DE3714544C2 - Glucosedehydrogenase und Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Glucosedehydrogenase mit hoher Reak­ tivität und Substratspezifität gegenüber Glucose und ein Verfahren zu deren Herstellung.

Glucosedehydrogenase ist ein Enzym, welches die Reaktion:

β-D-Glucose + NADP⁺ → D-Glucono-δ-lacton + NADPH + H⁺

katalysiert.

Im Feld der klinischen Chemie wird seit kurzem die quanti­ tative Bestimmung von Glucose in Probematerial angewandt, wobei man sich der obengenannten enzymatischen Reaktion be­ dient. Der Bedarf nach Glucosedehydrogenase ist deshalb an­ steigend.

Bis jetzt ist ein Verfahren zur Herstellung von Glucosede­ hydrogenase durch Mikroorganismen, z. B. Bacillus megaterium (ungeprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 58-201985), Bacillus cereus (ungeprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 57-16693) und Acetobacter, Acinetobacter, Gluconobacter oder Pseudomonas (ungeprüfte japanische Patentanmeldung Nr. 59- 25700) bekannt. Diese Verfahren haben allerdings einige Nachteile. Zum Beispiel ist die Substratspezifität der Glucosedehydrogenase aus Gluconobacter so weitgestreut, daß der Vergleichsaktivitätswert gegenüber 2-Deoxyglucose 227 und gegenüber Mannosamin 95 beträgt, im Vergleich zu Glucose mit einem Wert von 100 (Enzym Handbuch, S. 43, Asa­ kura Pub. Co., Tokyo, 1983).

Es ist die Aufgabe der Erfindung, eine neuartige Glucosede­ hydrogenase mit hoher Reaktivität und Substratspezifität gegenüber Glucose sowie ein Verfahren zu deren Herstellung bereitzustellen.

Die Erfindung betrifft Glucosedehydrogenase, gekennzeichnet durch folgende biochemische Eigenschaften:

• (1) Enzymwirkung:
  Katalyse der Reaktion, bei welcher aus Glucose und NADP Glucono-δ-lacton und reduziertes NADP entsteht,
• (2) Substratspezifität:
  Spezifität gegenüber Glucose ohne Substratspezifität gegenüber 2-Deoxyglucose,
• (3) ein pH-Optimum von pH 6 bis 8,
• (4) ein Temperaturoptimum von etwa 55°C,
• (5) eine pH-Stabilität im Bereich von pH 6,0 bis 7,5,
• (6) ein Molekulargewicht von 11 × 10⁴ ± 11 000,
• (7) eine Michaelis-Konstante Km von
  2,6 × 10^-3 ± 2,6 × 10^-4M bezüglich Glucose und
  4,2 × 10^-6 ± 4,2 × 10^-7M bezüglich NADP sowie
• (8) einen isoelektrischen Punkt von 4,9 ± 0,5.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstel­ lung der Glucosedehydrogenase nach Anspruch 1, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Cryptococcus uniguttulatus FERM BP-1352 in einem Nährmedium züchtet und die dabei entstehen­ de Glucosedehydrogenase aus dem Kulturmedium isoliert.

Die taxonomischen Eigenschaften des obengenannten Stammes sind:

• 1. Wachstum auf verschiedenen Medien:
  • (1) YM-Flüssigmedium:
    Nach 3tägiger Züchtung bei 25°C entstehen vegetati­ ve Hyphen von kugeliger bis elliptischer Form von 2∼5 × 4∼5 µm. Das Wachstum besteht in multi­ polarem Keimen. Es entsteht eine weiße pulverige Fällung. Vom fünften Tag der Züchtung an bildet sich eine ringförmige Haut.
  • (2) YM-Agarmedium:
    Rundkolonie mit vollständig ausgebildetem Rand, mit konvexen Ausbauchungen, glatter Oberfläche, glänzen­ dem Aussehen, butterartiger Konsistenz und weißer Farbe.
  • (3) Ausstrichkultur auf Kartoffelextrakt-Agarmedium:
    Keine Ausbildung von Pseudomycel.
• 2. Ausbildung von Ascosporen: -
• 3. Ausbildung von Ballistosporen: -
• 4. Physiologische Eigenschaften:
  • (1) Optimale Wachstumsbedingung:
    pH 5∼9, bei 24∼30°C.
  • (2) Wachstumsbereich:
    pH 4,5∼11,5, bei 19∼33°C.
  • (3) Assimilation von Nitrat: -
  • (4) Fettabbau: -
  • (5) Harnstoffabbau: +
  • (6) Gelatineverflüssigung: -
  • (7) Osmophilie oder Osmotoleranz: -
  • (8) Carotinbildung: -
  • (9) Bildung organischer Säure: -
  • (10) Bildung von stärkeähnlicher Substanz: -
  • (11) Wachstum auf vitaminfreiem Medium: + W.
• 5. Nutzung von Kohlenstoffquellen:
  Fermentativ:
  D-Glucose: -
  D-Galactose: -
  Maltose: -
  Sucrose: -
  Lactose: -
  Raffinose: -
  Assimilationsfähigkeit:
  D-Arabinose: + S
  L-Arabinose: +
  D-Ribose: +
  D-Xylose: + W
  D-Glucose: +
  D-Mannose: -
  D-Galactose: -
  D-Rhamnose: +
  D-Fructose: -
  L-Sorbose: -
  Maltose: +
  Sucrose: +
  Lactose: -
  Melibiose: -
  Cellobiose: -
  Trehalose: +
  Raffinose: +
  Melezitose: +
  α-Methyl-D-glucosid: +
  Arbutin: +
  Dextrin: -
  lösliche Stärke: + W
  Inulin: + W
  Ethanol: ±
  Adonit: ±
  Erythrit: -
  Inosit: +
  D-Mannit: +
  D-Sorbit: +
  Dulcit: -
  D-Gluconat: -
  Glycerin: -
  2-Keto-D-gluconat: +
  DL-Lactat: -
  Succinat: -
  Citrat: -

Ein vorstehend beschriebener Mikroorganismus aus der Gruppe der Hefen wurde aus Bodenproben isoliert, welche Schweine­ gehegen bei Ohito-cho, Tagata-gun, Shizuoka-ken, Japan ent­ nommen wurden. Die genannten Mikroorganismen zeigen multi­ polares Keimwachstum und bilden keine Ascosporen, Ballisto­ sporen und Pseudohyphen. Inosit wird assimiliert. Aufgrund dieser Charakteristik gehört der Mikroorganismus zur Art Cryptococcus. Aufgrund der physiologischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Mikroorganismus, nämlich des Assimi­ lationsmusters gegenüber Kohlenstoffquellen, fehlender Assimilation von Nitrat, Vitaminbedarf und Ausbleiben des Wachstums bei 37°C, ist dies ein Stamm von Cryptococcus uniguttulatus und wurde als Cryptococcus uniguttulatus Y 0033 bezeichnet. Dieser Stamm wurde in der permanenten Kultursammlung des Fermentation Research Institute depo­ niert und mit der Bezeichnung FERM BP-1352 versehen.

Die erfindungsgemäße Glucosedehydrogenase kann nach üblichen Enzymherstellungsverfahren unter Verwendung von Hefekultur hergestellt werden. Ein Medium wird mit Hefe inokuliert und im Submers-Belüftungsverfahren bebrütet.

Es werden die für Mikroorganismen-Züchtung üblichen Nähr­ stoffquellen verwendet. Dabei handelt es sich um assimilier­ bare Stickstoffquellen, wie Mais-Aufguß, Sojamehl, Casein­ hydrolysat, Pepton, Hefeextrakt und Fleischextrakt. Bevor­ zugte Kohlenstoffquellen bestehen aus assimilierbaren Koh­ lenstoffquellen, z. B. Kohlehydraten, wie Glucose, Maltose, Sucrose und Lactose, sowie Dextrin, Stärke, Melasse oder ähnlichen.

Die Bebrütungstemperatur hängt ab vom Wachstum der Mikro­ organismen und von der Glucosedehydrogenase-Bildung und variiert von 25∼37°C, wobei etwa 30°C bevorzugt sind. Die Bebrütungszeit hängt von den Bedingungen ab und beträgt ge­ wöhnlich 20 bis 50 Stunden. Die Züchtung sollte beendet werden, wenn der Zustand maximaler Enzymproduktion vorliegt.

Die Glucosedehydrogenase wird aus dem so erhaltenen Kultur­ medium isoliert. Beispielsweise wird die Enzymisolierung vorgenommen durch Behandlung des Kulturmediums über Filtra­ tion oder Zentrifugierung, wobei das Mycel abgetrennt wird. Das isolierte Mycel wird dann mittels Ultraschall, Französi­ scher Presse (French press) oder mechanischem Aufschluß mit Glaskugeln behandelt oder wird mit einem organischen Lösungsmittel autolysiert, wobei eine Roh-Glucosedehydroge­ nase-Lösung erhalten wird. Die Roh-Enzymlösung wird 10 bis 30 min auf 50°C erhitzt und unmittelbar danach zur Abtren­ nung der überstehenden Lösung zentrifugiert. Eine weitere Reinigung kann durch Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung von DEAE-Cellulose, DEAE-Sephadex A-25, DEAE- Sepharose, CM-Cellulose, CM-Sephadex C-25 oder CM-Sepharose CL-6B und anschließender Behandlung durch Chromatographie an Hydroxylapatit erreicht werden. Gegebenenfalls wird lyophilisiert, um das gereinigte Glucosedehydrogenasepul­ ver zu erhalten.

Das folgende, nicht einschränkende Beispiel veranschau­ licht die Erfindung.

Beispiel Herstellung von Glucosedehydrogenase durch Züchtung von Cryptococcus uniguttulatus Y 0033

(i) 100 ml eines wäßrigen Mediums, enthaltend 0,5% Hefe­ extraktpulver, 1,0% Fleischextrakt, 1,0% Glucose, 0,15% KH₂PO₄, 0,033% CaCl₂·2H₂O, 0,05% MgSO₄·7H₂O und 0,2% NaCl wurden in einem Erlenmeyer-Kolben mit einer Öse voll Cryptococcus uniguttulatus Y 0033 FERM BP-1352 beimpft. Das Gemisch wurde unter Schütteln 50 h bei 30°C bebrütet. Die Kulturbrühe wurde 10 min bei 4500 Upm zentrifugiert und dabei das Mycel erhalten. Das in 10 mM Phosphatpuffer­ lösung (pH 7,0, 10 ml) suspendierte Mycel wurde in einem Brown-Homogenisator aufgeschlossen und 10 min bei 15 000 Upm zentrifugiert, um Mycelrückstände zu entfernen. Es wur­ den 10 ml einer überstehenden Lösung (0,6 Einheiten/ml) er­ halten.

(ii) 100 ml eines wäßrigen Mediums, enthaltend 0,5% Hefe­ extraktpulver, 1,0% Casein-Säurehydrolysat, 2,0% Sucrose, 0,15% KH₂PO₄, 0,033% CaCl₂·2H₂O, 0,05% MgSO₄·7H₂O und 0,2% NaCl wurden in einem Erlenmeyer-Kolben mit einer Öse voll Cryptococcus uniguttulatus Y 0033 FERM BP-1352 beimpft. Das Gemisch wurde 50 h unter Schütteln bei 30°C bebrütet. Die Kulturbrühe wurde in derselben Weise, wie unter (i) vorstehend beschrieben, behandelt. Dabei wurden 10 ml Roh- Enzymlösung (14 Einheiten/ml) erhalten.

(iii) 100 ml eines wäßrigen Mediums, enthaltend 0,5% Hefe, 1,0% Thunfischextrakt, 1,0% Maltose, 0,15% KH₂PO₄, 0,033% CaCl₂·2H₂O, 0,05% MgSO₄·7H₂O und 0,2% NaCl wurden in einem Erlenmeyer-Kolben mit einer Öse voll Cryptococcus uniguttu­ latus Y 0033 FERM BP-1352 beimpft. Das Gemisch wurde 50 h bei 30°C unter Schütteln bebrütet. Die Kulturbrühe wur­ de in derselben Weise, wie vorstehend unter (i) beschrieben, behandelt. Dabei wurden 10 ml Roh-Enzymlösung (6 Einheiten/ml) erhalten.

(iv) 150 ml Roh-Enzymlösung aus 1050 ml Kulturbrühe, erhal­ ten wie vorstehend in (ii) beschrieben, wurden 15 min auf 50°C erhitzt und 10 min bei 4500 Upm zentrifugiert. Die so erhaltene überstehende Lösung wurde durch eine DEAE-Sepha­ rose CL-6B-Säule von 4,8 × 4 cm zur Adsorption des Enzyms geschickt und mit je 100 ml 0,1 M KCl, 0,2 M KCl und 0,3 M KCl eluiert. Die Glucosedehydrogenase eluierte beim Stand von 75 ml 0,3 M KCl. Die Enzymlösung wurde zur Entsalzung mit Diaflow-Membranfiltermaterial (Amicon Co.) behandelt und an einer Hydroxylapatit-Säule von 4,8 × 1 cm (Sigma Chem. Co.) adsorbiert. Die Elution wurde mit je 50 ml 0,1 M-, 0,2 M- und 0,3 M Phosphatpufferlösung von pH 7,0 vorgenommen. Die Glucosedehydrogenase eluierte beim Stand von 20 ml 0,3 M Phosphatpufferlösung. Es würden 20 ml Enzymlösung (23,6 Einheiten/ml) erhalten.

Die erhaltene Glucosedehydrogenase hat folgende Eigenschaf­ ten.

• (1) Enzymwirkung:
  Katalyse der Reaktion von Glucose und NADP zu Glucono- δ-lacton und reduziertem NADP gemäß folgender Gleichung:
• (2) pH-Stabilität:
  Gemessen wird die Enzymaktivität (1 Einheit/ml, 40 mM Pufferlösung) nach 10minütiger Behandlung bei 53°C. Wie Fig. 1 zeigt, ist das Enzym bei pH 6,0 bis 7,0 stabil.
  Figuren-Legende: ○-○: Dimethylglutarat-Pufferlösung,
  ⚫-⚫: Phosphat-Pufferlösung,
  ∆-∆: Tris-HCl-Puffer.(Die Symbole werden in allen folgenden Figuren beibehalten, sofern nicht anders angegeben).
• (3) pH-Optimum:
  pH 6 bis 8 (siehe Fig. 2).
  Figuren-Legende: ▲-▲: Acetat-Pufferlösung
• (4) Hitzestabilität:
  Es wird die Enzym-Restaktivität nach 10minütiger Be­ handlung bei verschiedenen Temperaturen gemessen (1 Ein­ heit/ml, 40 mM Phosphat-Pufferlösung, pH 6,0). Wie in Fig. 3 gezeigt, ist das Enzym bis 50°C stabil.
• (5) Temperaturoptimum:
  gemäß Fig. 4 etwa 55°C.
• (6) Molekulargewicht:
  11 × 10⁴ ± 11 000 (gemessen an superfeinem Sephacryl- S-200).
• (7) Isoelektrischer Punkt:
  pH 4,9 ± 0,5.
• (8) Michaelis-Konstante (Km):
  2,6 × 10^-3 ± 2,6 × 10^-4M (Glucose)
  4,6 × 10^-6 ± 4,6 × 10^-7M (NADP)
  (gemessen in Tris-HCl-Pufferlösung, pH 7,5).
• (9) Wirkung von Metallionen und oberflächenaktiven Stoffen:
  siehe Tabelle I.
• (10) Substratspezifität:
  siehe Tabelle 11 (50 mM Substrat, 0,005 Enzymeinhei­ ten, 10 min).

Enzymaktivität und Restaktivität werden nach folgender Test­ methode ermittelt.

Testmethode
0,2 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5)|0,4 ml
10 mM NADP	0,05 ml
10% Triton X-100	0,01 ml
0,5 M Glucose	0,1 ml
Destilliertes Wasser	0,44 ml
	1,0 ml

Das vorstehend beschriebene Reaktionsgemisch (1,0 ml) wird 2 bis 3 min bei 37°C vorinkubiert. Dazu werden 20 µl Enzym­ lösung gegeben und 10 min bei 37°C inkubiert. Es wird die optische Dichte bei 340 nm gemessen.

Eine Einheit wird definiert als die Enzymmenge, welche in 1 min 1 µMol reduziertes NADP erzeugt.

Tabelle I

Tabelle II

Wie vorstehend gezeigt, liefert die Erfindung eine neuar­ tige Glucosedehydrogenase sowie ein Verfahren zu deren Her­ stellung.

Beim Vergleich der neuartigen Glucosedehydrogenase mit ei­ nem bereits bekannten Enzym, wie aus Bacillus cereus erhal­ ten (Methods in Enzymology, Bd. 9, S. 109), fällt der Km- Wert des erfindungsgemäßen Enzyms sehr niedrig aus (2,6 × 10^-3M), während der des bekannten Enzyms demgegenüber höher ist (2 × 10^-2M). Das bedeutet, daß das erfindungsgemäße En­ zym etwa zehnmal aktiver ist als das bekannte Enzym. Damit hat die erfindungsgemäße Glucosedehydrogenase wesentlich bessere Eigenschaften.

4. Kurze Erklärung der Zeichnungen

Fig. 1: pH-Stabilität von Glucosedehydrogenase,

Fig. 2: pH-Optimum von Glucosedehydrogenase,

Fig. 3: Hitzestabilität von Glucosedehydrogenase und

Fig. 4: Temperaturoptimum von Glucosedehydrogenase.

Claims (2)

1. Glucosedehydrogenase, gekennzeichnet durch folgende biochemische Eigenschaften:

• (1) Enzymwirkung:
  Katalyse der Reaktion, bei welcher aus Glucose und NADP Glucono-δ-lacton und reduziertes NADP ent­ steht,
• (2) Substratspezifität:
  Spezifität gegenüber Glucose ohne Substratspezifi­ tät gegenüber 2-Deoxyglucose,
• (3) ein pH-Optimum von pH 6 bis 8,
• (4) ein Temperaturoptimum von etwa 55°C,
• (5) eine pH-Stabilität im Bereich von pH 6,0 bis 7,5,
• (6) ein Molekulargewicht von 11 × 10⁴ ± 11 000,
• (7) eine Michaelis-Konstante Km von
  2,6 × 10^-3 ± 2,6 × 10^-4M bezüglich Glucose und
  4,2 × 10^-6 ± 4,2 × 10^-7M bezüglich NADP sowie
• (8) einen isoelektrischen Punkt von 4,9 ± 0,5.

2. Verfahren zur Herstellung der Glucosedehydrogenase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Cryptococcus uniguttulatus FERM BP-1352 in einem Nährmedium züchtet und die dabei entstehende Glucosedehydrogenase aus dem Kulturmedium isoliert.