige Glucose-Dehydrogenase (EC1.1.99.a) [Methods in Enzymology, Vol. 9, 92-98 (1966), Agric. Biol. Chem. 44 (7), 1505-1512 (1980)], die im klinischen Bereich schwierig zu verwenden ist.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Es ist das Ziel der Erfindung, eine NAD(P)-abhängige Glucose- Dehydrogenase mit hoher thermischer Stabilität und ein Verfahren zu ihrer Herstellung bereitzustellen.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Figur 1 zeigt Beziehungen zwischen pH-Wert und Aktivität der Glucose-Dehydrogenase der Erfindung, wobei (6,0-8,0) Phosphatpuffer ist, (7,5-9,0) Tris/HCl-Puffer ist und (8,5-10,5) Carbonatpuffer ist
Figur 2 zeigt Beziehungen zwischen Temperatur und Aktivität.
Figur 3 zeigt Beziehungen zwischen pH-Wert und Aktivität nach 16stündiger Behandlung bei entsprechenen ph-Werten und 20ºC, wobei (4,0-6,0) Acetatpuffer ist, (6,0-8,0) Phosphatpuffer ist, (7,5-9,0) Tris/HCl-Puffer ist und 0 (8,5-10,5) Carbonatpuffer ist.
Figur 4 zeigt Beziehungen zwischen Temperatur und Aktivität nach 15minütiger Behandlung bei entsprechenen Temperaturen und ph 7,0.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt eine von der Gattung Pseudomonas abgeleitete Glucose-Dehydrogenase, die die folgende Reaktion katalysiert, sowie ein Verfahren zur Herstellung der Glucose- Dehydrogenase, umfassend die Kultur eines zur Gattung Pseudomonas gehörenden Bakteriums, das die Glucose-Dehydrogenase, die die folgende Reaktion katalysiert, produzieren kann, und Ernten der Glucose-Dehydrogenase aus der Kultur, bereit.
β-D-Glucose + NAD(P)&spplus; T D-δ-Gluconolacton + NAD(P)H + H&spplus;
Jeder zur Gattung Pseudomonas gehörende Stamm kann in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wobei dem Stamm Pseudomonas sp. FH1227, der zur Gattung Pseudomonas gehört und von den Erfindern aus dem Boden in Tsuruga-shi, Fukui, Japan, gewonnen wurde, der Vorzug gegeben wird.
Die mycologischen Eigenschaften des oben genannten Stammes Pseudomonas sp. FH1227 sind wie folgt.

I. Morphologische Eigenschaften

Es handelt sich um ein Stäbchen, das nach 20stündiger Kultur bei 30ºC in Nähragar-Medium eine Größe von 2,5 x 0,7 hat, Gramnegativ ist und Motilität besitzt.

II. Wachstum in verschiedenen Medien

(1) Nähragar-Plattenkultur

Es bildet eine runde Kolonie mit einem Durchmeser von 1-3 mm nach 24 Stunden Kultur bei 30ºC. Die Oberfläche ist glatt und glänzend, die Erhebung ist dünn und flachrund, die Kolonie ist homogen, undurchsichtig und blaßfleischfarben und bildet keinen löslichen Farbstoff oder fluoreszierenden Farbstoff.

(2) Nähragar-Schrägkultur

Es wächst gut auf der Vorderseite der Schräge nach 24 Stunden Kultur bei 30ºC. Die Zellen sind blaßfleischfarben.

(3) Nährstoff-Flüssigkultur

Es wächst gut nach 16 Stunden Schüttelkultur bei 30ºC, wächst jedoch nur wenig bei stehender Kultur.

(4) Nähragar-Steckkultur

Es wächst nach 24 Stunden Kultur bei 30ºC gut im oberen Agar, wächst in der Tiefe jedoch schlecht.

(5) Wachstumstemperatur

Es wächst bei Schüttelkultur in Nährstoff-Flüssigmedium bei einer Temperatur zwischen 25ºC bis 42ºC, wobei das beste Wachstum bei etwa 37ºC erfolgt.

(6) Wachstums-pH

Es zeigt bei Schüttelkultur in Nährstoff-Flüssigmedium ein gutes Wachstum bei einem ph-Wert zwischen 6 und 8.

III. Physiologische Eigenschaften

(1) Nitratreduktion positiv
(2) Denitrifizierung negativ
(3) β-Galactosidase negativ
(4) Arginin-Dihydratase negativ
(5) Lysin-Decarboxylase negativ
(6) Ornithin-Decarboxylase negativ
(7) Citrat-Nutzung negativ
(8) Schwefelwasserstofferzeugung negativ
(9) Urease negativ
(10) Tryptophan-Desaminase negativ
(11) VP-Test positiv
(12) Gelatineabbau positiv
(13) OF-Test nichtfermentativ
(14) Katalase positiv
(15) Oxidase negativ
(16) Säurebildung aus Zucker keine Bildung aus Glucose, Mannit, Inosit, D-Sorbitoinosit, D-Sorbit, L-Rhamnose, Saccharose, D-Melibiose und D-Amygdalin; Bildung aus L-Arabinose
(17) Farbstoffbildung keine Bildung eines löslichen Farbstoffs oder fluoreszierenden Farbstoffs
(18) gegen Sauerstoff aerob
(19) Tween-Zersetzung negativ
(20) Vitamin- oder Aminosäurebedarf kein besonderer Bedarf
Die experimentellen Verfahren zur Identifizierung der oben genannten mycologischen Eigenschaften waren im Einklang mit Biseibutsu no Bunrui to Doutei, herausgegeben und authorisiert von Takeharu Hasegawa, Gakkai Shuppan Center (1975). Die Standards für die Klassifizierung und Identifizierung wurden in Anlehnung an Bargey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 1 (1984), verwendet.
Aufgrund der obigen Literaturstellen und verschiedenen der beschriebenen mycologischen Eigenschaften ist anzunehmen, daß der Stamm FH1227 zur Gattung Pseudomonas gehört. Außerdem stimmt der Stamm FH1227 bis auf die Farbstoffbildung gut mit Pseudomonas viridiflava überein. Der vorliegende Stamm wurde daher Pseudomonas sp. FH1227 genannt und beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, unter der Zugriffsnummer 11618 hinterlegt.
In der vorliegenden Erfindung kann jedes gewöhnlich eingesetzte Nährmedium verwendet werden. Als Kohlenstoffquellen werden verschiedene Monosaccharide einschließlich Glucose und verschiedene organische Säuren, wie Bernsteinsäure und Äpfelsäure, verwendet. Als natürliche Nährstoffquellen werden Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt usw. verwendet, und als Stickstoffquellen können anorganische Stickstoffquellen, wie Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid, verwendet werden.
Als anorganische Salze seien Kaliumphosphat, Kaliumchlorid, Natriumchlorid und Magnesiumsulfat erwähnt. Diese Nährstoffquellen können allein oder in Kombination verwendet werden.
Der Stamm kann normal durch Schüttelkultur oder Hohlrührerkultur kultiviert werden. Im allgemeinen liegt die Kulturtemperatur vorzugsweise im Bereich von 25ºC bis 37ºC, und der pH-Wert des Mediums liegt vorzugsweise im Bereich von 5,5-7,5. Im allgemeinen wird bei 18 bis 24 Stunden Kultur Glucose-Dehydrogenase (EC1.1.1.47) in den Zellen erzeugt und angereichert. Die Kulturbedingungen sind natürlich solche, die gemäß den zu verwendenden Stämmen und Mediumzusammensetzungen eine maximale Erzeugung der Glucose-Dehydrogenase (EC1.1.1.47) erlauben. Beim Ernten der gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugten und angereicherten Glucose-Dehydrogenase (EC1.1.1.47) werden die Zellen durch Zentrifugieren und Filtrieren der Kultur gewonnen und durch Kugelzerkleinerung, Ultraschallzerkleinerung, Behandlung mit lytischem Enzym oder dergleichen zerkleinert. Es ist wünschenswert, daß gemäß dem zu verwendenden Stamm das wirksamste Extraktionsverfahren verwendet wird. Die Glucose-Dehydrogenase (EC1.1.1.47) kann nach einem üblicherweise zur Enzymreinigung verwendeten Verfahren aus der so erhaltenen Rohenzymlösung abgetrennt werden. Beispiele für solche Verfahren sind die Behandlung mit Polyethylenimin, die isoelektrische Fällung durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat, die Ionenaustauschchromatographie, die Gelfiltration, die hydrophobe Chromatographie usw., die auch in Kombination verwendet werden können. Zum Beispiel wird eine Rohenzymlösung zentrifugiert, so daß ein überstand entsteht. Dazu gibt man Polyethylenimin, wodurch man die Nucleinsäure entfernt, und ein Überstand wird erhalten. Die mit Ammoniumsulfat ausgesalzene Fraktion (Sättigung 0,5-0,7) wird aus dem Überstand erhalten. Die Fraktion wird durch Gelfiltration mit Sephadex G-25 entsalzt und konzentriert, woraufhin sie auf Ionenaustauscher DEAE/Sepharose CL 4B adsorbiert und eluiert wird. Die aktive Fraktion wird auf Phenyl Toyopearl 650M adsorbiert und eluiert. Die aktive Fraktion wird durch Gelfiltration mit Sephadex G-25 entsalzt, und die aktive Fraktion wird gewonnen, wobei hochgereinigte Glucose-Dehydrogenase (EC1.1.1.47) gewonnen wird.
Beispiele für physikochemische Eigenschaften der Glucose-Dehydrogenase der Erfindung sind wie folgt.

(1) Wirkung

Das Enzym der Erfindung erzeugt aus 1 mol β-D-Glucose und 1 mol NAD(P) 1 mol D-δ-Gluconolacton und 1 mol NAD(P)H&spplus;.

(2) Substratspezifität

Wie in Tabelle 1 unten gezeigt, wirkt das Enzym der Erfindung spezifisch auf β-D-Glucose und 2-Desoxyglucose. Tabelle 1 Substrat (100 mM) relative Aktivität (%) β-D-Glucose L-Glucose Xylose 2-Desoxyglucose L-Sorbose D-Mannose D-Fructose D-Galactose D-Lactose D-Sorbit D-Mannit Saccharose Inosit Maltose

(3) pH-Optimum

Das Enzym der Erfindung zeigt hohe Aktivität im pH-Bereich von 8,5-9,0, wie in Figur 1 gezeigt.

(4) Temperaturoptimum

Das Temperaturoptimum des Enzyms der Erfindung beträgt 55ºC, wie in Figur 2 gezeigt.

(5) pH-Stabilität

Die ph-Stabilität nach 16stündiger Behandlung des Enzyms der Erfindung bei 20ºC und verschiedenen ph-Werten ist in Figur 3 dargestellt. Wie man daraus erkennt, ist das Enzym der Erfindung im pH-Bereich von 6,0-7,5 stabil.

(6) thermische Stabilität

Die thermische Stabilität nach 15minütiger Behandlung bei ph 7,0 und verschiedenen Temperaturen ist in Figur 4 dargestellt. Wie man daraus erkennt, ist das Enzym der Erfindung bis zu 50ºC stabil.

(7) Inhibitor

Wie in Tabelle 2 unten gezeigt, wurde das Enzym der Erfindung durch Silbernitrat, Quecksilberchlorid und Monoiodacetat gehemmt. Tabelle 2 Inhibitor Konzentration relative Aktivität (%) nicht zugegeben Silbernitrat Quecksilberchlorid Monoiodacetat

(8) Km-Wert

Der Km-Wert des Enzyms der Erfindung in bezug auf β-D-Glucose beträgt entweder 1,38 x 10&supmin;² M (Coenzym NAD) oder 1,25 x 10&supmin;² M (Coenzym NADP), und der Km-Wert in bezug auf das Coenzym beträgt 3,08 x 10&supmin;&sup4; M (NAD) bzw. 4,07 x 10&supmin;&sup5; M (NADP).

(9) Molekulargewicht

Das Enzym der Erfindung hat ein anhand der Gelfiltration unter Verwendung von TSK-Gel G3000SW bestimmtes Molekulargewicht von etwa 101 000.

(10) Isoelektrischer Punkt

Der anhand der isoelektrischen Ampholytfokussierung bestimmte isoelektrische Punkt des Enzyms der Erfindung beträgt etwa 4,5.

(11) Bestimmung der Enzymaktivität

Die Enzymaktivität wurde bestimmt, indem man die Enzymaktivität, bei der unter den unten genannten Bedingungen 1 umol NADH pro Minute erzeugt wird, als 1 Einheit nimmt.

Reagens:

(A) 0,1 M Tris/HCl-Puffer, pH 8,0
(B) 1,5 M D-Glucose-Lösung (hergestellt durch Auflösen von 27,02 g D-Glucose in 100 ml destilliertem Wasser)
(C) 80 mg/ml NAD-Lösung (hergestellt durch Auflösen von 80 mg NAD-Trihydrat in 1 ml destilliertem Wasser, das hergestellt werden soll, wenn es in Verwendung ist)
(D) Enzymlösung (hergestellt durch Verdünnen eines Standardenzyms auf 0,8-1,2 E/ml mit zuvor eisgekühltem 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0)

Verfahren:

1. Das folgende Reaktionsgemisch wird in einer Küvette (d = 1 cm) hergestellt und etwa 5 Minuten auf 37ºC vorgewärmt.
(A) Lösung 2,6 ml
(B) Lösung 0,3 ml
(C) Lösung 0,1 ml
2. Eine Enzymlösung (0,05 ml) wird hinzugegeben, und das Gemisch wird leicht gerührt. Die Änderung der Extinktion bei 340 nm wird unter Verwendung eines auf 37ºC geregelten Spektrophotometers mit Wasser als Kontrolle 5 Minuten lang aufgezeichnet. Die Änderung der Extinktion pro 1 Minute wird auf der Basis des linearen Teils von Minute 2 bis Minute 5 abgeschätzt (ΔOD,test).
3. Die Blindprobe wird durchgeführt, indem man dasselbe Verfahren wie oben befolgt, außer daß 0,05 ml einer verdünnten Enzymlösung (mit Phosphatpuffer, ph 7,0) anstelle der Enzymlösung verwendet werden, um die Änderung der Extinktion pro 1 Minute abzuschätzen (ΔOD,blind).

Berechnungsgleichung:

E/ml = ΔOD/min (ΔOD,test - ΔOD,blind) x 3,05 x Verdünnung/6,22 x 1,0 x 0,05
= ΔOD/min x 9,807 x Verdünnung
6,22 = Millimol-molarer Extinktionskoeffizient von NADH (cm²/uM)
1,0 = Länge des Lichtweges (cm)
Im folgenden wird die Glucose-Dehydrogenase der Erfindung anhand von Beispielen erläutert. "%" bedeutet Gew.-% (w/v), wenn nichts anderes angegeben ist.

Beispiel 1

Zusammensetzung von Medium A

1,0% Glucose, 0,3% Hefeextrakt, 0,3% Polypepton, 0,3% Fleischextrakt, 0,1% KH&sub2;PO&sub4;, 0,22% K&sub2;HPO&sub4;, 0,05% MgSO&sub4; 7H&sub2;O, pH 7,0

Zusammensetzung von Medium B

1,0% DL-Äpfelsäure, 1,0% Hefeextrakt, 0,3% Polypepton, 0,2% Fleischextrakt, 0,1% KH&sub2;PO&sub4;, 0,22% K&sub2;HPO&sub4;, 0,2% Nacl, 0,05% MgSO&sub4; 7H&sub2;O, pH 6,0
Das obige Medium A (100 ml) wurde in einen 500-ml-Sakaguchi- Kolben gegeben und 15 Minuten in einem Autoklaven bei 121ºC sterilisiert. Mit einer Platinöse mit Pseudomonas sp. FH1227 (FERM BP-11618) wurde das obige Medium A beimpft und 24 Stunden einer Schüttelkultur bei 30ºC unterworfen, die als Stammkultur verwendet wurde. In einem 10-l-Flaschenfermenter wurde Medium B (6 l), das unter denselben Bedingungen sterilisiert worden war, mit der Stammkultur (60 ml) beimpft, dann wurde 18 Stunden bei 480 U/min, Luftzutritt 2 l/min, 30ºC und pH-Regulierung auf 7,5 kultiviert. Die Glucose-Dehydrogenase-(EC1.1.1.47)-Aktivität der erhaltenen Kultur betrug 1,2 E/ml. Die Kultur (6 l) wurde zentrifugiert, und die Zellen wurden aufgefangen und in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert. Die Suspension (1 l) wurde mit einem French-Press-Disintegrator (Minilabo, Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) zerkleinert. Zu der Lösung, die die zerkleinerten Zellen enthielt, gab man Polyethylenimin und 0,1 M NaCl mit einer Endkonzentration von 0,12%, und das Gemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur leicht gerührt und stehengelassen. Das Gemisch wurde unter Bildung eines Überstands zentrifugiert, zu dem Ammoniumsulfat in einer solchen Menge gegeben wurde, daß eine Sättigung des Uberstandes von 0,5 erreicht wurde, und das Gemisch wurde unter Bildung eines Überstands zentrifugiert. Zu dem Überstand gab man Ammoniumsulfat, so daß eine Sättigung des Überstandes von 0,7 erreicht wurde, welcher dann unter Bildung eines Niederschlags zentrifugiert wurde. Der Niederschlag wurde in 140 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) wieder aufgelöst. Die wiederaufgelöste Lösung wurde mit einer Säule mit Sephadex G-25 (1,5 l), die mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) äquilibriert war, entsalzt. Die entsalzte Lösung wurde auf einer Säule mit DEAE- Sepharose CL-4B (50 ml) adsorbiert und mit einem NaCl-Gradienten (0-0,3 M) eluiert. Ammoniumsulfat wurde hinzugefügt, so daß eine Sättigung des Eluats von 0,4 erreicht wurde, und die unlösliche Substanz wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, was einen Überstand ergab, der dann auf 10 ml Phenyl Toyopearl 650M, das mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) äquilibriert war und Ammoniumsulfat enthielt (bis zu einer Sättigung von 0,4 zugegeben), adsorbiert und mit einem Ammoniumsulfatgradienten (Sättigung 0,4-0) und einem Ethylenglycolgradienten (0-10%) eluiert wurde. Das Eluat wurde durch Ultrafiltration konzentriert und mit einer Säule mit Sephadex G-25 (100 ml), die mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) äquilibriert war, entsalzt, was eine aktive Fraktion ergab. Die relative Aktivität der aktiven Fraktion betrug etwa 120 E/mg Protein. Die physicochemischen Eigenschaften der so erhaltenen Glucose-Dehydrogenase waren so, wie es oben erwähnt ist.
Die Glucose-Dehydrogenase gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein NAD(P)-abhängiges, von der Gattung Pseudomonas erhaltenes Enzym, das bis 50ºC hitzestabil ist und sowohl die Verwendung von NAD als auch von NADP als Coenzym erlaubt und sich als Enzym für die klinische Verwendung eignet.

Claims

1. Glucose-Dehydrogenase, abgeleitet von dem Genus Pseudomonas, die die folgende Reaktion katalysiert:

β-D-Glucose + NAD(P)&spplus; T D-δ-Gluconolacton + NAD(P)H + H&spplus;

2. Glucose-Dehydrogenase nach Anspruch 1, die nach 15 min Behandlung bei 50 ºC wenigstens 90 % Rest-Aktivität behält.

3. Verfahren zur Erzeugung einer Glucose-Dehydrogenase, umfassend die Kultur eines die Glucose-Dehydrogenase, die die folgende Reaktion katalysiert, produzierenden, zu dem Genus Pseudomonas gehörenden Bakteriums und Ernten der Glucose-Dehydrogenase aus der Kultur:

β-D-Glucose + NAD(P)&spplus; T D-δ-Gluconolacton + NAD(P)H + H&spplus;.

4. Verfahren zur Erzeugung einer Glucose-Dehydrogenase nach Anspruch 3, worin das die Glucose produzierende Bakterium Pseudomonas Sp. Stamm FH1227 (FERM BP-11618) ist.