DE2011935A1 - Enzym und Verfahren zu dessen Herstellung sowie dessen Verwendung in Mitteln zur Verhütung von Zahnkaries - Google Patents

Description

Enzym und Verfahren zu dessen Herstellung sowie dessen Verwendung in Mitteln zur Verhütung von Zahnkaries

Die Erfindung betrifftein Enzym; welches die Fähigkeit zur LyοIyse von Mikroorganismen (d.h. die Fähigkeit zum Auflösen des Mikroorganismus unterZerstörungder Zellwände) besitzt sowie ein verfahren zur Herstellung dieses Enzyms; die Erfindung betrifft außerdem neue Mittel bzw· Präparate zur Behandlung und Verhütung von Zahnkaries sowie Methoden» die zur verhütung und Behandlung von Zahnkaries dienen.

Bei dem erfindunge ge mäßen Enzym handelt es s ion um ein Enzym« welehee die Fähigkeit zur Lyolyse der Zellen von Zahnkaries erzeugenden Mlkroorganlenen wie karlogene streptokokken und Lactobacillus aufweist. Dieses Enzym wird erfindungsgemäß hergestellt/ indem man einen Mikroorganismus derArt Streptomyoes zUohttt.

009Ö60/1817

Seit von Miller I890 darauf hingewiesen worden ist, daß Zahnkaries von Bakterien hervorgerufen wird, sind die Ursachen der Zahnkaries aus mikrobiologischer Sicht von vielen Forschern untersucht.worden. I960 hat Fitzgerald berichtet, daß Karies bei Hamstern experimentell durch Streptokokken hervorgerufen werden kann (The Journal of the Amerioan Dental Association, Band 61, Seiten 9 - 19, i960). Kürzlich ist berichtet worden, daß Zahnablagerungen oder die Entwiok^ lung von Karies unterdrückt werden kann, wenn man das durch kariogene Streptokokken erzeugte Dextran mit Hilfe eines Enzyms "Dextranase" zersetzt und so Zahnablagerungen entfernt (Fitzgerald et al; Archives Oral Biology, Bd. 13, Seiten 125 - 128, I968). Weiterhin hat man versucht, das Wachstum von Zahnkaries erzeugenden Bakterien mit Hilfe verschiedener Medikamente zu unterdrücken und so die Zahnkaries zu verhüten oder zu behandeln. Es 1st jedoch bisher nicht versucht worden, durch Verwendung eines Enzyms die Bakterien zu lyolysieren und abzutöten.

Erfindungsgemäß ist jetzt ein Verfahren zur Verhütung und Behandlung der Zahnkaries durch direkten Angriff auf die die Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen und dadurch der Verminderung des Wachstums derselben untersucht worden. Dabei ist gefunden worden, daß die Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen wie kariogene Streptokokken und Laotobaoillus zu den Mikroorganismen gehören, die nur sohwierig der Lyolyse zugänglich jsind. Sie lassen sich weder duroh Eiweiß-Lysozym nooh duroh Enzyme, die von den Kulturen verschiedener Arten von Mikroorganismen, z.B. von Kulturen von Streptomyoes albus, Streptomyoes grlseus oder Stämmen der Art Flavobakterium, erzeugt werden, lyoly.-s leren, obwohl daa Eiweiß-Lysozym ebenso wie die von den genannten Mikroorganismen produzierten Enzyme bekannte, die Zellwände der Bakterien angreifende Enzyme sind.

Als Ergebnis der Prüfung vieler Arten von Mikroorganismen, die im Boden und in Gewässern existieren, zum Zweck der Entdeckung eines Enzyms, welohes zur Lyolyse der Zellen von Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen befähigt ist, konnte jetzt festgestellt werden, daß

009850/1817 K bad

ι 20113

einige Stämme, die zur Art gtreptomyces gehören, ein Enzym erzeugeji, welches auf Zahnkaries erzeugende Mikroorganismen stark lyolysierend einwirkt.

Zu den Stämmen, die ein Enzym erzeugen, welches zur Lyolyse der Zellen von Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen befähigt ist, und die erfindungsgemäß isoliert werden konnten, gehören folgende, von denen jeweils ein Vertreter bei der American Type Culture Collection, U.S.A. (im folgenden als ATCC bezeichnet) und dem Fermentation Research Institute, Agency of industrial Science and Technology, Japan (im folgenden als FiSRM bezeichnet) hinterlegt worden sind; Stamm S-I (ATCC No. 21481: FERM-P No. 326), Stamm H-191 (ATCC No. 21482: FERM-P No. 327) und Stamm H-402 (ATCC No. 21483: FERM-P No. 328).

Die morphologischen Eigenschaften sowie Kultureigenschaften der Stämme sind in der folgenden Tabelle I zusammengestellt.

009850/1817

Tabelle I

Stamm S-I Stamm H-19I

Stamm H-4-02

Mikroskoplsche
Beobachtung des
Luftmycels

Lang, gerade;
keine Spiralen oder Ringe unter den Sporophofcen; Sporen kugelförmig Luftmycel pulvrig weiß;
Sporophoren gerade* oder
wellig, keine Ringe;
Sporen zylindrisch .

Luftmycel gebrochene Zweige; Sporophoren ge rade, keine Spiralen, keine Ringe; Sporen ku gelförmig

α>
σι
ο

a) Kultureigenschaften aus verschiedenen Medien

1) Czapek's Sehr starkes braunes

Agar Wachstum; bauawollgraues

Luftnycel; lösliches Pigment rötlichbraxm Sehr starkes hellgrünes
Wachstum; pulvriges grauweißes Luftmycel; kein
lösliches Pigment

Sehr sehwaches dünnes Oberflächenwachstum; pulvrig weißes bis gelbes Luftmycel; kein lösliches Pigment

2) Glucose*
Aaparagin-A gar

Sehr starkes rötlichbraunes Wachstum; baumwollartiges Luftmycel; Veränderung des Mediums von weiß nach grau; lösliches Pigment rötlichbraun

Mäßiges hellgrünes Wachstum; pulvriges weißes
Luftmycel;
kein lösliches Pigment

Gutes Wachstum, gefaltet, ausgebreitet oliv-gelblichbraun bis cremefarbig; dünnes, pulvrig cremeweißes bis grau-oliv-gelblichbraunes Luftmycel; kein lösliches Pigment

3) Starke-Agar

Sehr starkes braunes Wachstum;

baumwollartiges Luftmycel

Mäßiges hellgraugrünes

Wachstum; pulvrig weißes

Luftmycel;

kein lösliches Pigment

Sehr schwaches Wachstum, Unterseite dumpfgelb; pulvriges graues Luftmycel; kein lösliches Pigment .

4) CaloiunemlAt. Glyoerin-Agar

Sehr starlets rötliohbraunes Wachstum; pulvriges. grauweißes Luftmycel; lösliohes Pigaent hellrötlichbraun

Maßiges hellgrünes Wachstum, pulvriges weißes Luftmycel; kein lösliches Pigment ,

Starkes Wachstum, ausgebreitet hellgelb; pulvriges weißes bis gelbes Luftmycel; lösliches Pigment schwachgelb

5)

OberfULotenrlng; loein Luftreel·; Bmguiation; le» in· Äptemtoation; löelichea Pigaeat hellrot Oberflächenring; kein Luftmycel; Koagulation; keine Peptonisatlon; . loein lösliches Pigment

Oberflächenring; Luftmy- <?el cremegrün; Koagulation mit rascher Peptonisation, wird alkalisch

ο 6) Kartoff»!

Starkes »ohraepligeb Wachstaau Harbreränderung von geJJb-imch dunkelbraun; grauweißes Luf teycel; lös-

dunkelbraun Starkes schrumpliges hellbraunes Wachstum; grauweißes Luftmycel; , lösliches Pigment grauweiß

Ausgezeichnetes schrumpliges Wachstum, welches sich nach braun verändert; Luftmycel grau bis oliv- . gelblichbraun

Zl 7) Gelatie»

Waenstiui an der Oberfläche ili η ifilpy WHj kein LuftayeeJL; itisliefaBs Pignent dunkeUBPeim

Wachstum an der Oberfläche;

kein Luftmycel; kein lösliches. Pigment

Schwach cremefarbig; rasche Verflüssigung; Luftmycel weiß bis grau; kein lösliches Pigment

8) Tyrosi»-

A gar

Sehr starkes Wachstum Schwaches Wachstum; Unterseite gelb bis hellbraun; Luftmycel schwachbraun; , kein lösliches Pigment

9) Nähraagar

3*lar starkes rötlichbraunes Wachstum; braumwollfarbig graues Luftnjyeel; lösliches Pigment rötlichbraun

Mäßig starkes dunkel- Sehr starkes Wachstum,

grünes Wachstum; pulvri- Unterseite weiß bis ges grauweißes Luftmyeel; braun; dünnes pulvrikein lösliches Pigment . ges hellgraues Luftmyeel; Pigment hellbraun

b) Physiologisohe E igenschaften ο 1) Gelatine-Vero flussigung

JJ 2) Stärke- ^ Hydrolyse

_a 3) Reduktion von Nitrat

4) Zersetzung von Zellulose

5) Optimale Temperatur

6) Optimaler pH-Wert

Positiv Positiv Positiv Negativ

20 - 50°C

6,5 - 7,5 aerobisch Positiv
Positiv
Negativ
Negativ

20 - 3O⁰C

6,5 - 7,5 aerobisch

Positiv Positiv Positiv Negativ

20 - JO⁰C

6,5 - 7,5 aerobiscn

O
CD

Ο»

cn

OO

ο) Verwendung der Saccharide

Rharanose Xylose

Lactose Sucrose

Arabinose Raffinose Fructose Mannose ,: ^Inositol Galactose Sorbitol Glucose Mannitol

++ •FF

201193S

— ο ·»

Auf der Basis der vorstehenden morphologischen Eigenschaften und Kultureigenschaften konnte eine Klassifizierung der Stämme naoh Bergey's "Manual of Determinative Bacteriology", 7. Ausgabe und Waksman,'s "The Aotinomyoetes" vorgenommen werden* Die Stämme S-I und H-I91 sind offensichtlich als Streptomyoes diastatoohromogenes bzw. Streptomyoes farinosus einzuordnen. Der Stamm H-402 ist Streptomyoes griseus analog aber etwas von diesem unterschieden, und zwar hinsiohtlioh der Pigmentproduktion; so ist die Farbe des Pigmentes von H-402 eher gelb, orange oder graubraun als grün. Es handelt sich infolgedessen offensichtlich um eine neue Art der Streptomyoesreihe, welche als Streitomyoes griseus var. H-402 bezeichnet worden ist.

Das erfindungsgemäße Enzym kann duroh Züchtung eines Mikroorganismus der Art Streptomyoes hergestellt werden, welcher die Fähigkeit besitzt, ein Enzym zu erzeugen, daß seinerseits die Fähigkeit zum Lyolysieren von Zellen von Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen aufweist, insbesondere eines Wildstammes von Streptomyoes dlastatoohromogenes, eines Wildstammes von Streptomyoes farinosus oder Streptomyoes griseus var, H-402.

Das erfindungsgemäße Enzym kann auch erzeugt werden, indem man Mutanten der beschriebenen Mikroorganismen verwendet, z.B. solche die duroh natürliche Mutation entstehen, oder solohe, die duroh Mutationsmittel, z.B. Röntgenstrahlen, Ultravloletstrahlen, Stickstoff-Lost-Verbindungen u.a. gebildet worden sind·

Erfindungsgemäß wird der Mikroorganismus der Art Streptorayoes in einem geeigneten Kulturmedium gezüchtet, welohes die geeigneten aaooharide, Stickstoffquellen, anorganischen Salze usw. sowie ggf. organische stlmulantien enthält, so daß sieh das gewüneohte JCntym in dem Medium anreichern kann.

Geeignete Saccharide, die in der erfindungsgemttßen Kultur verwendet werden können, sind beispielew·ist Qluoose, Maltoee, Maleextrakt, Stärk· u. ä. Als Stiokstoffquelle kommen beispielsweise «norgftni« sehe Stickstoff quellen wie Ammoniumnitrat, Amraoniuneulfat, Ammohl·» umchlorid, Natriumnitrat, Kaliumnitrat u. ä. sowie organiaoh·

009850/1817 _BAD original

Stickstoffquellen wie Hartstoff, Pepton, Sojabohnenextrakt, Hefeextrakt, Fleischextrakt u.a. in. Frage. Geeignete anorganische Salze sind beispielsweise Natriumchlorid, Dikaliumphosphat, Dinatriumphosphat, Magnesiumsulfat, Ferrisulfat, Zinksulfat, Calciumchlorid u. ä. Als organische StimuläntLen können beispielsweise Vitamine wie Vitamin B, und Vitarain B₂* Pepton, Fleischextrakt., Maisweiohwasser u.a. eingesetzt werden.

Der pH-Wert des Mediums soll vorzugsweise zwischen β und 9, noch besser zwischen 7 und 8 liegen und mit Hilfe von Säure wie Chlorwasserstoff säure oder .Essigsäure oder durch Basen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Ammoniumhydroxid eingestellt werden.

Die Züchtung kann unter Anwendung beliebiger bekannter Kulturmethoden, z.B. ruhende Kultur, SchütteIkultur oder Tauohkultur, bei 20 4o°C, vorzugsweise 25 - 37⁰C durchgeführt werden« Die Züohtungsdauer kann mehrere Stunden bis zu einigen 10 Tagen, vorzugsweise 1 bis 10 Tage umfassen.

Die auf diese Weise gewonnene Kulturbrühe, die das gewünschte. Inzym enthält, kann in üblicher Weise isoliert, aufgearbeitet und gereinigt werden. Beispielsweise kann die Kulturbrühe mit Hilfe einer Zentrifuge abgetrennt werden; der überstehenden Flüssigkeit kann wasser oder eine Pufferlösung* 3, B. Aoeta.tpuffer, Phosphate puffer, Tris^malefttpuff·*?!' Triaputfir prlß-Höl-Puffer) u#a. zugesetzt werden, so dAÖ man eine Enzyralösung,, erhält, die im folgenden als Brühenenzymlöfung bezeichnet wird. Die überstehende Flüssigkeit kann a uoh in üblicher ^eiee durch Auasalzen mit Ammoniumsulfat, Auefallen mit Aceton, Dialyse und/oder Chromatographie über PhosphoreÄuregel, Carboxyraethyloelluloae oder "Sephadex" gereinigt . werden, worauf jioh dann die Zugabe des Wassers oder der Pufferlösung anschlieflt, 50 daa man «ine gei¹«inigte Enzyrnlösiuig «rhält, Sie im folgenden auch als solche, d.h. als gereinigte Enzymlösung bezeichnet wird» Diese Enzymlösungan ktinner·. auah der Gtfrisrtroakr' nung unterworfen werden, so da 13 man ein g«t;-Qokn*t(fB Enaymproduict

^i ^Ä— -■ - ■■" ■;:.= 009860/

201193S

- Io -

erhält. Beide Enzymlösungen wie auch das getrocknete Enzymprodukt können für die Herstellung von Präparaten zur Verhütung und Behandlung von Zahnkaries gemäß der Erfindung verwendet werden.

In den Figuren 1 und 2 der beiliegenden Zeichnung ist das Verhältnis zwischen pH-Wert und lyolysierender Wirkung des Enzyms auf die Zellen von Mikroorganismen dargestellt, und zwar bei Anwendung
erfindungsgemäß hergestellter Enzymlösungen auf caTiogene Streptokokken. In Figur 1 wurde als Enzymlösung eine Brühenenzymlösung verwendet; in Figur 2 handelte es sich bei der Enzymlösung um gereinigte Enzymlösung. Aus den Figuren j5 und 4 der Zeichnungen erkennt man die Stabilität der erfindungsgemäß hergestellten ünzymlösungen, und zwar wurden die ünzymwirkungen im Falle der Konservierung der Enzymlösungen bei verschiedenen pH-Werten in 24 stunden bei 4⁰C bzw. 37⁰C verglichen«, Aus Figur 5 der Zeichnungen ergibt sioh das Verhältnis zwischen Temperatur und relativer Wirkung der Enzymlösungen gemäß der Erfindung, wobei die Wirkung der bei 37°C zur Reaktion gebrachten Enzymlösung als Standard (100) benutzt wird.

Daβ erfindungsgemäß hergestellte Enzym besitzt die Fähigkeit zum Jiyolysleren von Zellen von Mikroorganismen über einen weiten pH-lereloh, wie sioh aus den Figuren 1 und 2 ergibt· Der optimale
pH-Wert für das er findungs gemäße Enzym liegt bei etwa 6 im Falle von Brühenenzymlösung - vgl. Figur l -, während sioh der optimale pH-Wert int Falle der gereinigten Enzymlöaung mit der Zugabe der Pufferlösung mehr oder weniger verändert und zwischen 5,4 und 7,9 liegt, wie man aus Figur 2 erkennt.

Der pH-Bereloh, in welchem die erfindungegeraäßen Enzymlösungen beständig sind und überlegen· lyolysierende Wirkung gegen dl· Zellen von Mikroorganismen zeigen, zwisohen 5 und 9j der Bereioh verändert sioh mehr oder weniger mit der Konservierungstemperatur der Inzymlöaung-, was man aus den Figuren 3 und 4 erkennt. Di· optimale Temperatur liegt bei etwa 55°C, vgl· Figur 5· Das trfin«. dungogemüfl· Sniym iat In der Hitze ziemlioh unbeständig; es verlor sein· Aktivität fast vollständig, wenn es bei 8O⁰O 20 Minuten lcona.rvl.rt wurd·. ^^ _mpBCim

* u._et 009850/1817

"2011938

. - Ii -

Die Einheit und das Reduktionsverhältnis der Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms wurde naoh der folgenden Methode berechnet· 0,4- ml einer Suspension intakter Zellen oder erhitzter Zellen von Mikroorganismen, die der Lyolyse unterworfen werden sollen, 2 ml einer Enzymlösung, die auf die entsprechende Konzentration verdünnt war, und 1,6 ml eines 0,025 m Acetatpuffers (pH 6,0) wurden vermischt und ergaben insgesamt 4,0 ml. Die Mischung wurde bei 30 oder 27°C 5 - 60 Minuten gehalten, so daß die zellenlyolysierende Reaktion eintreten konnte. Anschließend wurde die optische Dichte des Reaktionsgemisches bei 600 m^ auf einem photoelektrischen Colorimeter.gemessen; die Einheit und das Reduktionsverhältnis der Aktivität wurden nach den im folgenden erläuterten Gleichungen berechnet. Eine Einheit bedeutet dabei den Wert, bei dem das Reduktionsverhältnis der optischen Dichte von 1 ml der Enzymlösung nach der zellenlyolysierenden Reaktion 0,001 pro Minute beträgt, verglichen mit dem Wert, der vor der Reaktion festgestellt wurde. Zur Kontrolle wurden 2 ml Wasser anstelle von 2 ml Enzymlösung verwendet.

Einheit « ' ■ ■ * — ■

0,001·t*ν 0,001·t·ν

a: Optische Dichte der Reaktionsmischung bei 600 nyu bei der Reaktionsdauer 0 «Konzentration der Zellen;

b: Optische Dichte der Reaktionsmischung bei 600 nm nach der Zeit t;

ο: Optische Dichte der Kontrollösung bei 600 nyu nach der Zeit t;

t; Reaktionszelt (Minuten);

ν: Volumen der ursprünglicluinicht verdünnten Enzymlösung.

Redukt ionsverhältnis

/ Optische Dichte der\ / Optische Dichte der ( Kontrollösung nach 1 - I Enzymlösung nach \ der Reaktion / \ der Reaktion

'X 100

Optische Diohte der Kontrolllösung nach der Reaktion

0ΊΤ9850/1817

Das erfindungsgemäße Enzym kann spezifisch verschiedene Arten von Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen angreifen und besitzt gegen diese eine überlegene zellenlyolysierende Wirkung. Das erfindungsgemäße Enzym kann infolgedessen zur Verhütung und Behandlung von Zahnkaries bei Menschen verwendet werden.

Das Enzym kann auch zur Verhütung und Behandlung von Zahnablagerungen verwendet werden; letztere werden ebenfalls duroh Zahnkaries hervorrufende Mikroorganismen herbeigeführt und rufen ihrerseits Zahnkaries hervor. Die Entwicklung von Ablagerungen an den Zähnen wird als Ergebnis der Verhütung und Behandlung von Zahnkaries durch das erfindungsgemäße Enzym mitausgesohaltet.

Das erfindungsgemäße Enzym kann zur Verhinderung und Behandlung von Zahnkaries beim Menschen nach üblichen Methoden, üblichen Einheitsdos ierungsf ormen sowie zusammen mit üblichen Trägermaterialien verwendet werden. Übliche Trägermaterialien können beispielsweise Wasser, Zahnpulver, Zahnpasta, Kaugummi, Salben usw. sein.

Bei der Herstellung von Zahnpasta und Zahnpulver, die das erfindungsgemäße Enzym enthalten, können übliche Trägermaterialien verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie keine unerwünschte Wirkung auf die Aktivität des Enzyms ausüben. Es können übliche wasserunlösliche Poliermittel enthalten sein. Als Poliermittel kommen beispielsweise Dicalciumphosphat, Trioaloiumphosphat, Magnesiuraoarbonat u. ä. in Frage. Diese Poliermittel machen im allgemeinen den Hauptgewiohtstell der festen Bestandteile aus. Der Gehalt an Poliermittel soll vorzugsweise etwa JO - 60 Gewichts-^, bezogen auf das Gesamtpräparat, bei Zahnpasta und 85 - 95 Gewiohts-# bei Zahnpulver ausmaohen. Das erfindungsgemäße Enzym soll in Mengen von etwa 1 - 5.OOO Einheiten pro Gramm enthalten sein.

ORIGINAL INSPECTED

009850/1817

■■ 2011933-

Bei der Herstellung von Zahnpasta können Weichmacher in die Mischung aus pulverförmigem Trägermaterial gebracht werden, so daß man eine Paste erhalte Geeignete Weichmacher sind beispielsweise Wasser, Glycerin, Sorbitol und/oder Propylenglykol u.a. Es kann vorteilhaft sein, dem Präparat ein gelierend wirkendes Mittel wie Uatriumcarboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Iragacanthgummi u.a. zuzusetzen. Gegebenenfalls kann man auch noch weitere Komponenten, z.B.. Aromastoffe, Süßstoffe und Farbstoffe zusetzen. Bei der Säuberung der Zähne mit einer Zahnbürste oder einem linger, auf welchen Zahnpasta oder Zahnpulver mit dem erfindungsgemäaaen Enzym ausgebreitet ist* werden die auf den Zähnen befindlichen Zah"nkaries erzeugenden Mikroorganismen duroh das Enzym lyolyaiert und Ablagerungen auf den Zähnen werden entferntj die Zähne werden vollständig sauber»

Eine entsprechende Wirkung kann erzielt werden, wenn man einen Kaugummi benutzt, der das erfindungagemässe Enzym enthält₀

Zur Herstellung von Kaugummi» der daa erfinäungsgemässhergestellte Enzym enthält, kann man WIioh·Kautecfcukroftetoffe wie Ohiole-Harz, Polyvinylacetat tt#ö. verwenden, Ea können auöh noch andere Substanzen wie WeiohmaoheriGtlattungemittel, Zucker, Aromaatoff· und larbetoffe augeeetat werden. Der Gehalt an Enzym soll 1 bie 5000 Einheiten pro Gramm dee Präparates betragen, . ;■/:"■ ■-:.-. _'■_-,■.._.. ".■■■■■..■_.■■ ;■,;■":-.;_ " r ^: ^;.-.. ■;■;'; .-0^-; y_ ;^:

Sine weitere aögliohe Yerwendungafor« für dae erfindungegemäße Snaym iet der Zueat· au Salben, line tolohe Salbe mit de« erfindungegeaäeeen Eneym wird auf die Sinne aufgebracht, die dann aneohlieeeend mit einem linger oder »it einer Zahnbürste gerieben werden. Zur Hereteilung der Salben beiw. linreibungen kann man Trägermateriallen verwenden, die üblioherweise für solche in den Mund *u bringend* ι Einreibungen bβ»w, Salben herangezogen werden» reraufgeeetit, dad kiln· «erβtorend· Wirkung auf dae erfindungsgenieae Enzym auegetbt wird. Hin geeigneter Grund·toff für eine linreibung der genannten Art eind Materialien wie Glyoerra und latriUMoarboxyuethylcelluloee, die geleeartige oder oremige •alben ergeben. Der Gehalt an dem erfindungigeaässifn kann bei 2-3 000 linhtiten pro Gramm

009850/1817

Das erfindungsgemässe Enzym kann auch mit Hilfe eines Mundspülmittels, welches aus das Enzym enthaltendem Wasser besteht, an die zu behandelnden Zähne gebracht werden. Das Wasser soll das erfindungsgemässe Enzym in Mengen von etwa 0,1 - 50 Einheiten pro Milliliter enthalten. Das Mundspülmittel kann außerdem Antibiotika oder andere sterilisierend wirkende Substanzen enthalten. Das Mundspülmittel mit dem erfindungsgemäseen Enzym kann auch in 3?orm eines Sprays vorliegen.

In Fällen der Verwendung eines Mundspülmittels kann es günstig sein, den Mund anschliessend nicht mit klarem Wasser auszuepülen, weil es wünschenswert ist, das Enzym möglichst lange auf die Zähne einwirken zu lassen.

Das erfindungsgemässe Enzym kann auch in form einer Kautablette (Drops) zur Anwendung kommen. Durch Kauen der Tablette oder Liegenlassen im Mund kommt das Enzym eine ausreichend lange Zeit in Berührung mit den Zähnen. Zur Herstellung der Kautabletten mit dem erfindungsgemässen Enzym kann man übliche Trägermaterialien wie Mannitol und Sorbitol, übliche Gleitmittel, Süßstoffe, Parbatoffe usw. verwenden* Der G-ehalt an Bnzym soll in einer Bpeierungeeinheit 1-5 000 Einheiten betragen.

Das erfindungsgemäsee Enzym kann auch mit Konditorwaren wie Keksen» !Kuchen uiw. vermischt werden·

Schließlich lit es auoh Möglich, das eriindungsgsmässe Enzym Sahrungemitteln oder Getränken zuzusetzen. IULt Zugabe des Snsyms su Jfahrungsmitteln oder Getränken kann Vor oder naoto. der Verarbeitung derselben erfolgen.

Tür die Verwendung des erfiadungsgemässen Bnzyms zur Verhütung und Behandlung von Zahnkaries kommen auoh moon andere Methoden j als die beschriebenen infrage. Sei der Herstellung von Präparaten, die das erfindungsgemässe Enzym enthalten sollen, ist jedoch au beachten} daß dieselben nioht erhitzt werden dürfen, weil das erfindungsgemässe Bnaym in der Wärme instabil iet| gegebenenfalls muss das Enzym jaaoh der Wärmebehandlung bezw. dem Iraitzen zugesetzt werden. Das Enzym kann mit Hilfe geeigneter Stabilisatoren

009850/1817 original inspected

wie 'nichtionische Detergentien, Polysaccharide u.a. stabilisiert werden.

Die Menge des erfindungsgemässen Enzyms, die bei der Herstellung der genannten Präparate zur Anwendung kommt, kann sich je nach der Art eines bestimmten Präparates und den Methoden der Anwendung derselben verändern} im allgemeinen wird man Mengen von 1 bis 5 000 Einheiten, vorzugsweise 10 - 3000 Einheiten des Enzyms auf einmal zusetzen*

Das erfindungsgemässe Enzym zeigt keinerlei loxizität oder unerwünschte Nebenwirkungen, selbst dann nicht, wenn es über eine sehr lange Zeit benutzt wird. Wird das erfindungsgemas.se Enzym heruntergeschluckt, so wird es im Magen deaktiviert oder zersetzt und verwandelt sich in harmlose Aminosäuren. Im Gegensatz dazu haben fast alle Antibiotika, die üblicherweise zur Bekämpfung der verschiedenen Arten von Mikroorganismen eingesetzt werden, schädliche Wirkungen auf die Mikroflora des Magen-Darm-Träktes*

Das erfindungsgemässe Enzym zeichnet sich auch dadurch aus, daß es unter den Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen keine Stämme gibt, die gegen das Enzym resistent sind, wogegen die Mikroorganismen gegen fast alle Antibiotika resistent sind_e

Durch die Anwendung des erfindungsgemässen Enzyms werden nicht nur Zellen der Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen lyolysiert und so Zahnkaries verhütet, sondern durch die Anwendung, werden die Zähne selbst sehr weiß, obwohl hierfür keine Gründe angegeben werden können.

Das erfindungsgemässe Enzym kann nicht nur die Zellen von Zahnkaries erzeugenden Mikroorganismen lyolysieren, sondern auch außerdem die Zellen verschiedener anderer Arten von Mikroorganismen, so insbesondere von grampositiven Bakterien, insbesondere solchen die zur Art Baoillus und lactobacillus gehören.

Die Herstellung des erfindungsgemässen Enzyms sowie die Herstellung von Präparaten, die das Enzym enthalten, sind in den

,^-,-,,,v«. . 009850/1817

folgenden Beispielen dargestellt. Soweit nicht ausdrücklich etwas anderes angegeben let, bedeuten die prozentualen Mengen (#) bei der Zusammensetzung dee Mediums Gewichtsprozent pro Volumen.

Beispiel 1

Ein Schräg&bden-Agarmedium, welches 1 i» Glukose, 0,2 $> Pepton, 0,1 io Hefeextrakt, 0,1 i> I¹IeIsohextrakt und 1,5 $> Agar enthielt, wurde mit de» isolierten Stamm H-191 inokuliert und 7 Tage bei 50⁰O kultiviert· Die Agar-Sohrägkultur wurde dann mit 5 ml sterilisiertem Wasser versetzt, wodurch die Sporen ausgewaschen wurden, so daß man eine Sfisorensulpension erhielt. 0,5 ml der so erhaltenen Suspension wurden als Impfmaterial für eine ruhende Kultur in einem 200 ml Roux-Kolben verwendet, der 50 ml eines flüssigen Mediums (pH 7,5) mit 0,5 i» Glukose, 0,5 # Pepton, 0,5 1> Natriumchlorid!, 0,2 $> Dikaliumphosphat, 0,1 i» Magnesiumsulfat, 0,004 $> Calciumchlorid, 0,002 # ferrisulfat und 0,01 $> Zinksulfat enthielt; Äie Kultur wurde 7 Tage bei 30⁰C gehalten. Die danach vorliegende Kulturbrühe wurde abzentrifugiertj die überstehende Flüssigkeit wurde mit destilliertem Wasser verdünnt, so daß man eine Enzymlösung mit dem zehnfaohen Volumen erhielt, mit welcher die Einheit berechnet wurde.

In getrennten Versuchen wurden verschiedene Arten von oarlogenen Streptokokki, die der Lyolyse unterworfen werden sollten, jeweils in Mengen von 3 bis 4 Platinschi-eifen zum Impfen von ruhenden Kulturen in 200 ml - Kolben verwendet. Die Kolben enthielten 190 ml eines flüssigen Mediums (pH 7,4) mit 2 i» Glukose, 1 + Pepton, 1 96 Fleischextrakt, 0,5 1* Natriumchlorid, 0,2 # Hefeextrakt, 1 i» Natriumacetat und 1 χ lO^rhManganeulfat; die Kulturen wurden ami Tage bei 37⁰Q belassen. Di· erzeugten Zellen wurden mit Hilfe einer Zentrifuge geerntet und eweimal mit Wasser gewaschen. Die geernteten Zellen wurden dann in 10 ml destilliertem Wasser dispergiert und durch Erhitzen auf 100⁰O (20 Minuten) sterilisiert. Die attriliiiertt Dispersion wurde dann als zu prüfend· Prob· verwendet.

009850/1817

Zu 0,4 ml einer zu prüfenden Probe wurden 2 ml der wie vorstehend beschrieben erhaltenen Enzymlösung sowie 1,6 ml eines 0,025 m Acetatpuffers (pH 6,0) gegeben, so daß maneine Gesamtmenge von 4 ml erhielt. Man ließ die Eeaktion mehrere 10 Minuten bei 37⁰O in der Mischung ablaufen. Die optische Dichte der Reaktionsmischung wurde dann auf einem photoelektrischen Oolarimeter bei 600 πψ gemessen! das Eeduktionsverhältnis der zu lyolysierenden Mikroorganismen wurde nach.-#er weiter vorn beschriebenen Gleichung berechnet, lie Ergebnisse sind in der Tabelle II zusammengestellt.

Mikroorganismen,

die lyolysiert werden

sollen

Cariogener Streptokokkus (AHT) oariogener Streptokokkus (BHT) Oariogener

Streptokokkue (HHT) Oariogener

Streptokokkui (HS-6). Gariogener

S tr ep tokokkue (£-1~E)/ Oariogener

Streptokokkue (ϊΑ-1)

Tabelle II ^ :	68
	' . 70 .
Reduktionsverhältnis (^) Eeaktionsdauer Eeaktionsdauer 10 Min. ; -.;■ ■'. 20 Min.	70
34	72'
36	.-■■■ -. ■' 67
37 ..·■.■	- 7t ;■■":
32 -: ■
-"."' V" ■■'■'■. 36-:. -

■ - - - . -_ BtÜp/itl 2 :'■'-::■ - ■- ■■■_ - ■-'." '-.'■

Der iiolierte St»a» K-402 wurdt in d#r in Beiepiel I beeohrie- btntn Wti·· g»eüohttt, «o dafl man tint Enzymlöeung erhielt· ^«,ntljen wurden uiibtioaadigtft, feilen von cariog«n«Hi3tröpto- kokkue (BHT) «benfall· in der in Beiipiel 1 bseoiiri^benen Weise gezüohtet, »o dafl κ&η «ine Probe für die Prüfverßuohs erhielt. -

Mit der Enzymlösung und der Prüfprobe wurde die lyolyse der Zellen in der in Beispiel 1 bescliriebenen Welse durchgeführt; das Reduktionsverhältnis der zu lyolysierenden Mikroorganismen wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle III enthalten.

Volumen der Enzymlösung,

0,01 0,10 0,20 0,40

Tabelle III	Reduktionsverhältnis {$>)	Reaktionsdauer
	Reaktionsdauer	10 Min.
5 Min.	10
5	34
16	73
37	98
58

Beispiel 3

Der isolierte Stamm H-402 wurde in der in Beispiel S beschriebenen Weise gezüchtet und die dabei gewonnene Kulturbrühe wurde abzentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde als Brühenenzymlösung verwendet. Ausserdem wurde die überstehende Flüssigkeit duroh Sättigen mit Ammoniumsulfat zwischen 30 und 90 # weiter ausgesalzt. Der entstandene Niederschlag wurde in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7»5) gelöst und der Dialyse unterworfen. Der Lösung wurde dann so viel Aceton zugesetzt, daß der Aoetongehalt 40 ?6 betrug. Nach dem Abtrennen des entstandenen Niederschlags wurdt ein« weitere Menge Aceton zu der überstehenden Iltissigkeit gegeben, so daß die Aoetonmenge jetzt 60 j£ betrug. Der entstandene Hledersohlag wurde in der bereits erwähnten Pufferlösung g·-* löst und d«r Dialyse unterworfen.

009850/1817

. ν 2011936

Zn. der danach überstehenden Flüssigkeit gab man 10 96 einer wässrigen Calciumchloridlösungj der entstandene niederschlag wurde wieder entfernt. Die jetzt überstehende Flüssigkeit wurde als gereinigte Enzymlösung verwendet.

Getrennt wurde cariogener Streptokokkus (,1HT),' in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise kultiviert. Die gewonnenen Zellen wurden der Gefriertrocknung unterworfen und dann in destilliertem Wasser dispergiert, so daß man eine Probe für die Untersuchung erhielt·

Zu 0,4 ml der zu untersuchenden Probe gab man 2,0 ml 0,025 m Acetatpuffer (£H 6,0) und 1 ml der Brühenenzymlösung, die mit destilliertem Wasser auf das 10fache Volumen verdünnt war, oder 1 ml der gereinigten Enzymlösung, die mit destilliertem Wasser auf das 500fache Volumen verdünnt war, so daß man insgesamt 4,0 ml erhielt. Man ließ die Mischung 30 Minuten bei 37⁰C reagieren. Die -optische Dichte der Reaktionsmischung wurde dann bei 600 m/A gemessen und die Einheit des Enzyms und das Reduktionsverhältnis des zu lyolysierenden Mikroorganismus wurden nach der weiter vorn angegebenen Gleichung berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt_β

	Tabelle IV	Reduktionsverhältnis ($)
	Einheit	81
Brühenenzymlö sung	135	48
gereinigte Enzymlösung	4000
	Beispiel 4

Der isolierte Stamm H-402 wurde in der in Beispiel 1 beschriebe- _; ne.n Weise gezüchtet* Mit der gewonnenen Enzymlosung wurde die. Lyolyse der Zellen Verschiedener Arten von Mikroorganismen in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise durchgeführt) die Einheit wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt.

009850/1817

2011933

Tab·!!· f

Mikroorgani«men, di· lyolytitrt werden Einheit'..

(1) örampoiitirt Bacteria

Cariogener strtptoltoiucu· (BHX.) 95 Strtptokokkut ialivariu· 90,7 Streptokokku· lacti· 13,3 Strtptokokktii "bovi· 17,t Strtptokokku» fatoalit 105,5 KLkrokokkut lsrioAtiktioat 16,2 Sarcina lute* - 12,9 Staphylokokku* albue 34,2 Staphylokokkut aurtut 25,7 Bacillus eubtilie POI 219 153,9 Baoillue ephaeriou· 199,5 Baoillue megateriUÄ 28,0 Tetrakokkue eoyat 12,9 Lactobacillus aoidophllue 36,8

^ LactobacilluB arabinoeus 73,6

LactobaoilluB bulgarioue 25,9 LaotobaoilluB oasei 8,6

Laotobaoillus hioohi ΙΪ0 3o77 20,1 LaotobaoillUB hioohi IEO 3o78 31,6 Laotobacillue hioohi IFO 3o79 20,1

(2); Gramnegativ· Baoterien

Eecherichia ooli 3,8 Aeromonas hydrophila 5,7 Arthrobacter ■implex 6,7

Proteus OH-9 2,2

Cellulomonae flavigena 13,3

ilarobaoteriuM ttttroaromatioua 16,7

Petudomonae fluorttotxie 17,1 Pseudomonas aeruginota 14,7

RAD 009850/1817 ^BAD

^: " - 21·- . ■.■"■'.■

Beispiel 5

Der isolierte StammH-4Q2 wurde in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise gezüohtet und die gewonnene Kulturbrühe wurde abzentrifugiert. Die überstehende jiüssigkeit wurdedurch Sättigen mit Ämmoniumeulfat im Bereich von 30 bis 90 # ausgeealzt. Der entstandene Niedereohlag wurde in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7f5) gelöst und der Dialyie untwrworftn. Die lösung wurde dann mit so viel Aoeton versetzt, daß sichein Äoetöngehalt von 40 i* ergab. Jfaoh der Entfernung de· entstandenen'Niederschlages wurde die überstehende Ilüeeigkeit weiter mit Aoeton versetzt, so daß der Aoetongehalt jetzt 60 ^ betrug. Der entstandene Niedereohlag wurde in der bereits genannten Pufferlösung gelöit und der Dialyse unterworfen. Zu der entstandenen überstehenden flüssigkeit gab man eine TOjfcLge wässrige Caloiumchloridlösung und entfernte den Niederschlag. Die überstehende Flüssigkeit wurde der Öefriertrooknung unterworfen, so daß man eine Enzymprobe mit einer Aktivität von 544 Einheiten pro Milligramm erhielt. Die Enzymfrobe wurde für den folgenden-Versuch verwendet.

Pur den Versuoh wurden Goldhameter, die 21 Tage alt waren, verwendet und mit einer oariogenen Diät gefüttert (Krasset Archives Oral Biology, Bd, 10, Seite 215, 1965)» Es wurde dann sichergestellt, daß im Maul keine Streptomyoin-resistenten Bakterien existierten. Danach wurde ein Streptomycin-resistenter Stamm von cariogenem Streptokofckus (,K-I-E) In die Baokentaschen der Hamster ©Ingeführt. Mn© Gruppe der"Hamster erhielt !Trinkwasser, welches 7,5 Einheiten pro Milliliter des erfindungsgemässen Ensyms enthielt. Etwa 10 ml des (Drinkwassers wurden pro Sag getrunken. Die andere Gruppe der Hamster erhielt trinkwasser welohes kein En^ym enthielt« Auch in dieser ©ruppe wurden pro !Dag etwa 10 ml QSrinkwaassr getrunken« Probaa von 2akaablagerungen wurdea mit Hilf ο ein.©® Stäbchen® aiii -welohem ©telge Sage »aeh dew? Χΐι£®Μ,ίοη

0860/181

Die Proben wurden in einer Heftextraktlösung diepergiert, die dann gegebenenfalls mit destilliertem Wasser verdünnt wurde. Sie Lösung wurde zum Impfen von Mitia ealivarius-Agarmedium verwendet, welohes Streptomyoin enthielt, und bei 37⁰G 40 Stunden inkubiert| ansohlieesend wurden die entstandenen Kolonien gezählt. Sie Ergebnisse sind in den Tabellen VI und VII zusammengestellt. In den Tabellen sind die Ergebnisse von Proben nach 7 bezw, 11 Tagen angegeben·

Tabelle VI

Anzahl der Kolonien (ζ 1θ')

Kontrollversuoh Versuch »it Eneym (ohne Enzym)

371 2

9 0

19 O

2. <:l

173 0

3 <1

28 Ό

	Tabelle VII	ίο3)
Anzahl c	Lar Kolonien (x	Versuch mit Enzym
Kontroll\rersueh (ohne Enzym)		O O O 1 3
151 öl 14 21 Ά

¹1 ;

■ ;; ^: ; , '- V ' 2011S3S

>■·-&■ .-.■■- ν.. ■* 23V ■ ;"..■ ;■■■■■■■

Beispiel 6

Es wurde eine Zahnpasta ait folgender Zusammensetzung hergestellt!

Glycerin	25,70
Natriuacarboxymethylcelluloee	0,95
deetilliertee Wasser	20,15
Dicalciumphosphat	46,00
Galoiumoarbonat	5,80
Saccharin	0,25
Aroma	0,65
Brühenenzymlösung gemäss Betpiel 3	0,50

geeamt 100,00

Beispiel 7

Ee wurde ein Zahnpulver mit folgender Zusammensetzung her gestellt:

Natriumlauroylsaroosid 3

Natriumcarboxyme-fehyloellulose 1

Dinatriumphosphat 2

Saooharin ^ 0,2

Aroma 1,8

Enzymprobe gernäss Beispiel 5 0,01

Moaloiumphosphat Restmenge

009850/1817

Claims (9)

tmmmmm ' jfa^ |- JUtH

1. Enzym alt der Fähigkeit eur Lyolyee der Zellen ton Zahn- !caries erseugenden Mikroorganiiüen, welche· durch Züchtung eines Mikroorganismus der Art Streptoayces erseugt worden ist.

2. Enzym nach Anspruch Ιψ dadurch gekennzeichnet,daft der Mikroorganismus aus einem Wildstamm von Streptomyces diastatochromogenes oder einer Mutante dbses Stammes besteht.

3. Enzym nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ein Wildstamm τοη Streptomyces farinosue oder eine Mutante dieses Stammes ist.

4. Enzym nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daft der ,Mikroorganismus aus Streptomyces griseus var. H-4o2 oder einer Mutante desselben besteht.

5. Verfahren zur Herstellung eines Enzyms nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daft man einen Mikroorganismus der Art Streptomyces suchtet und das erseugte Enzym aus der Kulturbrühe isoliert.

6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennseiohnet, daft der Mikroorganismus ein Wildstamm von Streptomyces diastatochromogenes oder eine Mutante dieses Stammes ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennseichnet, daft der Mikroorganismus ein Wildstamm von Streptomyces farinosus oder eine Mutante dieses Stammes ist.

8. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennseiohnet, daft der Mikroorganismus aus Streptomyces griseus var. H~4o2 oder einer Mutante desselben besteht.

009850/1817

9. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dafi die Züchtung bei 20 bit 4O°C in einer Zeitspanne» die mehrere Stunden bis zu einigen 10 Tagen umfaftt, durchgeführt wird.

Io. Verwendung des Enzyms nach Anspruch 1-4 als Wirkstoff in einem Präparat zur Verhütung und Behandlung von Zahnkaries. .

Für- ■..--..■■ ■ ν .-.-. ■ ^v--:-- ■■ Dainippon Pharmaceutical Co.,Ltd. Osaka / Japan

Kethtsftinralt

009850/1817

Leerseite