DE2904225A1 - Beta-galactosidase und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

Beschreibung

Die Erfindung bezieht sich auf eine neue ß-Galactosidase, die beim Abbau oder der Hydrolyse von Lactose zu Glucose und Galactose aktiv ist und bei sauren pH-Werten, die in den Verdauungsorganen des Menschen vorherrschen, und bei Normal- und erhöhten Temperaturen bei der Lagerung stabil ist. Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur fermentativen Gewinnung dieser neuen ß-Galactosidase durch Kultivieren eines Mikroorganismus des Stammes Penicillium und insbesondere Penicillium multicolor.

ß-Galactosidase ist ein Enzym, das die in der Milch von Säugetieren vorhandene Lactose zu Glucose und Galactose hydrolysiert. In den letzten Jahren hat dieses Enzym öffentliche Beachtung gefunden, da es zur Verbesserung oder therapeutischen Behandlung dyspeptischer Erkrankungen von Kindern brauchbar ist, die nicht in der Lage sind, Lactose abzubauen, und da es auch zur Bearbeitung verschiedener Milchprodukte brauchbar ist.

Manche Arten ß-Galactosidase wurden bereits nach kommerziellen Verfahren gewonnen, wozu das Kultivieren eines Bakteriums, von Hefe oder Pilzen (Fungi) und das Isolieren dieser ß-Galactosidasen aus der Kultur oder der Kulturbrühe des Mikroorganismus gehört. Doch sind nicht alle bekannten ß-Galactosidasen zufriedenstellend, da sie einen oder mehrere bestimmte Nachteile hinsichtlich ihrer Aktivität und Stabilität sowie der Ausbeute ihrer Gewinnung aufweisen.

Durch Mikroorganismen gebildete bekannte ß-Galactosidasen umfassen solche, die durch Bakterien, wie Milchsäurebakterien, und solche, die durch Hefen, wie Saccharomyces fragilis, erzeugt werden. Da diese durch Bakterien und Hefen erzeugten bekannten ß-Galactosidasen das intrazelluläre Enzym darstellen, das im Zellkörper des Bakteriums oder der Hefe erzeugt

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wird und verbleibt, müssen diese Enzyme aus dem Zellkörper dieser Mikroorganismen entfernt und extrahiert werden. Für die Gewinnung dieser intrazellulären Enzymprodukte sind daher eine Reihe von Bearbeitungsstufen erforderlich, und außerdem ist es schwierig, diese intrazellulären Enzymprodukte in hoher Ausbeute zu gewinnen.

Andererseits ist bekannt, daß einige ß-Galactosidasen als extrazelluläres Enzym durch Fungi der Gattung Aspergillus, wie Aspergillus niger (vgl. die veröffentlichte japanische Patentanmeldung 21078/74), Aspergillus oryzae (veröffentlichte japanische Patentanmeldung "Kokai" 151385/76), Aspergillus awamori (veröffentlichte japanische Patentanmeldung 22709/74), durch Fungi der Gattung Macrophomina ( veröffentlichte japanische Patentanmeldung "Kokai" 117677/76), durch Fungi der Gattung Sclerotium ( veröffentlichte japanische Patentanmeldung "Kokai" 116291/74) und durch Fungi der Gattung Tricoderma (veröffentlichte japanische Patentanmeldung "Kokai" 62688/74) erzeugt werden.

Unter diesen bekannten 3-Galactosidasen, die als extrazelluläres Enzym gebildet werden, sind diejenigen, die von Aspergillus niger und Aspergillus awamori, sowie diejenigen die durch die Fungi der Gattung Sclerotium gebildet werden, eine saure ß-Galactosidase, die optimalen pH bei stark saurem pH-Wert von 2 bis 3,5 zeigen und daher nur begrenzt verwendbar sind.

Weiter werden die bekannten, von Aspergillus oryzae und von Fungi der Gattung Macrophomina oder der Gattung Tricoderma erzeugten ß-Galactosidasen von der neuen ß-Galactosidase unterschieden, die durch Penicillium multicolor gemäß der Erfindung erzeugt wird, und zwar hinsichtlich ihres optimalen Temperaturwerts, optimalen pH-Werts, des Temperaturbereichs und des pH-Bereichs, in denen diese Enzyme stabil sind. Im

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■ übrigen haben die oben erwähnten bekannten Fungi, ausgenommen Aspergillus oryzae FERM-P 1680, eine nur sehr mäßige Fähigkeit zur Bildung der ß-Galactosidase als extrazelluläres Enzym.

Aspergillus oryzae FERM-P 1680 besitzt eine günstig hohe Fähigkeit zur Erzeugung von ß-Galactosidase hoher Aktivität, aber die durch diesen speziellen Stamm erzeugte ß-Galactosidase kann bei saurem pH-Wert von 2,5 bis 3,0 inaktiviert werden und zeigt somit eine geringere Stabilität bei sauren pH-Werten im Vergleich zu der erfindungsgemäß neuen ß-Galactosidase. Wenn die ß-Galactosidase von Aspergillus oryzae FERM-P 1680 als Verdauungsmittel Menschen verabreicht wird, ist sie oft nutzlos, da sie bei einem pH-Wert von 2,5 bis 3,0 sehr leicht inaktiviert wird, also bei pH-Werten, die normalerweise im Magenraum vorherrschen.

Im allgemeinen sind die eine bekannte ß-Galactosidase enthaltenden Enzympräparate bei ihrer Lagerung wenig stabil, und es wurde ein Verfahren zum Stabilisieren dieser Enzympräparate durch Gefriertrocknen (veröffentlichte japanische Patentanmeldung 50390/72 z.B.) sowie ein Verfahren zum Stabilisieren dieser Enzympräparate durch Einarbeiten von Inosit (veröffentlichte japanische Patentanmeldung "Kokai" 9783/76) vorgeschlagen worden, um die Zerstörung der ß-Galactosidase zu verhindern.

Ferner ist auch bekannt, daß Penicillium frequentans Westling (FERM-P 3085) eine ß-Galactosidase erzeugt, die bei einem pH-Wert von 3 bis 5 bei 4⁰C stabil ist, wobei der optimale pH-Wert bei 3,5 bis 4,5 liegt; Penicillium luteum Sopp (FERM-P 3091) erzeugt eine ß-Galactosidase, die bei einem pH-Wert von 3,5 bis 8 bei 4⁰C stabil ist, wobei der optimale pH 4,0 bis 5,0 ist; Penicillium citrinum ATCC 9849 (FERM-P 3086) produziert eine ß-Galactosidase, die bei einem pH-Wert

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von 3,5 bis 8 bei 4⁰C stabil ist, wobei der optimale pH 4,0 bis 5,0 ist; Penicillium glaucum Link (FERtI-P 3090) produziert eine ß-Galactosidase, die bei einem pH-Wert von 3,5 bis 8 bei 4⁰C stabil ist, wobei der optimale pH 4,0 bis 5,0 ist; Penicillium chrysogenum Thorn IFD 46 26 (FERM-P 3088) erzeugt eine ß-Galactosidase, die bei einem pH-Wert von 3 bis 8 bei 4⁰C stabil ist, wobei der optimale pH 4,0 bis 5,0 ist; und Penicillium notatum Westling (FERM-P 3087) produziert eine ß-Galactosidase, die bei einem pH-Wert von 3,5 bis 8 bei 4⁰C stabil ist, wobei der optimale pH 4,0 bis 5,0 ist. Diese Penicillium-Arten können jedoch die vorerwähnten ß-Galactosidasen in nur mäßiger Ausbeute erzeugen, die kommerziell unbefriedigend ist. Ausserdem sind die durch diese Penicillium-Arten erzeugten bekannten ß-Galactosidasen nicht völlig zufriedenstellend, weil sie bei pH-Werten von 2,5 bis 3,0, wie sie im Magen des Menschen vorherrschen, nicht stabil sind und weil sie durch Erwärmen auf eine erhöhte Temperatur von etwa 65⁰C für 15 min bei einem pH von 6 vollständig inaktiviert werden können.

Aufgabe der Erfindung war daher die Bereitstellung einer neuen ß-Galactosidase, die in hoher Ausbeute in kommerziellem Maßstab leicht erzeugt werden kann und sich für zahlreiche Anwendungen eignet.

Gelöst wird diese Aufgabe dadurch, daß ein bekannter Mikroorganismus, Penicillium multicolor, eine neue ß-Galactosidase in hoher Ausbeute erzeugt, die ausgezeichnete enzymatische Eigenschaften und insbesondere eine brauchbar hohe pH-Stabilität und eine brauchbar hohe Wärmestabilität zeigt. Diese neue ß-Galactosidase kann durch Kultivieren der bekannten Stämme von Penicillium multicolor in einem Kulturmedium, entweder flüssig oder fest, das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff enthält, zur Bildung und Ansammlung des Enzyms

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in dem Medium und anschließendes Isolieren des gewünschten Enzyms aus dem Medium erhalten werden.

Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird also eine aus dem Kulturmedium von Penicillium multicolor isolierte pulverförmige ß-Galactosidase mit den folgenden Merkmalen zur Verfügung gestellt:

a) sie besitzt eine relative ß-Galactosidase-Aktivität von 224 % für o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid und von 186 % für p-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid unter der Annahme einer relativen ß-Galactosidase-Aktivität von 100 % für Lactose,

b) sie hat ein Molekulargewicht von etwa 120.000, bestimmt nach der Gelfiltrationsmethode,

c) sie ist bei einem pH-Wert von 2,5 bis 7 aktiv, wobei der optimale pH bei 4,5 liegt,

d) die ß-Galactosidase-Aktivität geht durch 15-minütiges Erwärmen auf 75⁰C bei pH 6 verloren, wobei die Optimaltemperatur 55°C ist,

e) die ß-Galactosidase-Aktivität ist in einem pH-Bereich von 2,5 bis 8,0 bei 24-stündigem Stehen bei 4⁰C stabil,

f) die ß-Galactosidase-Aktivität wird bei 60⁰C 100%ig stabil gehalten und bei 65°C auf 60 %, bei 7O⁰C auf 25 % und bei 75°C auf 0 % bei 15-minütigem Stehen bei pH 6 gesenkt,

g) die ß-Galactosidase-Aktivität wird durch die Anwesenheit von Quecksilber(II)-Ionen (Hg⁺⁺) um etwa 20 % gehemmt, jedoch durch die Anwesenheit von Eisen(ti)-Ionen (Fe ) und Kupfer(II)-Ionen (Cu⁺⁺) bei einer Metallionenkonzentration von 10 M nicht wesentlich gehemmt, und

h) sie hat einen isoelektrischen Punkt von 5,37, gemessen nach einer Elektrophoresemethode.

Die erfindungsgemäße neue ß-Galactosidase ist bei einem pH-Wert von 2,5 bis 3,0 stabil, den der vom menschlichen Magen gebildete Verdauungssaft aufweist. Gewöhnlich schwankt der

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im Magen herrschende pH-Wert in Abhängigkeit von der Art und Menge der aufgenommenen Nahrung und der von der Nahrungsaufnahme an verstrichenen Zeit sowie auch aufgrund individueller Unterschiede. Der pH in der Magenhöhle zeigt normalerweise einen Wert von 4 bis 5 nach der Aufnahme von Kuhmilch und irgendwelchen Milchprodukten. Daher ist es sehr vorteilhaft, daß die erfindungsgemäße ß-Galactosidase einen Optimal - pH von 4,5 hat. Zudem zeichnet sich die erfindungsgemäße neue ß-Galactosidase in vorteilhafter Weise durch ihre hohe Stabilität bei Raumtemperatur und bei erhöhter Temperatur bis zu 60⁰C aus, so daß sie lange ohne Stabilisierungsmaßnahmen gelagert werden kann. Beispielsweise wird die erfindungsgemäße neue ß-Galactosidase selbst dann nicht wesentlich inaktiviert, wenn sie in Form eines pulvrigen Enzympräparats in einem verschlossenen Behälter 1 Monat bei 45⁰C gelagert wird. Die ß-Galactosidase-Restaktivität bleibt bei etwa 95. % oder darüber, selbst wenn sie einen Monat in freier Luft einer relativen Feuchtigkeit von 50 bis 70 % bei 45°C gelagert wird. Daher hat das erfindungsgemäße neue Enzym viele Vorteile im Vergleich zu den bekannten ß-Galactosidasen, die wenig stabil sind und normalerweise in der Kälte aufbewahrt x^erden müssen.

Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Erzeugung einer ß-Galactosidase geschaffen, bei dem

a) ein Stamm von Penicillium multicolor in einem Kulturmedium mit Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff zur Erzeugung und Ansammlung der ß-Galactosidase in dem Medium kultiviert und

b) dann die gewünschte ß-Galactosidase aus dem Medium isoliert wird.

Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus, Penicillium multicolor ist eine bekannte Art, die im "Japanese Federation of Culture Collections of Microorganisms"-Katalog, Seite 103, 1968, der japanischen Hinterlegungsstelle "Institute for Fermentation (TFO)", Osaka, Japan, beschrieben ist. Für

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die Zwecke der Erfindung eignet sich Penicillium multicolor KU-O-132. Dieser Stamm wurde auch in der japanischen Hinterlegungsstelle "Fermentation Research Institute"¹, Agency of Industrial Science & Technology of Japan, Inage, Chiba City, Japan, am 25. Januar 1978 unter der Hinterlegungsnummer FERM-P 4375 hinterlegt.

Nachfolgend werden die den oben erwähnten Stämmen von Penicillium multicolor eigenen morphologischen Eigenschaften kurz beschrieben:

1. Makroskopische Feststellungen (nach 10-tägigem Inkubieren bei 25⁰C auf Czapek's Agar-Medium) :

Kolonien von 30 bis 40 mm 0 bilden sich durch das Wachstum von Penicillium multicolor. Die Wuchsoberfläche ist radial runzelig und mit einer dichten, samtigen Schicht aus . Konidien von tief bläulich grüner bis grau-grüner Farbe bedeckt. Die Peripherie der Wuchsstelle zeigt orange bis gelbe Farbe einer Breite von 1 bis 2 mm. Die Rückseite der Wuchsstelle zeigt gelbe bis braune Farbe.

2. Mikroskopische Beobachtungen (nach 10-tägigem Inkubieren bei 25°C auf Czapek¹s Agar-Medium):

a) Penicillia: Monoverticillape

b) Konidophore: Gerade und senkrecht ohne Verzweigung,

2 bis 3 μΐη breit und an den Spitzen verbreitert.

c) Sterigma: 8-14 Sterigmen wachsen in der dichten

Masse.

d) Konidium: Von kugeliger oder ovaler Form, 2 - 3 um

Durchmesser. Die Oberfläche ist glatt.

Bei der Durchführung der Erfindung kann ein Stamm von Penicillium multicolor entweder in einem flüssigen Kulturmedium oder in einem festen Kulturmedium unter Anwendung bekannter Fermentationstechniken, vorzugsweise unter aeroben Bedingungen, kultiviert werden. Das zum Fermentieren

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verwendete Kulturmedium kann einen oder mehrere natürliche Nährstoffe, wie Weizenkleie, Reiskleie, entfettetes Sojabohnenmehl und Baumwollsamenmehl als Grundkomponenten enthalten. Das Kulturmedium kann auch Lactose, Stärke, Glucose, Arabinose und Xylose als Kohlenstoffquelle und Ammoniumsulfat, Natriumnitrat, Pepton, Malzextrakt und Hefeextrakt als Stickstoffquelle, wenn nötig, enthalten. Anorganische Salze, wie Phosphate, Magnesiumsalz und Calciumsalz, können in das Kulturmedium, wenn gewünscht, eingebracht werden. Im allgemeinen ist zum Kultivieren von Penicillium multicolor eine Inkubationstemperatur von 10 bis 35⁰C, vorzugsweise 25 bis 33⁰C, und eine Umgebung mit einem pH-Wert von 4-9, vorzugsweise 5 bis 7,5, für 1 bis 8 Tage, geeignet, wenngleich die Kulturbedingungen in Abhängigkeit von der Art der angewandten Kultivierung schwanken können. Die Erzeugung der erfindungsgemäßen neuen ß-Galactosidase erreicht normalerweise in 2 bis 6 Tagen Inkubation ein Maximum.

In einer festen Kultur kann die neue ß-Galactosidase mit etwa 1000 Einheiten/g des festen Kulturmediums erzeugt werden. In einer Flüssigkultur kann das neue Enzym mit etwa 150 Einheiten/ml des flüssigen Kulturmediums erzeugt werden. Diese hohe Produktivität des neuen Enzyms durch Penicillium multicolor beträgt etwa das 10- bis 30-fache der Produktivität der bekannten ß-Galactosidasen durch die bekannten, ß-Galactosidase erzeugenden Stämme, die zuvor genannt wurden, ausgenommen Aspergillus oryzae FERM-P 1680.

Um die neue ß-Galactosidase gemäß der Erfindung aus dem Kulturmedium von Peniciilium multicolor zu gewinnen und zu isolieren, in dem sich das Enzym durch Kultivieren dieses Mikroorganismus gebildet und angesammelt hat, kann das flüssige oder feste Kulturmedium unter Anwendung bekannter Techniken zur Gewinnung von Ensymen bearbeitet werden, und das gewonnene Enzym kann In' für die Reinigung von Enzymen

bekannterweise gereinigt werden. Das flüssige Kulturmedium kann von dem festen Material befreit werden, z.B. durch Filtrieren oder Zentrifugieren, und das so erhaltene Brühenfiltrat wird dann durch Destillieren unter vermindertem Druck oder mit Hilfe einer Dialysemembran konzentriert und anschließend einem Aussalzen mit Ammoniumsulfat oder einem Fällungsprozeß mit Aceton und/oder Äthanol zur Fällung eines rohen Pulvers der neuen 3-Galactosidase unterzogen. Das feste Kulturmedium kann mit Wasser extrahiert werden, und der anfallende wässrige Extrakt kann in gleicher Weise wie das oben genannte Brühenfiltrat bearbeitet werden. Das Kulturmedium selbst, das Brühenfiltrat und der wässrige Extrakt als solcher können, wenn gewünscht, als rohe 3-Galactosidase eingesetzt werden. Zur weiteren Reinigung kann die rohe ß-Galactosidase einer herkömmlichen Enzymreinigungstechnik unterworfen werden, wie dem Ionenaustausch, der Gelfiltration, der Dialyse, Adsorption und Proteinfällung. Wenn das konzentrierte Brühenfiltrat oder der wässrige Extrakt mit der darin gelösten neuen ß-Galactosidase mit Aceton zu einer Acetonkonzentration von 30 bis 40 Gew.-% zusammengemischt wird, kann praktisch die gesamte ß-Galactosidase zu einem β-Galactosidasepulver ausgefällt werden, das nach dem Trocknen.eine hohe ß-Galactosidasestärke von z.B. etwa 34,8 E/mg zeigt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher insofern von Vorteil, als es die Anwendung der billigen und handelsüblichen Acetonfällungsmethode zur Gewinnung einer pulverförmigen ß-Galactosidase hoher Stärke- möglich macht. Die pulvrige ß-Galactosidase einer Stärke von etwa 34,8 E/mg muß gewöhnlich nicht weiter gereinigt werden, solange sie Lactose-unverträglichen Patienten als Verdauungsmittel oral verabreicht wird, das entweder zu einem oral verabreichbaren Pulver, zu Granula oder Tabletten im Gemisch mit einem ρΙίαππαζβμ^ΒοΙι annehmbaren Träger, wie Stärke und Zucker, zusammengestellt oder in Milch oder irgendwelchen von Patienten aufzunehmenden Getränken gelöst werden kann.

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Die Stärke der neuen erfindungsgemäßen ß-Galactosidase kann nach herkömmlicher Testmethode wie folgt ermittelt werden:

1 ml einer Substratlösung mit 3,7 mg/ml o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid in Wasser, 2 ml 0,2m Macllvanic-gepufferter Lösung (pH 4,5) und 1 ml der Enzymlösung werden miteinander gemischt, und das Gemisch wird 15 min auf 37°C erwärmt, um die enzymatische Reaktion zu bewirken. Danach wird das Reaktionsgemisch mit 4 ml einer wässrigen, 1 m Natriumcarbonatlösung zur Beendigung der Reaktion gemischt. Das Reaktionsgemisch wird einer kolorimetrischen Analyse bei einer Wellenlänge von 420 nm unterzogen, um den Gehalt an gebildetem o-Nitrophenol zu bestimmen unter Bezugnahme auf eine Standardkurve von o-Nitrophenol für die kolorimetrische Analyse. Vermag das Enzym ein μ-Mol o-Nitrophenol pro min zu bilden, besitzt es eine Wirkungsstärke von 1.

Die erfindungsgemäße neue ß-Galactosidase wird nun hinsichtlich ihrer enzymatischen Eigenschaften mit der bekannten ß-Galactosidase von Penicillium citrinum verglichen, die für die durch andere Penicillium-Arten erzeugten bekannten ß-Galactosidasen repräsentativ ist, beschrieben in der erwähnten veröffentlichten japanischen Patentanmeldung "Kokai" 142593/ 76. Die Ergebnisse dieses Vergleichs sind in der folgenden Tabelle kurz zusammengefaßt:

Tabelle I

(1) Substratspezifität erfindungsgemäßes neues ß-Galactosidase

Enzym von P.citrinum Substrat (Glycoside) Relative Aktivität (%)

Lactose 100 100

ο-Nitropheny1-β-D-

galactopyranosid 224 398

p-Nitrophenyl-ß-D-

galactopyranosid 186 288

(2) Molekulargewicht

(nach der Gelfiltrationsmethode abgeschätzt) ca. 120 000 ca«, 100 000

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(3) optimaler pH

(4) aktiver pH (pH-Bereich,

in dem das Enzym aktiv ist)

(5) Optimaltemperatur

(6) aktive Temperatur (Temperaturbereich, in dem das Enzym aktiv ist)

(7) pH-Stabilität (pH-Bereich, in dem das Enzym beim Stehen bei 4⁰C 24 h stabil ist)

(8) Wärmestabilität, ß-Galactosidase-Restaktivität nach 15-minütigem Stehen bei pH 6 und

60⁰C
65°C
70⁰C
75°C

(9) Einfluß von Metallionen (bei 10~3-molarer Konzentration)

4,5

4-5

(Cu⁺-)

isoelektrischer Punkt (bestimmt durch Elektrophorese)

Löslichkeit in wässrigorganischen Lösungsmitteln

Wasser mit 40 Gew.-% Methanol

Wasser mit 50 Gew.-% Methanol

Wasser mit 40 Gew.-% Äthanol

Wasser mit 50 Gew.-% Äthanol

2,5 - 7 3,5 - 8 55°C 50⁰C

^75⁰C

<60°C

2,5 - 8,0 3,5 - 8,0

%
%
%

■ 0 %

% 0 % 0 % 0 %

praktisch nicht praktisch nicht gehemmt gehenmt

praktisch nicht wesentlich

gehemmt gehemmt

etwa 20 %
gehemmt

5/37

praktisch nicht gehemmt?

6,41

0 0 0 0

87 71 82 64

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Wasser mit 40 Gew.-%

Aceton 0 % 91 %

Wasser mit 50 Gew.-%

Aceton 0 % 72 %

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht.

Beispiel 1

Ein festes Kulturmedium mit einem Gemisch aus 10g Weizenkleie, 10 g entfettetem Sojabohnenmehl und 20 ml Wasser wurde in einen konischen 500 ml-Kolben gebracht und durch 15-minütiges Erhitzen auf 120⁰C in einem Autoklaven sterilisiert, das sterilisierte Kulturmedium wurde dann mit einer Schrägkultur von Penicillium multicolor KU-O-132 (FERM-P 4375) beimpft. Das beimpfte Medium wurde in einer sterilen Luft 4 Tage bei 28⁰C inkubiert, das inkubierte Medium dann mit 200 ml Wasser vermischt, um ß-Galactosidase in die wässrige Phase zu extra- . hieren. Das Gemisch wurde zum Entfernen festen Materials filtriert'. Das Filtrat, d.h. der wässrige Extrakt, zeigte eine ß-Galactosidasestärke von 228 E/ml.

Beispiel 2

Ein flüssiges Kulturmedium (100 ml) mit 3 % Reiskleie, 1 % Baumwollsamenmehl, 0,25 % Monokaliumphosphat und 0,15 % Dikaliumphosphat (pH 6,2) wurde in einen 500 ml-Kolben gebracht und dann durch Erhitzen in einem Autoklaven sterilisiert« Das sterilisierte Kulturmedium wurde mit einer Schrägkultur von Penicillium multicolor KU-O-132 beimpft, und das beimpfte Medium wurde 3 Tage bei 28⁰C schüttelkultiviert, indem es auf einen hin- und herschüttelnden Tisch gebracht wurde. Die inkubierte Kulturbrühe wurde filtriert„ und das Brtihenfiltrat zeigte eine ß-Galactosidasestärke von 140 E/ml.

Beispiel 3

(a) Ein festes Kulturmedium aus einem gleichförmigen Gemisch von 1,5 kg entfettetem Sojabohnenmehl, 1,5 kg Baumwollsamenmehl und 3 1 Wasser wurde als Schicht in einen grossen Behälter gebracht und dann durch Erhitzen in einem Autoklaven sterilisiert. Das sterilisierte Kulturmedium wurde dann mit 150 g einer Impfkultur von Penicillium multicolor KU-O-132 beimpft, die durch Inkubieren der vorerwähnten Schrägkultur dieses Mikroorganismus in einem Kleiemedium (einem Gemisch aus Weizenkleie und Wasser bei einem Gewichtsverhältnis von 1:1) bei 28⁰C für 3 Tage hergestellt worden war. Das beimpfte Medium wurde dann ruhend 5 Tage bei 28⁰C inkubiert, das inkubierte Medium (5,4 kg) zerteilt und in eine zylindrische Glassäule gebracht, durch die anschließend Wasser geführt wurde, indem das Wasser am oberen Säulenende eingeführt wurde. Die Extraktlösung (18 1) mit dem gewünschten Enzym wurde als Ablauf am Boden der Säule erhalten und zentrifugiert, um sie von einer geringen Menge festem Material zu befreien, das in der Extraktlösung suspendiert war. Die anfallende überstehende Lösung zeigte ß-Galactosidasestärke von 347 E/ml.

(b) Diese überstehende Lösung wurde auf ein Volumen von 4 1 durch Ultrafiltration konzentriert, und dann wurden der konzentrierten Lösung 2,7 1 Aceton bei tiefer Temperatur zugetropft. Die gebildete Fällung wurde abfiltriert und unter vermindertem Druck zu 1.65 g eines erfindungsgemäßen ß-Galactosidasepulvers getrocknet, das eine hohe ß-Galactosidasestärke von 34800 E/g zeigte. Ausbeute 92 %. .

(c) Das wie oben erhaltene ß-Galactosidasepulver (mit einer Stärke von 34800 E/g) wurde folgendermaßen weiter ge-

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reinigt: Dieses ß-Galactosidasepulver wurde in 0,01 m gepufferter Acetatlösung bei pH 4,5 gelöst, und die erhaltene Lösung wurde durch eine Säule mit CM-Cellulose geführt, um das Enzym an das Säulenmaterial zu adsorbieren. Die CM-Cellulosesäule wurde dann mit wässrigen Natriumchloridlösungen stufenweise eluiert. Die aktiven Eluatfraktionen wurden miteinander vereinigt und mit 0,01 m gepufferter Phosphatlösung bei pH 7,0 dialysiert, und die so dialysierte Enzymlösung dann durch eine DEAE-Cellulosesäule geführt, um das Enzym zu adsorbieren. Diese DEAE-Cellulosesäule wurde anschließend stufenweise mit wässrigen Natriumchloridlösungen eluiert. Die aktiven Fraktionen des Eluats wurden miteinander vereinigt und dann durch eine Säule mit einem Gelfiltrationsmittel ("Sephadex" G 150) geführt. Der aus dieser Sephadex-Säule austretende Ablauf wurde fraktionsweise aufgefangen und solche aktiven Fraktionen, die die ß-Galactosidasestärke mit einem konstanten Wert zeigten, wurden miteinander vereinigt und unter vermindertem Druck konzentriert.

Der so erhaltenen konzentrierten Lösung wurde Äthanol bei tiefer Temperatur zugetropft, um das gewünschte Enzym auszufällen. Das Enzym wurde abfiltriert und unter vermindertem Druck zu einem farblosen und elektrophoretisch reinen Pulver der erfindungsgemäßen ß-Galactosidase getrocknet, die eine ß-Galactosidasestärke von 170000 E/g zeigte. Ausbeute 50 %.

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Claims (7)

1. 4690 Home 1, _ 8000 München 40,

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   Telex 08229853 ΤθΙαχ 5215360

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   Bnyerlüche Vorolnsbank Münchon H52 Dic3(innr Bnnk AG llnrno 7-5?0 4!)9 Poslscheckkonlo Dortmund 550 60-Ί67

   ^.B'ebruar 1979

   ^Ref-^: M 06520 Pr.

   In der Antwort bitte angebon Zuschrift bitte nach:

   München

   KUMIAI CHEMICAL INDUSTRY CO., LTD. Tokio, Japan

   ß-Galactosidase und Verfahren zu ihrer Herstellung

   Patentansprüche

   Pulverförmige ß-Galactosidase, isoliert aus dem Kulturmedium von Penicillium multicolor, mit folgenden Eigenschaften:

   a) sie besitzt eine relative ß-Galactosidase-Aktivität von 224 % für o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid und von 186 % für p-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid unter der Annahme einer relativen ß-Galactosidasc-Aktivität von

   • 100 % für Lactose,

   b) sie hat ein Molekulargewicht von etwa 120.000, bestimmt nach der Gelfiltrationsmethode,

   c) sie ist bei einem pH-Wert von 2,5 bis 7 aktiv, wobei der optimale pH bei 4,5 liegt,

   d) die 3-Galactosidase-Aktivitat geht durch 15-minütiges

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   Erwärmen auf 75⁶C bei pH 6 verloren, wobei die Optimaltemperatur 55⁰C ist,

   e) die ß-Galactosidase-Aktivität ist in einem pH-Bereich von 2,5 bis 8,0 bei 24-stündigem Stehen bei 4°C stabil,

   f) die ß-Galactosidase-Aktivität wird bei 6O⁰C 100%ig stabil gehalten und bei 65°C auf 60 %, bei 70⁰C auf 25 % und bei 75°C auf 0 % bei 15-minütigem Stehen bei pH 6 gesenkt,

   g) die ß-Galactosidase-Aktivität wird durch die Anwesenheit

   + +
   von Quecksilber(II)-Ionen (Hg ) um etwa 20 % gehemmt,

   jedoch durch die Anwesenheit von Eisen(II)-Ionen (Fe ) und Kupfer(II)-Ionen (Cu ) bei einer Metallionenkonzentration von 10 M nicht wesentlich gehemmt, und h) sie hat einen isoelektrischen Punkt von 5,37, gemessen nach einer Elektrophoresemethode.
2. 2. ß-Galactosidase nach Anspruch 1 erhalten aus Penicillium multicolor KU-O-132, FERM-P 4375.
3. 3. ß-Galactosidase nach Anspruch 1 in Form eines Pulvers mit einer relativen ß-Galactosidase-Aktivität von etwa 34.800 E/g.
4. 4. Verfahren zur Herstellung einer ß-Galactosidase nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß

   a) ein Stamm von Penicillium multicolor in einem Kulturmedium mit Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff und Stickstoff zur Bildung und Ansammlung der ß-Galactosidase in dem Medium gezüchtet und

   b) die ß-Galactosidase aus dem Medium isoliert wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkultur von Penicillium multicolor, bei einer Temperatur von 10 - 40⁰C und einem pH von 4-9 für 1-8 Tage unter aeroben Bedingungen erfolgt.

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6. 6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß

   a) Penicillium multicolor in einem Kulturmedium mit Kleie als Quelle für assimilierbaren Stickstoff zur Bildung und Ansammlung der ß-Galactosidase im Medium gezüchtet,

   b) das Medium mit Wasser zu einem wässrigen Lösungsextrakt des Enzyms extrahiert,

   c) das Enzym aus dem Extrakt durch Zusatz von Aceton gefällt und

   d) die erhaltene Fällung getrocknet wird.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß

   a) Penicillium multicolor in einem flüssigen Kulturmedium mit Quellen mit assimilierbarem Stickstoff und Kohlenstoff unter aeroben Bedingungen zur Bildung und Ansammlung des Enzyms in dem flüssigen Medium gezüchtet,

   b) die flüssige Kulturbrühe zur Entfernung des festen Materials filtriert,

   c) das erhaltene klare Filtrat konzentriert,

   d) das Enzym aus dem konzentrierten Filtrat durch Zusatz von Aceton gefällt und

   e) die erhaltene Fällung getrocknet wird.

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