DE2319242C3

DE2319242C3 - Verfahren zur Herstellung von Dextranase

Info

Publication number: DE2319242C3
Application number: DE2319242A
Authority: DE
Inventors: Fumiko Hojho; Kunio Imamura; Nobuyoshi Ishikawa; Kagawa Kanonji; Kenichi Suita Osaka Kotera; Kazuo Kanonji Kagawa Shimada; Takaaki Uemura; Kiyoshi Ugawa
Original assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Current assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Priority date: 1972-04-17
Filing date: 1973-04-16
Publication date: 1978-06-08
Also published as: FR2185682B1; DE2319242A1; DE2319242B2; JPS49487A; US3912594A; GB1433261A; CH581191A5; JPS5020155B2; FR2185682A1

Description

u) Morphologische Eigenschaften

1.	Form und Größe der Mikroorganismenzellen	Stäbchen
	(etwa [1,0-3,0) · (0,5-0,7] am)
2.	Polymorphisms der Zellen
.1.	M'tillUit	nicht-motil
4.	Sporenbildung	nein
S	Gram-I ürbunii	negativ
(1.	Säurebeständigkeit	nein

ι) Wuchstumseigenscharien aul verschiedenen Nährmedien

1. Nahr-Agarplatte

2. Nähr-Schrägagar

3. Nahrbrühe

4. Durchstoßen von Bouillon-Gelatine

5. Lakmus-Milch

6. Kartoffel

gutes Wachstum, Kolonien sind ringförmig, halbkugelförmig oder (lach, tcjiropfenartig. glatt und
undurchsichtig; glänzende und viskose gelbe, nichtdiffundierende Pigmente
gutes Wachstum
gutes Wachstum

Wachstum an der Oberfläche der Kultur entian. der
durchstoßenen Linie, keine Verflüssigung

Wachstum unter geringem Sauerwerden
gutes Wachstum, gelbe Kolonien

) Physiologische Eigenschaften

1. pH-Wertbereich der Wachstumsbedingungen	etwa 3.3 bis etwa 8.3
Temperaturbereich der Wachstumsbedingungen	etwa 5 bis etwa 31 C
2. Verhalten gegenüber Sauerstoff	fakultativ anaerob
3. Reduktion von Nitraten	Nitrilbildung
4. Methylrot-Test	negativ
5. Voges-Proskauer-Test	negativ
6. Indol-Test	negativ
7. Bildung von Schwefelwasserstoff	negativ
8. Hydrolyse von Starke	positiv
9. Ausnutzung von Citrat	negativ
0. Pigmentbildung	positiv (nicht-diffundierend)
1. Urease	negativ
2. Oxidase	positiv
3. Catalase	positiv
4. Säurebildung aus KohlenstolTquellen
(1 ) L-Arabinose	positiv
(2) D-Xylose	positiv
(3) D-Glucose	positiv
(4) D-Mannose	positiv
(5) D-Fructose	positiv
(6) D-Galactose	positiv
(7) Maltose	positiv
(8) Saccharose	positiv
(9) Lactose	negativ
(10) Trehalose	negativ
(11) D-Sorbit	negativ
(12) D-Mannit	negativ
(13) Inosit	negativ
(14) Glycerin	negativ
(15) Stärke	positiv
I) Sonstige Eigenschaften
1. Beständigkeit gegenüber Natriumchlorid	etwa 0-2,5 Gew./Vol.-%
2. Oxidation von Gluconsäure	negativ
3. Hydrolyse von Arginin	negativ

Aulgrund der vorstehenden Versuchsergebnisse gelörcn die erlmdungsgemäl.l verwendeten Mikroorgaüsnien nach ihren Eigenschaften unter Bezugnahme uf das »Manual for the Identification of Medical iacteria«, S. T. Cowan et al, Cambridge Univ. Press.

(1965). und »Bergey's Manual ol Detemiiname Baclerioli^'v«. Breed et al. 7. Auflage, als nichtmotile. gramnegative Stäbchen, die aerob wachsen. Catalasepositiv. Oxidase-positiv sind, gelbe, nicht-dilluiidiercnde Pigmente bilden und aus verschiedenen /uckern

Säure bilden, zur Gattung Flavobaeterium.

Die erfindungsgemäß bevorzugt verwendeten llavobactcriumstiimme FERM-P Nr. MH 1285, 1286, 1287 und 1288 sind bei dem »Technical Research Institute of Microbial Industry, Agency of Industrial Science & Technology«, Japan, hinterlegt. Es können auch andere, zur Gattung llavobacterium gehörende Mikroorganismenstämme sowie alle Mutanten erfindungsgemäß verwendet werden, die aus den vorstehend beschriebenen Mikroorganismen durch verschiedene übliche Variationsverfahren hergestellt werden können und in der Lage sind, Dextranase zu bilden. /.. H. solche Mutanten, die Stärkehydrolyse-negativ sind und keine gelben Kolonien bilden.

Zur Durchführung des erfindungsgemäl.ien Verl.ihrens wird der zur Gattung Fiavobaclcriurn gehörende. Dextranase bildende Mikroorganismus in einem natürlichen oder synthetischen Nährmedium gezüchtet. Cjs erllndungsgemäß verwendete Nährmedium kann llüssig oder fest sein, für die großtechnische Herstellung von Dextranase wird jedoch vorzugsweise eine Submerskultur mit einem flüssigen Nährmedium verwendet.

Als Nührstoffquellen können erfindungsgemäß alle üblicherweise Tür die Züchtungeines Mikroorganismus verwendeten Quellen eingesetzt werden. Als Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff können z. H. Materialien, wie Dextran, Glucose, Saccharose, Maltose, lösliche Stärke u.dgl., verwendet werden. Als SlickstolT-quellc können in dem Nährmedium beispielsweise Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Caseinhydrolysal. Ammoniumsalze (wie Ammoniumphosphat) u.dgl. verwendet werden. Als anorganische Salze können beispielsweise die Magnesium-, .Kaliumsalze von P!m-sphorsäure u. dgl. verwendet werden. Die bei der Züchtung angewendete Temperatur liegt zwischen etwa 5 und etwa 31 (', vorzugsweise zwischen etwa 20 und etwa 30 ( . der pH-Wert des Nährmediums wird au! einen Wert zwischen etwa 5.5 und etwa 8.5. vorzugsweise /wischen etwa 6.5 und etwa 7.5. eingestellt. Die Dauer der Züchtung variiert in Abhängigkeit von den übrigen Züchtungsbedingungen, sie beträgt in der Regel etwa 3 bis etwa 7 Tage in einer stationären Kultur und etwa 1 Tag in einer Submerskuitur. Die Kulturbrühe, in welcher der Mikroorganismus unter den obengenannten Bedingungen in reichlichem Maße gewachsen ist, wird steril zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit wird abgetrennt und der dabei erhaltene Rückstand wird zur Gewinnung von roher Dextranase mit Wasser oder einer geeigneten Pufferlösung, z.B. einem M/15-Phosphatnuffer mit einem pH-Wert von 6,5, extrahiert. Die dabei erhaltene rohe Dextranase kann als Endprodukt verwendet werden. Es kann aber auch zweckmäßig sein, unter Anwendung verschiedener Verfahren, beispielsweise durch Konzentration unter vermindertem Druck, durch Ausfällung durch Aussalzen, durch organische Lösungsmittelextraktion und Kolonnenfraktionierung, die allein oder in Kombination angewendet werden können, eine gereinigte Enzymlösung herzustellen.

Das erfindungsgemäß hergestellte Dextranaseprodukt enthält hauptsächlich Endodextranase. Dies ergibt sich daraus, daß beispielsweise ein Dextran mit einem Molekulargewicht von 2 000 000 durch Kolonnenchromatographie an durch Mischpolymerisation mit Methylenbisacrylamid vernetzten Polyacrylamidgelen (gelegentlich auch als Bio-Gel bezeichnet) bei 37 C innerhalb von 5 Minuten zu einem Dextren mit einem

Molekulargewicht von 20 000 bis 40 (K)O hydrolysiert wurde und daß bei Einwirkung des erllndungsgemäß hergestellten Enzyms eine schnelle Verringerung der Viskosität des dabei erhaltenen Dcxtrans festgestellt wurde.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Fig. 1 und 2 der Zeichnungen näher erläutert. Es /eigen:

Fig. 1 in graphischer Form die Ergebnisse der Kolonnenchroniatographie unter Verwendung des obengenannten Polyacrylamidgcls. Dabei ist auf der Abszisse jeweils das Volumen des F.luats in cm' und auf der Ordinate der Zuckergehalt in v.g/cm', gemessen nach dem Anlhrone-Verfahren (vgl. 1·'. A. Loewus, »Analytical Chemistry«, 24. 219 [1952]) angegeben.

Bei der Erstellung der Kurven wurde ein Dextran mit einem Molekulargewicht von 2 000 000 in einer Menge von 1,0 Gev /-^x -.it dem erllndungsgemäß

hergestellten Enzym bzw. einer handelsüblichen Vergleiehs-Dextranase in gleichen Mengen gemischt, die Mischung wurde bei 37 (.' 5 Minuten lang bei einem pH-Wert von 5,8 stehengelassen und dann wurde die Kolonnenchromatographie an einem Polyacrylamidgcl durchgeführt (Kolonnen: 1.1 cm X55 cm. Eluierungsmittel: M/50 Carbonat-Bicarbonat-Pufferlösung bei pH 10.0, Eluierungsgeschwindigkeit 14cm /Std.). Die Kurve (1) bezieht sich auf das Dextran mit einem Molekulargewicht von 2 000 000 vor der Behandlung mit Dextranase, die Kurve (2) bezieht sich auf das Dextran nach der Behandlung mit Dextranase von BK-O3 und die Kur\e (3) bezieht sich auf das Dextran nach der Behandlung mit einer handelsüblichen Vergleichs-Dextranase.

Aus den in der Kurve 1 dargestellten Ergebnissen gehl hervor, daß das erllndungsgemäß hergestellte Enzym eine ausgezeichnete hydrolytische Wirkung aul das durch Zahnkaries verursachende Mikroorganismen gebildete Dextran hatte (vgl. J. Jablon et al. »J. Bacteriol.«, 92, 1950. 1966).

Die Fig. 2 zeigt in graphischer Form die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn rohe Enzymlösungen aus B K-O 3 einer Koioniienelnumalographie bzw. Gelfiltration gemäß I-ig. 1 unter Verwendung verschiedener Dextrane. die von verschiedenen Streplococcenstämmen gebildet wurden, unterworfen wurden. Aul der Abszisse ist das Volumen in cm' angegeben, während auf der Ordinate die Kohlenhydrate al· Glucose in ;j.g/cnr angegeben sind. Die oberste Reihe der Kurve zeigt eine Kontrollprobe ohne Verwendung von Dextranase an. die mittlere Reihe gibt die Ergebnisse wieder, die bei einer Induzierung mit Dextrar mit einem Molekulargewicht von 10 000 erzielt wurden, während die unterste Reihe die Ergebnisse angibt, die bei der Induzierung mit AFIT-Dextran erhalten wurden. Aus der Fig. 2 ist ersichtlich, daß da! durch das Induzierungsmittel AHT-Dextran gebildet! Dextran vollständig hydrolysiert wurde zu einerr Dextran mit einem niedrigen Molekulargewicht.

Es hat sich gezeigt, daß dem Nährmedium ein Dex trän als Induzierungsmittel einverleibt werden muß wenn hohe Ausbeuten an Dextranase erzielt werdei sollen. Besonders gute Ergebnisse in bezug auf di< Verbesserung der Hydrolyseaktivität der erfindungs gemäß hergestellten Dextranase gegenüber Dextrai werden erhalten, wenn als Induzierungsmittel ein sol ches Dextran zugesetzt wird, das durch einen Zahn karies verursachenden Mikroorganismus gebilde wird (Dextran AHT).

Die nach dem erllndungsgemäßen Verfahren hergestellte Dextranase oder ein Präparat davon ist bei einem pH-Wert von etwa 4,0 bis etwa 8,5 aktiv, wobei die maximale Aktivität bei einem pH-Wert von etwa 6,5 bis etwa 7,5 auftritt. Sie ist bei einer Temperatur ^s von etwa 55 C oder weniger stabil.

Die erfindungsgemäß hergestellte Dextranase kann leicht in eine Zahnpaste oder in ein Zahnpulver, in eine Einreibsalbe oder in eine Einreibloüon, in ein Mundwasser, in ein Kaugummi, in ein Nahrungsmittel, in ein Getränk oder in einen Wasserstrahl-Zahnreiniger in einer solchen Menge eingearbeitet werden, daß diese Produkte etwa 1000 bis etwa 200 000 Einheiten Dextranase pro g Produkt enthalten (vgl. die belgische Patentschrift 7 18 645).

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher erläutert.

Beispiel

20

61 flüssiges Kulturmedium (eingestellt auf einen pH-Wert von 7,0), das 1,5 Gew.-/Vol.-% Polypepton, 0,1 Gew./Vol.-% Hefeexlrakt, 0,2 Gew./Vol.-% Monokaliumphosphat, 0,2 Gew./Vol.-% Monoammoniumphosphat, 0,1 Gew./Vol.-% Magnesiumsulfat und 0,5 Gew./Vol.-% Dextran mit einem Molekulargewicht von 10 000 enthielt, wurden in einen 10-1-Fermentierbehälter gegossen und sterilisiert. Dann wurde das Medium mit den in der folgenden Tabelle I angegebenen Stämmen von zur Gattung Flavobacterium gehörenden Mikroorganismen beimpft. Die Züchtung erfolgte unter Rühren und unter Belüftung bei 30 C für einen Zeitraum von 20 bis 24 Stunden.

Die dabei erhaltene Kulturbrühe wurde zur aseptischen Abtrennung des lebenden Mycels zentrifugiert. Die dabei erhaltenen Zellen wurden mit einer M/l 5-Phosphatpufferlösung durch Zugabe von 10% Zellen (bezogen auf das Naßgewicht der Zellen) zur Lösung unter Rühren der dabei erhaltenen Mischung 2 bis

3 Tage lang bei 36^! C extrahiert. Der dabei erhaltene Extrakt wurde zur Abtrennung einer überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert und in dem nachfolgenden Verfahren als rohe Enzymlösung verwendet.

Die Aktivität des wie oben hergestellten Enzyms wurde unter Verwendung von handelsüblicher Dextranase als Kontrolle unter Anwendung der nachfolgenden Verfahren zur Bestimmung der Aktivität ermittelt:

Versuch 1

Dextran mit einem Molekulargewicht von 70 000 und ein durch einen Zahnkaries verursachenden Streptococcus-Stamm gebildetes Dextran (Dextran AHT) wurden als Substrat verwendet. Zu 10 cm³ einer 1 Gew./Vol.-%igen Lösung jedes Dextrans wurden

4 cm³ einer 0,1 M Acetatpufferlösung und I cm³ der rohen Enzymlösung zugegeben. Die dabei erhaltene Mischung wurde 30 Minuten lang bei einem pH-Wert von 5,8 bei 37⁰C stehengelassen, dann wurde nach dem Somogyi Verfahren (vgl. M. Somogyi »J. Biol.

Chem.«, 160, 60 [1945]) eine erhöhte Menge an reduzierendem Zucker festgestellt.

Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben, wobei die Ergebnisse in Einheiten pro cm' der rohen Enzymlösung angegeben sind. Eine Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die zur Freisetzung von I inu M reduzierendem Zucker pro Minute erforderlich ist.

Tabelle 1	Substrat	Substrat
Havobactcrium-	(Dextran mit einem	(ΛΗΤ-
Stamm	Molekulargewicht	Dextran)*
	von 70 000)
	263	243
BK-Ol	591	524
BK-03	311	296
BK-04	295	260
BK-05	142	125
BK-06	368	231
Kontrolle**

J. M. Jablon et al »J. Bacteriol.«, 92, 1950. 1966
!"/»ige (Gew./Vol.)-Lösung

Versuch 2

Zu 10 cm³ einer 5 Gew./Vol.-%igen Lösung von Dextran mit einem Molekulargewicht von 2 000 000 wurden 4 cm³ einer 0,1 M Acetatpufferlösung und 1 cm³ der rohen Enzymlösung zugegeben. Die Mischung wurde bei einem pH-Wert von 5,8 bei 37 C stehengelassen. Dann würde die für die Abnahme der Anfangsviskosität des Dextrans bis auf die Hälfte erforderliche Zeit mittels eines Ostwald-Viskosimeters nach den Angaben in der japanischen Patentanmeldung Nr. 8067/1969 bestimmt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II angegeben.

Tabelle II	Zur Verminderung der Anfangsviskosität
Flavo-	bis auf die Hälfte erforderliche Zeit
bacterium-	(Min.)
Stamm	20
BK-Ol	7
BK-03	17
BK-04	19
BK-05	31
BK-06	38
Kontrolle

Aus den vorstehenden Ergebnissen geht hervor, daü es sich bei dem erfindungsgemäß hergestellten Enzyrr um Endodextranase handelt, die durch eine höher« Viskositätsverringerung als Produktivität in bezug au reduzierende Zucker charakterisiert ist.

Hierzu 2 Blai· Zeichnungen

Claims

1 2 Macrosporium sp als Dextranase biosynthetisierende Patentansprüche: Mikroorganismen verwendet werden). Es hat sich jedoch gezeigt, daß diese bekannten Dextranasepräparate

1. Verfahren zur Herstellung von Dextranase, keine ausreichende Schutzwirkung gegen Zahnkaries dadurch gekennzeichnet, daß man einen 5 ergeben, weil deren hydrolytische Aktivität gegenüber zur Gattung Flavobacterium gehörenden, Dextra- Dextran unzureichend ist.

nase biosynthetisierenden Mikroorganismus in Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein verbessertes

einem Kulturmedium, das ein Dextran als Induzie- Verfahren zur Herstellung von Dextranase zu ent-

rungsmittel enthält, bei einer Temperatur von 5 bis wickeln, das nicht nur in großtechnischem Maßstabe

31 C und bei einem pH-Wert von 5,5 bis 8,5 züchtet io unter Erzielung einer hohen Dextranaseausbeute

und die darin akkumulierte Dextranase aus dem durchgeführt werden kann, sondern auch ein Dex-

Medium gewinnt. tranasepräparat mit einer hohen hydrolytischen Wirk-

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- samkeit gegenüber Dextran aufweist.

zeichnet, daß man als Mikroorganismus Flavo- Nach umfangreichen Untersuchungen unter Ver-

bacterium FERM-P Nr. 1194, Flavobacterium i_s wendung von Dextran und einem mit Epichlorhydrin

FERM-P Nr. 1285, Flavcbacterium FERM-P Nr. vernetzten Dextran (einem wasserlöslichen, weißen,

1286, Flavobacterium FERM-PNr. 1287 oder Flavo- pulvertörmigen Material mit einer dreidimensionalen

bacterium FERM-PNr. 1288 einsetzt. Netzwerkstruktur) als Substrate wurde nun erfindungs-

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gemäß gefunden, daß die obengenannte Aufgabe durch gekennzeichnet, daß die Züchtung des Mikroorga- 20 Verwendung eines zur Gattung Flavobacterium gehönismus im Kulturmedium durch Verwendung eines renden, Dextranase biosynthetisierenden Mikroorga-Dextransals Induzierungsmittel durchgeführt wird, nismus gelöst werden kann, der unter ganz bestimmten das durch einen Zahnkaries verursachenden Mikro- Bedingungen gezüchtet wird.

Organismus gebildet wird. Gegenstand der Erfindung ist ein verbessertes Ver-

25 fahren zur Herstellung von Dextranase, das dadurch

gekennzeichnet ist, daß man einen zur Gattung Flavobacterium gehörenden, Dextranase biosvnthetisierenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung ein Dextran als Induzierungsmittel enthält, bei einer

von Dextranase. 30 Temperatur von 5 bis 31 C und bei einem pH-Wert

Dextranase wird für die Herstellung von Dextran von 5,5 bis 8,5 züchtet und die darin akkumulierte

verwendet, das in der Medizin in großem Umfange Dextranase aus dem Medium gewinnt,

als Blutersat/ verwendet wird. Dextranase hat sich in Als Mikroorganismus verwendet man vorzugsweise

den letzten Jahren auch als sehr vorteilhaftes Enzym Flavobacterium FERM-P Nr. 1194, Flavobacterium

für die Hydrolyse von Dextran erwiesen, das unter der 35 FERM-P Nr. 1285, Flavobacterium FERM-P Nr. 1286,

Einwirkung von Zahnkaries hervorrufenden Mikro- Flavobacterium FERM-P Nr. 1287 oder Flavobac-

organismen gebildet wird. terium FERM-P Nr. 1288 (diese Mikroorganismen

Man hat daher bereits verschiedentlich versucht, werden nachfolgend abgekürzt als BK-Ol, BK-03 bis

durch Einarbeitung von Dextranase in Zahnpulver BK-06 bezeichnet).

bzw. Zahnpasten oder andere Mundreinigungsmittel 40 Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung des Vereine vorbeugende und schützende Wirkung gegen fahrens der Erfindung erfolgt die Züchtung des Mikro-Zahnkaries zu erzielen. Organismus im Kulturmedium unter Verwendungeines

Verfahren zur Herstellung von Dextranase auf bio- Dextrans als Induzierungsmittel, das durch einen Zahnsynthetischem Wege unter Verwendung der verschie- karies verursachenden Mikroorganismus gebildet wird, densten Mikroorganismen, wie z. B. Schimmelpilzen, 4s Durch die Verwendung von Dextran als Induziedie zur Gattung Penicillium, Aspergillus, Spicaria und rungsmittel erhält man nach dem erfindungsgemäßen C'haetomium gehören. Bakterien, die zur Gattung Verfahren die Dextranase in einer hohen Ausbeute. Lactobacillus und Cellvibrio gehören, sind bereits be- Die erfindungsgemäß hergestellte Dextranase hat | kaiint (vgl. »Applied Microbiology«, Band 20, Nr. 3, außerdem eine außerordentlich hohe Hydrolyse-Akti-Seiten 421-426, sowie die US-Patentschrift 36 22 611 so vität gegenüber Dextran, so daß hierdurch ein wirk- '■ und die französische Patentschrift 20 19 829, in denen sanier Schutz gegen Zahnkaries erzielt werden kann. Penicillium luniculosum NRRLNr. 1768 bzw. Peni- Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwend- ( cillium luniculosum bzw. C'haetomium sp., Strepto- baren, zur Gattung Flavobacterium gehörenden Mikro- _:, myces sp., Giberella sp., Gloesporium sp., Glomerella Organismen haben gemeinsam die folgenden Eigen- | sp., Humicola sp., Sporptrichum sp., Anixiella sp. und ss schäften: %