DE2319242B2

DE2319242B2 - Verfahren zur herstellung von dextranase

Info

Publication number: DE2319242B2
Application number: DE19732319242
Authority: DE
Inventors: Kazuo Kanonji Kagawa; Kotera Kenichi Suita Osaka; Uemura Takaaki; Imamura Kunio; Ishikawa Nobuyoshi; Hojho Fumiko; Ugawa Kiyoshi; Kanonji Kagawa; Shimada (Japan)
Original assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Current assignee: Research Foundation for Microbial Diseases of Osaka University BIKEN
Priority date: 1972-04-17
Filing date: 1973-04-16
Publication date: 1977-10-27
Also published as: DE2319242C3; GB1433261A; US3912594A; JPS49487A; FR2185682B1; JPS5020155B2; FR2185682A1; DE2319242A1; CH581191A5

Description

.1°

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Dextranase,

Dextranase wird für die Herstellung von Dextran verwendet, das in der Medizin in großem Umfange als Blutersatz verwendet wird. Dextranase hat sich in den letzten Jahren auch als sehr vorteilhaftes Enzym Tür die Hydrolyse von Dextran erwiesen, das unter der Einwirkung von Zahnkaries hervorrufenden Mikroorganismen gebildet wird.

Man hat daher bereits verschiedentlich versucht, durch Einarbeitung von Dextranase in Zahnpulver bzw. Zahnpasten oder andere Mundreinigungsmittel eine vorbeugende und schützende Wirkung gegen Zahnkaries zu erzielen.

Verfahren zur Herstellung von Dextranase auf biosynthetischem Wege unter Verwendung der verschiedensten Mikroorganismen, wie z. B. Schimmelpilzen, die zur Gattung Penicillium, Aspergillus, Spicaria und Chaetomium gehören, Bakterien, die zur Gattung Lactobacillus und Cellvibrio gehören, sind bereits bekannt (vgl. »Applied Microbiology«, Band 20, Nr. 3, Seiten 421-426, sowie die US-Patentschrift 36 22 611 und die französische Patentschrift 20 19 829, in denen Penicillium funiculosum NRRL Nr 1768 bzw. Penicillium luniculosum bzw. Chaetomium sp., Streptomyces sp., Giberella sp., Gloesporium sp., Glomerella sp., Humicola sp., Sporptrichum sp., Anixiella sp. und Macrosporium sp. als Dextranase biosynthetisierendi Mikroorganismen verwendet werden). Es hat sich je doch gezeigt, daß diese bekannten Dextranasepräparati keine ausreichende Schutzwirkung gegen Zahnkarie ergeben, weil deren hydrolytische Aktivität gegenübe Dextran unzureichend ist.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein verbesserte: Verfahren zur Herstellung von Dextranase zu ent wickeln, das nicht nur in großtechnischem Maßstab« unter Erzielung einer hohen Dextranaseausbeuu durchgeführt werden kann, sondern auch ein De\ tranasepräparat mit einer hohen hydrolytischen Wirk samkcit gegenüber Dextran aufweist.

Nach umfangreichen Untersuchungen unter Ver wendung von Dextran und einem mit Epichlorhydrii vernetzten Dextran (einem wasserlöslichen, weißen pulverförmiger! Material mit einer dreidimensionaler Netzwerkstruktur) als Substrate wurde nun erfindungs gemä/i gefunden, daß die obengenannte Aufgabe durc) Verwendung eines zur Gattung Flavobaclerium gehö renden, Dextranase biosynthetisierenden Mikroorga nismus gelöst werden kann, der unter ganz bestimmter Bedingungen gezüchtet wird.

Gegenstand der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Dextranase, das dadurcl· gekennzeichnet ist, daß man einen zur Gattung Flavobacterium gehörenden, Dextranase biosynthetisie renden Mikroorganismus in einem Kulturmedium, da; ein Dextran als Induzierungsmittel enthält, bei einei Temperatur von 5 bis 31 C und bei einem pll-Wen von 5,5 bis 8,5 züchtet und die darin akkumulierte Dextranase aus dem Medium gewinnt.

Als Mikroorganismus verwendet man vorzugsweise Flavobacterium FERM-P Nr. 1194, Flavobacteriurr. FERM-PNr. 1285, Flavobacterium FERM-PNr. 1286 Flavobaclerium FERM-P Nr. 1287 oder Flavobacterium FERM-P Nr. 1288 (diese Mikroorganismer werden nachfolgend abgekürzt als BK-Ol, BK-03 bi< BK-06 bezeichnet).

Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung des Ver !ahrens der Erfindung erfolgt die Züchtung des Mikro Organismus im Kulturmedium unter Verwendung eine; Dextrans als Induzierungsmittel, das durch einen Zahn karies verursachenden Mikroorganismus gebildet wird

Durch die Verwendung von Dextran als Induzierungsmittel erhält man nach dem erfindungsgemäßer Verfahren die Dextranase in einer hohen Ausbeute Die erfindungsgemäß hergestellte Dextranase hai außerdem eine außerordentlich hohe Hydrolyse-Aktivität gegenüber Dextran, so daß hierdurch ein wirksamer Schutz gegen Zahnkaries erzielt werden kann

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbaren, zur Gattung Flavobacterium gehörenden Mikroorganismen haben gemeinsam die folgenden Eigenschaften:

a) Morphologische Eigenschaften

1. Form und Größe der Mikroorganismenzellen Stäbchen (etwa [1,0-3,0) ■ (0,5-0,7] am)

2. Polymorphismus der Zellen j.,

3. Motilitiit ■ nicht-molil

4. Sporenbildung nein

5. Gram-Färbung negativ

6. Säiirebeständigkeit nein

3 4

Eigenschaften auf verschiedenen Nährmedieu

gutes Wachstum, Kolonien sind ringförmig, halb- !. Nähr-Aga'i""—- kugelförmig oder flach, tautropfenartig, glatt und

undurchsichtig; glänzende und viskose gelbe, nicht-

dilfundierende Pigmente

gutes Wachstum

₂. Nähr-Schruga^r _BUlcs Wachstum

_3iHährbruhe ^ _1J<>ii;il,_in__{f ;<},,_!ltj_ne Wachstum an der Oberfläche der Kultur entlang der

Durchstoßen von

Bouillon-Gelatine

5, Lakmus-Milch

6. Kartoffel

hysiologische Eigenschalten

durchstoßenen Linie, keine Verflüssigung Wachstum unter geringem Sauerwerden gutes Wachstum, gelbe Kolonien

der Wachstumsbedingungen -lempciu.^.w--iich der Wachstumsbedingungen

2. Verhalten gegenüber Sauerstoff

3. Reduktion von Nitraten

4. Methylrot-Test

5. Voges-Proskauer-Test

6. lndol-Test

7. Bildung von Schwefelwasserstoff

8. Hydrolyse von Stärke

9. Ausnutzung von Citrat

10. Pigmentbildung

11. Urease

12. Oxidase

13. Catalase

14. Säurebildung aus Kohlenstoffquellen

(1) L-Arabinose

(2) D-Xylose

(3) D-Glucose

(4) D-Mannose

(5) D-Fructose

(6) D-Galactose

(7) Maltose

(8) Saccharose

(9) Lactose

(10) Trehalose

(11) D-Sorbit

(12) D-Mannit

(13) Inosit

(14) Glycerin

(15) Stärke

d) Sonstige Eigenschaften

1. Beständigkeit gegenüber Natriumchlorid

2. Oxidation von Gluconsäure

3. Hydrolyse von Arginin

Aufgrund der vorstehenden Versuchsergebnisse gehören die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen nach ihren Eigenschaften unter Bezugnahme auf das »Manual for the Identification of Medical Racteria«. S. T. Cowan et al, Cambridge Univ. Press.

etwa 5,5 bis etwa 8,5

etwa 5 bis etwa 31 C

fakultativ anaerob

Nitritbildung

negativ

positiv

negativ positiv (nicht-diffundierend)

negativ

positiv

negativ

positiv etwa 0-2,5 Gew./Vol.-% negativ

negativ y's Manual of

lenoumv". .)iv^_u Λ al, 7. Aulli: gramnegative Stäbchen, die ι --„:.:., r»viii!i«f.-nnsitiv sind

Säure bilden, zur Gattung I-Iavobacterium.

Die erfindungsgemäß bevorzugt verwendeten HavobacteriumsUimme FERM-P Nr. 1194, 1285, 1286, i 287 und 1288 sind bei dem »Technical Research Institute of Microbial Industry, Agency of Industrial 5 Science & Technology«, Japan, hinterlegt. Es können auch andere, zur Gattung Fluvobacterium gehörende Mikroorganismenstämme sowie alle Mutanten erfindungsgemäß verwendet werden, die aus den vorstehend beschriebenen Mikroorganismen durch verschiedene übliche Variationsverfahren hergestellt werden können und in der Lage sind, Dextranase zu bilden, z. B. solche Mutanten, die Stärkehydrolyse-negativ sind und keine gelben Kolonien bilden.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfallrens wird der zur Gattung Flavobacterium gehörende. Dextranase bildende Mikroorganismus in einem natürlichen oder synthetischen Nährmedium gezüchtet. Das erfindungsgemäß verwendete Nährmedium kann flüssig oder fest sein, für die großtechnische Herstellung von Dextranase wird jedoch vorzugsweise eine Submerskultur mit einem flüssigen Nährmedium verwendet.

Als Nährstoffquellen können erfindungsgemäß alle üblicherweise für die Züchtung eines Mikroorganismus verwendeten Quellen eingesetzt werden. Als Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff können z. B. Materialien, wie Dextran, Glucose, Saccharose, Maltose, lösliche Stärke u. dgl., verwendet werden. Als Stickstoffquelle können in dem Nährmedium beispielsweise Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Caseinhydrolysat, Ammoniumsalze (wie Ammoniumphosphat) u. dgl. verwendet werden. Als anorganische Salze können beispielsweise die Magnesium-, Kaliumsalze von Phosphorsäure u. dgl. verwendet werden. Die bei der Züchtung angewendete Temperatur liegt zwischen etwa 5 und etwa 31 C, vorzugsweise zwischen etwa 20 und etwa 30'C, der pH-Wert des Nährmediunis wird auf einen Wert zwischen etwa 5,5 und etwa 8,5, vorzugsweise zwischen etwa 6,5 und etwa 7,5, eingestellt. Die Dauer der Züchtung variiert in Abhängigkeit von den übrigen Züchtungsbedingungen, sie beträgt in der Regel etwa 3 bis etwa 7 Tage in einer stationären Kultur und etwa 1 Tag in einer Submerskultur. Die Kulturbrühc, in welcher der Mikroorganismus unter den obengenannten Bedingungen in reichlichem Maße gewachsen ist, wird steril zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit wird abgetrennt und der dabei erhaltene Rückstand wird zur Gewinnung von roher Dextranase mil Wasser oder einer geeigneten Puller- so lösung, z.B. einem M/15-Phosphalpuffcr mit einem pH-Wert von 6,5, extrahiert. Die dabei erhaltene rohr Dextranase kann als Endprodukt verwendet werden. Fs kann aber auch zweckmäßig sein, unter Anwendung verschiedener Verfahren, beispielsweise durch Konzcn- ss tralion unter vermindertem Druck, durch Ausfüllung durch Aussalzen, durch organische Lösungsmittelextraktion und Kolonnenfraklionicrung, die allein oder in Kombination angewendet werden können, eine gereinigte Fn/ymlösung herzustellen. (u>

Das erfindungsgemäß hergestellte Dexlranaseprodukt enthält hauptsächlich Endodcxtranase. Dies ergibt sich daraus, daß beispielsweise ein Dextran mit einem Molekulargewicht von 2(K)OOOO durch Kolonncnchromatographie an durch Mischpolymerisation mit <<s Mcthylenbisacrylamid vernetzten Polyacrylamidgelen (gelegentlich auch als Bio-Gel bezeichnet) bei 37 ( innerhalb von 5 Minuten /u einem Dextran mit einem Molekulargewicht von 20 000 bis 40 000 hydrolysiert wurde und daß bei Einwirkung des erfindungsgemäß hergestellten Enzyms eine schnelle Verringerung der Viskosität des dabei erhaltenen Dextrans festgestellt wurde.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Fig. 1 und 2 der Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 in graphischer Form die Ergebnisse der Kolonnenchromatographie unter Verwendung des obengenannten Polyacrylamidgels. Dabei ist auf der Abszisse jeweils das Volumen des Eluats in cm'¹ und auf der Ordinate der Zuckergehalt in ixg/cnv, gemessen nach dem Anthrone-Verfahren (vgl. F. A. Loewus, »Analytical Chemistry«, 24, 219 (19521) angegeben.

Bei der Erstellung der Kurven wurde ein Dextran mit einem Molekulargewicht von 2 000 000 in einer Menge von 1,0 Gcw./-Vol.-%mit dem erfindungsgemäß hergestellten Enzym bzw. einer handelsüblichen Vcrgleichs-Dextranase in gleichen Mengen gemischt, die Mischung wurde bei 37 C 5 Minuten lang bei einem pH-Wert von 5,8 stehengelassen und dann wurde die Kolonnenchromatographie an einem Polyacrylamidgel durchgeführt (Kolonnen: l,1cmX55cm, Eluierungsmittel: M/50 Carbonat-Bicarbonat-Pufferlösung bei pH 10,0, Eluicrungsgeschwindigkeit 14 cm'/Std.). Die Kurve (1) bezieht sich auf das Dextran mit einem Molekulargewicht von 2 000 000 vor der Behandlung mit Dextranase, die Kurve (2) bezieht sich auf das Dextran nach der Behandlung mit Dextranase von BK-03 und die Kurve (3) bezieht sich auf das Dextran nach der Behandlung mit einer handelsüblichen Vergleichs-Dcxtranase.

Aus den in der Kurve 1 dargestellten Ergebnissen geht hervor, daß das erfindungsgemäß hergestellte Enzym eine ausgezeichnete hydrolytische Wirkung auf das durch Zahnkaries verursachende Mikroorganismen gebildete Dextran hatte (vgl. J. Jablon et al. »J. Bacteriol.«, 92, 1950, 1%6).

Die Fig. 2 zeigt in graphischer Form die Ergebnisse, die erhalten wurden, wenn rohe Enzymlösungcn aus BK-03 einer Kolonncnchromalographic bzw. Gelfiltration gemäß Fig. 1 unter Verwendung verschiedener Dcxtranc, die von verschiedenen Slrcplocoecenstämmcn gebildet wurden, unterworfen wurden. Aul der Abszisse ist das Volumen in cm' angegeben, während auf der Ordinate die Kohlenhydrate als Glucose in ;j.g/cm angegeben sind. Die oberste Reihe der Kurve zeigt eine Kontrollprobc ohne Verwendung von Dextranase an, die mittlere Reihe gibt die Ergebnisse wieder, die bei einer Indti/ierung mit Dextrar mit einem Molekulargewicht von 10 000 erzielt wurden, während die unterste Reihe die Ergebnisse angibt, die bei der Induzierung mit AIlT-Dextran erhallen wurden. Aus der Fig. 2 ist ersichtlich, daß da; durch das lndu/icrungsniiltcl AHTDextran gehildeti Dextran vollständig hydrolysiert wurde zu einen Dextran mit einem niedrigen Molekulargewicht.

Es hat sich gezeigt, daß dem Niihrmcdium ein Ocn trän als Induzicmngsmitlcl einverleibt werden muli wenn hohe Ausbeuten an Dextranase erzielt wenlei sollen. Besonders gute Ergebnisse in bezug auf (Ii Verbesserung der llviliolyseaktivitiit der crfindungs gemäß hergestellten Dextranase gegenüber Devlia werden erhalten, wenn als lnduzierungsmiltel ein sol dies Dextran zugeset/t wird, das durch einen /ahr karies verursachenden Mikroorganismus gebildi wird (Dextran AIIT).

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfallrcn hergestellte Dextranase oder ein Präparat davon ist hei einem ρH-Wert von etwa 4,0 bis etwa 8,5 aktiv, wobei die maximale Aktivität bei einem pH-Wert von etwa 6,5 bis etwa 7,5 auftritt. Sie ist bei einer Temperatur von etwa 55' C oder weniger stabil.

Die erfindungsgemäß hergestellte Dextranase kann leicht in eine Zahnpaste oder in ein Zahnpulver, in eine Einreibsalbe oder in eine Einreiblotion, in ein Mundwasser, in ein Kaugummi, in ein Nahrungsmittel, in ein Getränk oder in einen Wasserstrahl-Zahnreiniger in einer solchen Menge eingearbeitet werden, daß diese Produkte etwa 1000 bis etwa 200 000 Einheiten Dextranase pro g Produkt enthalten (vgl. die belgische Patentschrift 7 18 645).

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher erläutert.

Beispiel

61 ITüssiges Kulturmedium (eingestellt auf einen pH-Wert von 7,0), das 1,5 Gew.-/Vol.-% Polypepton, 0,1 Gew./Vol.-% Hefeextrakt, 0,2 Gcw./Vol.-% Monokaliumphosphat, 0,2 Gew./Vol.-% Monoammoniumphosphat, 0,1 Gew. /Vol. -% Magnesiumsulfat und 0,5 Gew./Vol.-% Dextran mit. einem Molekulargewicht von 10 000 enthielt, wurden in einen 10-1-Fermentierbehälter gegossen und sterilisiert. Dann wurde das Medium mit den in der folgenden Tabelle I angegebenen Stämmen von zur Gattung Flavobactcrium gehörenden Mikroorganismen beimpft. Die Züchtung erfolgte unter Rühren und unter Belüftung bei 30 C für einen Zeitraum von 20 bis 24 Stunden.

Die dabei erhaltene Kulturbrühe wurde zur aseptischen Abtrennung des lebenden Mycels zentrifugiert. Die dabei erhaltenen Zellen wurden mit einer M/l 5-PhosphatpulTerlösung durch Zugabe von 10% Zellen (bezogen auf das Naßgewicht der Zellen) zur Lösung unter Rühren der dabei erhaltenen Mischung 2 bis 3 Tage lang bei 36 C extrahiert. Der dabei erhaltene Extrakt wurde zur Abtrennung einer überstehenden l-'lüssigkcit zentrifugiert und in dem nachfolgenden Verfahren als rohe Enzymlösung verwendet.
Die Aktivität des wie oben hergestellten Enzyms wurde unter Verwendung von handelsüblicher Dextranase als Kontrolle unter Anwendung der nachfolgenden Verfahren zur Bestimmung der Aktivität ermittelt:

Versuch 1

Dextran mit einem Molekulargewicht von 70 000 und ein durch einen Zahnkarics verursachenden Strepioeoeeus-Stamm gebildetes Dextran (Dextran AIIf) wurden als Substrat verwendet, /u lOi-nv' einer 1 (iew./Vol.-%igen Lösung jedes Dcxlrans wurden -tem¹ einer 0,1 M Accialpufferlösung und I cn/ der rohen En/ymlösung zugegeben. Die dabei erhaltene Mischung wurde 30 Minuten lang hei einem pll-Wcrl von 5,8 bei 37 C stehengelassen, dann wurde nach dem Somogyi Verfahren (vgl. M. Somogyi »J. lliol.

Chem.«, 160, 60 |1945]) eine erhöhte Menge an reduzierendem Zucker festgestellt.

Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 angegeben, wobei die Ergebnisse in Einheiten pro cm¹ der rohen Enzymlösung angegeben sind. Eine Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die zur Freisetzung von 1 ηιμ Μ reduzierendem Zucker pro Minute erforderlich ist.

Tabelle I

I-Iavobacterium-	Substrat	Substrat
Stanini	(Dextran mit einem	(AlIT-
	Molekulargewicht	Dextran)*
	von 70 000)
BK-Ol	263	243
BK-03	591	524
BK-04	311	296
BK-05	295	260
BK-06	142	125
Kontrolle**	368	231

* = J. M. Jahlon el al »J. Bactcriol.«, 92, 1950, 1966
** = l"/iiigc (Gcw./Vi)!.)-Lösung

Versuch 2

ν) Zu IO cm¹ einer 5 Gew./Vol.-%igcn Lösung von Dextran mit einem Molekulargewicht von 2 000 000 wurden 4 cm³ einer 0,1 M Acctatpufferlösung und 1 cm³ der rohen Enzymlösung zugegeben. Die Mischung wurde bei einem pH-Wert von 5,8 bei 37 C

.15 stehengelassen. Dann wurde die für die Abnahme der Anfangsviskositäl des üextrans bis auf die Hälfte erforderliche Zeit mittels eines Ostwald-Viskosimeter nach den Angaben in der japanischen Patentanmeldung Nr. 8067/1969 bestimmt. Die dabei erhaltener Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II angegeben

Tabelle Il	/ur Verminderung der Anfangsviskositiit
l'lavo-	bis auf die Hüllte erforderliche Zeit
•15 baclerium-	(Min.)
Stiimm	20
BK-Ol	7
.„ HK-03	17
^>O BK-04	19
BK-05	31
BK-06	38
Kontrolle

Aus ilen vorstehenden Ergebnissen geht hervor, dal es sich bei dem urfindungsgemäß hergestellten Un/yn um lindodexlranase handelt, die durch eine höhen Viskositälsverringerung als Produktivität in beug au reduzierende Ztii ker charakterisiert ist.

I liiT/11

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Dextranase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen zur Gattung Flavobacterium gehörenden, Dextranase biosynthetisierenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das ein Dextran als Induzierungsmittel enthält, bei einer Temperatur von 5 bis 31 C und bei einem pH-Wert von 5,5 bis 8,5 züchtet und die darin akkumulierte Dextranase aus dem Medium gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Flavobacterium FERM-P Nr. 1194, Flavobacterium is FERM-P Nr. 1285, Flavobacterium FERM-P Nr. 1286, Flavobacterium FERM-PNr. 1287 oder Flavobacterium FERM-P Nr. 1288 einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch I und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Züchtung des Mikroorganismus im Kulturmedium durch Verwendung eines Dextrans als Induzierungsmittel durchgeführt wird, das durch einen Zahnkaries verursachenden Mikroorganismus gebildet wird.