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Die
Erfindung betrifft eine Mutanase enthaltende, orale Zusammensetzung.
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Es
wird allgemein angenommen, dass Zahnkaries durch Bakterien in der
Mundhöhle,
wie Streptococcus mutans und Streptococcus sobrinus, welche aus
unlöslichen
Glucanen zusammengesetzten Zahnbelag bilden, verursacht wird. Bakterien
erzeugen im Zahnbelag Säuren
unter Demineralisierung von Zähnen,
wodurch Zahnkaries verursacht wird.
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Eine
wirksame Maßnahme
zur Entfernung des Zahnbelags ist die Verwendung von Enzymen, welche in
der Lage sind, unlösliche
Glucane, welche Zahnbelag bilden, zu zersetzen. Die unlöslichen
Glucanmoleküle sind
hauptsächlich
aus α-1,6-glucosidischen
Bindungen und α-1,3-glucosidischen
Bindungen in einer komplexen Weise zusammengesetzt. Es ist im Fachgebiet
bekannt, dass Dextranase, die zur Spaltung von α-1,6-Bindungen fähig ist,
und Mutanase, die zur Spaltung von α-1,3-Bindungen fähig ist,
wirksam sind zur Unterdrückung
der Zahnbelagsbildung. Orale Zusammensetzungen, welche entweder
Dextranase oder Mutanase enthalten, sind bekannt, wie in den japanischen
Patenten Nr. S48-034897 und S55-050006 beschrieben.
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Dextranase
und Mutanase greifen Zahnbelag an unterschiedlichen Stellen an.
Die JP-S57-165312 beschreibt, daß die kombinierte Verwendung
von Dextranase und Mutanase eine wirksamere Unterdrückung der Zahnbelagsbildung
ergibt als die einzelne Anwendung.
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Bislang
ist jedoch nur eine begrenzte Anzahl an Mutanasen auf dem Markt
erhältlich.
Es sind keine Mutanase enthaltenden, oralen Produkte, wie Zahnpflegemittel,
im Markt verfügbar.
Der Grund hierfür
besteht darin, dass derzeit verfügbare,
kommerzielle Mutanasen keine ausreichende Stabilität wie eine
Wärmestabilität und Stabilität innerhalb
einer Zusammensetzung aufweisen, obwohl eine solche Stabilität zur Einmischung in
orale Zusammensetzungen, wie Zahnpflegemittel und Mundwasser notwendig
ist. Wenige Handelsprodukte mit stabiler Mutanase sind ständig vorrätig.
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JP 08 012541 A betrifft
eine Oralzusammensetzung, welche eine Kombination von Mutanase und
einer Fluorverbindung umfasst.
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JP 04 099713 A betrifft
eine Oralzusammensetzung, welche Mutanase und ein spezifisches Tensid
sowie andere Bestandteile umfasst.
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EP 0 414 297 A1 betrifft
ein Verfahren zur Herstellung von Proteasen aus spezifischen Bacillus-Stämmen. Es
ist angegeben, dass diese spezifischen Bacillus-Stämme
zur Exprimierung von Proteasen vom Wild-Typ nicht in der Lage sind.
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WO
97/38669 A1 betrifft Zusammensetzungen zur Entfernung von Zahnbelag,
die eine Dextranase sowie eine Mutanase und wahlweise andere Enzyme
enthalten. WO 97/38669 A1 ist gemäß § 3(2) Nr. 2 PatG nur für die Beurteilung
der Neuheit des vorliegenden Anmeldungsgegenstandes relevant.
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US 5,290,916 A beschreibt
DNA-Sequenzen, welche für α-1,3-Glucanase
und Dextranase kodieren. Bei der α-1,3-Glucanase
handelt es sich um ein Enzym, welches Bacillus circulans BC-8 entstammt.
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JP 08 012544 A betrifft
eine Oralzusammensetzung, welche eine Kombination von Dextranase
mit Mutanase, Triclosan und/oder Biosol umfasst.
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JP 08 012543 A umfasst
eine Oralzusammensetzung, welche eine Kombination eines nichtionischen Tensids,
Dextranase und Mutanase umfasst.
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Ein
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine neue und verbesserte
orale Zusammensetzung vorzusehen, in welcher Mutanase in stabiler
Weise eingebracht ist und welche wirksam ist zur Unterdrückung der
Zahnbelagsbildung und Entfernung von Zahnbelag.
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Dieses
Ziel wird durch eine orale Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, beziehungsweise
gemäß Ansprüchen 2 bis
4 erreicht. Eine vorteilhafte Ausführungsform des Anmeldungsgegenstandes
ist in Anspruch 5 angegeben.
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Gegenstand
der Erfindung ist daher eine orale Zusammensetzung, umfassend Mutanase,
hergestellt aus einer Kultur, welche erhalten wird durch Kultivieren
eines Mutanase produzierenden Mikroorganismus, welcher zur Gattung
Bacillus mit einer negativen Protease-Produzierbarkeit gehört,
umfassend
Mutanase mit den folgenden physikochemischen Eigenschaften (1) bis
(9):
- (1) Wirkung: Fähigkeit zur Spaltung von α-1,3-glucosidischen
Bindungen von Mutan,
- (2) Substratspezifität:
Fähigkeit
zur wirksamen Zersetzung von Mutan,
- (3) optimaler pH: pH 4 bis 4, 5 bei der Einwirkung auf ein Mutansubstrat
bei 35°C
während
10 Minuten,
- (4) pH-Stabilitätsbereich:
pH 4 bis 10, wenn über
24 Stunden bei 25°C
gehalten,
- (5) optimale Temperatur: 50 bis 65°C bei der Umsetzung bei pH 5
mit Mutan als Substrat,
- (6) Wärmestabilität: die Enzymaktivität bleibt
stabil unterhalb 50°C
nach Inkubation bei pH 5 über
10 Minuten.
- (7) Wirkung von Metallionen: Quecksilber und Silber zeigen eine
Inhibitorwirkung auf einem Mutansubstrat,
- (8) Wirkung von Inhibitoren: p-Chlorquecksilberbenzoesäure zeigt
Inhibitorwirkung auf einem Mutansubstrat, und
- (9) Molekulargewicht: 140.000 bis 160.000, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
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Die
erfindungsgemäße orale
Zusammensetzung ist äußerst wirksam
zur Verhinderung von Zahnbelag, da Mutanase zur Unterdrückung der
Zahnkariesbildung und Entfernung von Zahnbelag wirksam ist.
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Die
kombinierte Verwendung von Dextranase und Mutanase ist noch wirksamer
zur Unterdrückung der
Zahnbelagsbildung.
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Die
Erfindung wird anhand der Zeichnungen näher erläutert. Hierbei sind die
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1, 2 und 3 Diagramme,
welche den optimalen pH von Mutanase A, B und C zeigen;
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4, 5 und 6 Diagramme,
welche die pH-Stabilität
von Mutanase A, B und C zeigen:
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7, 8 und 9 Diagramme,
welche die optimale Temperatur von Mutanase A, B und C zeigen;
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10, 11 und 12 Diagramme,
welche die Wärmestabilität von Mutanase
A, B und C zeigen.
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Kurz
gesagt, sieht die Erfindung eine orale Zusammensetzung vor, welche
eine spezielle Mutanase umfaßt.
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Die
orale Zusammensetzung kann als Zahnpflegemittel, wie Zahnpasta,
Zahnpulver und flüssiges Zahnpflegemittel,
Mundwasser, Mundspülmittel,
Zahnfleisch-Massagecreme, Mundpaste, Gurgeltabletten, Gebißreiniger,
Kaugummi und Pastillen sowie in fester, flüssiger und Pastenformen hergestellt
werden.
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Die
hierin verwendete Mutanase ist eine aus einer Kultur hergestellte
Mutanase, welche erhalten wird durch Kultivieren eines Mutanase
erzeugenden Mikroorganismus, der zur Gattung Bacillus mit negativer
Protease-Produzierbarkeit
gehört.
Das Einmischen dieses Mutanasetyps ergibt eine orale Zusammensetzung
mit den Fähigkeiten,
Belag in wirksamer Weise zu zersetzen und in wirksamer Weise Karies
zu verhindern, während
dieser Mutanasetyp in der oralen Zusammensetzung stabil bleibt.
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Die
Mutanase erzeugenden Mikroorganismen sind hinsichtlich der Gram-Färbung vorzugsweise negativ.
Mutanase erzeugende Mikroorganismen, welche schwach positiv sind
und leicht hinsichtlich der Gram-Färbung entfärbbar sind, sind ebenso akzeptierbar.
Solche Mutanase erzeugenden Mikroorganismen umfassen erste, zweite
und dritte Mutanase erzeugende Mikroorganismen, wie nachstehend
gezeigt, obwohl sie nicht auf diese Beispiele beschränkt sind.
Jeder Mutanase erzeugende Mikroorganismus, welcher die obengenannten
Eigenschaften erfüllt
und in Anspruch 1 genannt ist, ist brauchbar.
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Die
ersten bis dritten Mutanase erzeugenden Mikroorganismen werden,
aus dem Boden isoliert. Sie gehören
zur Gattung Bacillus und weisen eine negative Protease-Produzierbarkeit
auf.
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Der
erste und der zweite Mutanase erzeugende Mikroorganismus sind weiterhin
durch die Gram-Färbung
charakterisiert. Beide zeigen negative Ergebnisse. Das Wachstum
des ersten Mutanase erzeugenden Mikroorganismus ist im Bereich von
pH 5 bis 8, 5 zu beobachten. Für
den zweiten Mutanase erzeugenden Mikroorganismus liegt der Wachstumsbereich
bei pH 5 bis 7,5. Sie sind von anderen Mutanase erzeugenden Mikroorganismen
dadurch unterscheidbar, dass sie Mutanase mit den obengenannten
physikochemischen Eigenschaften (1) bis (9) produzieren. Diese Stämme besitzen
die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften. Die folgenden Eigenschaften
sind dem ersten und zweiten Mutanase erzeugenden Mikroorganismus
gemeinsam, sofern nichts anderes angegeben ist.
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Hinsichtlich
der mikrobiologischen Eigenschaften und Identifizierung wird Bezug
genommen auf Bergey's
Manual of Systematic Bacteriology (1984) und die Gattung Bacillus
(1973).
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A. Morphologische Eigenschaften
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Wenn
Mikroorganismen auf einem Nähragar
bei 40°C
während
zwei Tagen kultiviert werden, sind die folgenden morphologischen
Charakteristika zu beobachten.
- (A-1) Form und
Größe der Zellen:
Stäbchen,
Größe 0,6 bis
1 μm × 3 bis
4 μm
- (A-2) Pleomorphismus: keiner
- (A-3) Motilität:
peritriche Geißeln,
motil
- (A-4) Sporen: es werden Sporen gebildet, welche ellipsoide Form
aufweisen und 1 μm × 1,2 bis
1,7 μm Größe haben.
Deren Positionen sind zentral oder terminal. Sporangium ist ausgedehnt.
- (A-5) Gram-Färbung:
negativ
- (A-6) Säurefestigkeit:
negativ
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B. Kultureigenschaften
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- (B-1) Nähragar-Plattenkultur:
kreisförmige,
flache und gesamte Kolonien werden gebildet. Der erste Mutanase
erzeugende Mikroorganismus bildet milchig-weiße oder creme-gefärbte Kolonien
im Mittelbereich und halbtransparente milchig-weiße oder
creme-gefärbte
Kolonien am Randbereich. Der zweite Mutanase erzeugende Mikroorganismus
bildet milchig-weiße
Kolonien im Mittelbereich und halbtransparente, milchig-weiße Kolonien
im äußeren Randbereich.
Sie sind beide glänzend
und glatt.
- (B-2) Nähragar-Schrägkultur:
Wachstum in einem Streifen oder breiten Streifen. Bildet weiße oder
creme-gefärbte
Kolonien.
- (B-3) Nähr-Flüssigkultur:
Wachstum, jedoch keine Häutchenbildung.
- (B-4) Gelatine-Stabkultur: Wachstum, jedoch keine Verflüssigung.
- (B-5) Lackmus-Milch: nicht entfärbt. Nicht verflüssigt.
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C. Physiologische Eigenschaften
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- (C-1) Reduktion von Nitrat: negativ
- (C-2) Denitrifizierung: negativ
- (C-3) MR-Test: negativ
- (C-4) VP-Test: negativ
- (C-5) pH der VP-Lösung
nach Kultivierung: 6,37 beim ersten Mutanase erzeugenden Mikroorganismus; 6,98
beim zweiten Mutanase erzeugenden Mikroorganismus.
- (C-6) Indolbildung: nicht bestimmt
- (C-7) Wasserstoffsulfidbildung: nicht bestimmt
- (C-8) Stärkehydrolyse:
positiv
- (C-9) Verwertung von Zitronensäure: Verwerten nicht in Simmon's Medium. Verwerten
nicht in Christensen's
Medium.
- (C-10) Verwertung von anorganischen Stickstoffquellen: Verwerten
Nitrate. Verwerten Ammoniumsalze.
- (C-11) Pigmentbildung: negativ
- (C-12) Urease: negativ
- (C-13) Oxidase: der erste Mutanase erzeugende Mikroorganismus
is positiv; der zweite Mutanase erzeugende Mikroorganismus ist sehr
schwach
- (C-14) Katalase: positiv
- (C-15) Wachstumsbereich:
der erste Mutanase erzeugende
Mikroorganismus
pH-Bereich 5 bis 8,5
Temperaturbereich
25 bis 60°C
der
zweite Mutanase erzeugende Mikroorganismus
pH-Bereich 5 bis
7,5
Temperaturbereich 25 bis 53°C
- (C-16) Verhalten gegenüber
Sauerstoff: aerob
- (C-17) O-F-Test: aerobe Zersetzung
- (C-18) Säure-
und Gasbildung aus Sacchariden: wie in Tabelle 1 gezeigt, worin "+" bedeutet, dass Mikroorganismen Säure oder
Gas bilden und "–" bedeutet, dass Mikroorganismen
nicht Säure
oder Gas bilden.
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D. Weitere Eigenschaften
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- (D-1) Beständigkeit
gegenüber
Natriumchlorid: Wachsen in Nähragar
in Gegenwart von 2% Natriumchlorid, wachsen jedoch nicht in Gegenwart
von 5% Natriumchlorid
- (D-2) Anaerobes Wachstum: negativ
- (D-3) Caseinzersetzung: negativ
- (D-4) Verwertung von Propionaten: negativ
- (D-5) Wachstum bei pH 6,8: positiv
- (D-6) Wachstum bei pH 5,7: positiv
- (D-7) Kristallbildung: negativ
- (D-8) Proteaseerzeugung: negativ
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Der
dritte Mutanase erzeugende Mikroorganismus ist weiterhin dadurch
charakterisiert, dass er hinsichtlich der Gram-Färbung positiv ist und leicht
entfärbt
wird. Er ist unterscheidbar von anderen Mutanase erzeugenden Mikroorganismen,
indem er Mutanase mit den obengenannten physikochemischen Eigenschaften (1)
bis (9) bildet. Sein Stamm hat die folgenden mikrobiologischen Eigenschaften.
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A. Morphologische Eigenschaften
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Wenn
Mikroorganismen auf Nähragar
bei 30°C
während
zwei Tagen kultiviert werden, sind die folgenden morphologischen
Charakteristika zu beobachten.
- (A-1) Form und
Größe der Zellen:
Stäbchen,
Größe 1 bis
2 μm × 4 bis
6 μm
- (A-2) Pleomorphismus: keiner
- (A-3) Motilität:
peritriche Geißeln,
motil
- (A-4) Sporen: es werden Sporen gebildet, welche ellipsoide Form
aufweisen und eine Größe von 1
bis 1,5 μm × 2 bis
3 μm haben.
Deren Positionen sind zentral oder terminal. Sporangium ist ausgedehnt.
- (A-5) Gram-Färbung:
schwach positiv und leicht entfärbbar
- (A-6) Säurefestigkeit:
negativ
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B. Kultureigenschaften
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- (B-1) Nähragar-Plattenkultur:
kreisförmige,
flache und ganze Kolonien werden gebildet. Die Kolonien sind weiß und nicht
glänzend.
- (B-2) Nähragar-Schrägkultur:
Wachsen in einem Streifen oder breiten Streifen. Bilden weiße oder
creme-gefärbte
Kolonien.
- (B-3) Nähr-Flüssigkultur:
Wachsen, bilden jedoch keine Häutchen.
- (B-4) Gelatine-Stabkultur: Wachsen, verflüssigen sich jedoch nicht.
- (B-5) Lackmus-Milch: nicht entfärbt. Weder verflüssigt noch
koaguliert.
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C. Physiologische Eigenschaften
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- (C-1) Reduktion von Nitrat:positiv
- (C-2) Denitrifizierung: negativ
- (C-3) MR-Test: negativ
- (C-4) VP-Test: negativ
- (C-5) pH der VP-Lösung
nach Kultivierung: 5,8
- (C-6) Indolbildung: nicht bestimmt
- (C-7) Wasserstoffsulfidbildung: nicht bestimmt
- (C-8) Stärkehydrolyse:
sehr schwach
- (C-9) Verwertung von Zitronensäure: Verwerten nicht in Simmon's Medium. Verwerten
nicht in Christensen's
Medium.
- (C-10) Verwertung von anorganischen Stickstoffquellen: Verwerten
in geringem Umfang Nitrate. Verwerten Ammoniumsalze.
- (C-11) Pigmentbildung: negativ
- (C-12) Urease: negativ
- (C-13) Oxidase: positiv
- (C-14) Katalase: negativ
- (C-15) Wachstumsbereich:
pH-Bereich 6 bis 8
Temperaturbereich
20 bis 33°C
- (C-16) Verhalten gegenüber
Sauerstoff: aerob
- (C-17) O-F-Test: aerobe Zersetzung
- (C-18) Säure-
und Gasbildung aus Sacchariden: wie in Tabelle 2 gezeigt, worin "+" bedeutet, dass die Mikroorganismen
Säure oder
Gasbilden, "–" bedeutet, dass die
Mikroorganismen keine Säure
oder Gas bilden und "±" eine schwache Bildung
bedeutet.
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D. Andere Eigenschaften
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- (D-1) Beständigkeit
gegenüber
Natriumchlorid: Wachsen nicht in Nähragar in Gegenwart von 2%
Natriumchlorid
- (D-2) Anaerobes Wachstum: negativ
- (D-3) Caseinzersetzung: negativ
- (D-4) Verwertung von Propionaten: negativ
- (D-5) Wachstum bei pH 6,8: positiv
- (D-6) Wachstum bei pH 5,7: positiv
- (D-7) Kristallbildung: negativ
- (D-8) Proteaseerzeugung: negativ
- (D-9) GC-Gehalt: 56%
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Nachstehend
wird der Unterschied zwischen Stämmen
der obengenannte Mutanase erzeugenden Mikroorganismen und Stämmen gut
bekannter Mutanase erzeugender Mikroorganismen beschrieben. Die
gut bekannten Mutanase erzeugenden Mikroorganismen umfassen diejenigen,
welche zur Gattung Pseudomonas, Gattung Flavobacterium, Gattung
Bacillus, Gattung Streptomyces, Gattung Trichoderma und Gattung
Aspergillus gehören.
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Zunächst wird
Bezug genommen auf einen Stamm von Bacillus circulans BC-8, welcher
zur gleichen Gattung Bacillus wie die obengenannten Mutanase erzeugenden
Mikroorganismen (siehe JP-S63-301788) gehört. Der erste und der zweite
Mutanase erzeugende Mikroorganismus sind in der Gram-Färbung negativ, wohingegen
der BC-8-Stamm positiv ist. Der erste und der zweite Mutanase erzeugende
Mikroorganismus bilden Sporen an zentralen bis terminalen Positionen,
wohingegen der BC-8-Stamm Sporen an einer terminalen Position bildet.
Der erste und der zweite Mutanase erzeugende Mikroorganismus zeigen
negatives Wachstum in 5% NaCl, wohingegen der BC-Stamm positiv ist.
Der erste und der zweite Mutanase erzeugende Mikroorganismus sind
positiv bei der Säureerzeugung
aus L-Arabinose, wohingegen BC-8 negativ ist. Der erste und der
zweite Mutanase erzeugende Mikroorganismus sind positiv bei der
Säureerzeugung
aus D-Xylose, wohingegen der BC-8-Stamm negativ ist. Der erste und
der zweite Mutanase erzeugende Mikroorganismus sind positiv hinsichtlich
des Wachstums bei 45°C,
wohingegen der BC-8-Stamm negativ ist.
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Der
dritte Mutanase erzeugende Mikroorganismus ist hinsichtlich der
Gram-Färbung
schwach positiv und leicht entfärbbar,
wohingegen der BC-8-Stamm positiv ist. Der dritte Mutanase erzeugende
Mikroorganismus ist motil und bildet Sporen an zentralen bis terminalen
Positionen, wohingegen der BC-8-Stamm nicht motil ist und Sporen
an einer terminalen Position bildet. Der dritte Mutanase erzeugende
Mikroorganismus ist hinsichtlich der Katalaseaktivität negativ
und bei der Nitratreduktion positiv, wohingegen der BC-8-Stamm bei
der Katalaseaktivität
positiv ist und bei der Nitratreduktion negativ ist. Der dritte
Mutanase erzeugende Mikroorganismus zeigt negatives Wachstum in
5% NaCl, wohingegen der BC-8-Stamm positiv ist. Der dritte Mutanase erzeugende
Mikroorganismus ist bei der Säureproduktion
aus D-Xylose schwach positiv, wohingegen der BC-8-Stamm negativ
ist. Der dritte Mutanase erzeugende Mikroorganismus besitzt einen
GC-Gehalt von 56%, wohingegen der BC-8-Stamm einen GC-Gehalt von
49,5% aufweist.
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Als
nächstes
wird ein Vergleich gezogen mit einem Stamm von Bacillus circulans
FERM-P4765, welcher zur gleichen Gattung Bacillus wie die obengenannten
ersten bis dritten Mutanase erzeugenden Mikroorganismen gehört (siehe
JP-S55-088693), obwohl dessen mikrobiologischen Eigenschaften unbekannt
sind. Der erste Mutanase erzeugende Mikroorganismus produziert Mutanase
mit einem Molekulargewicht von etwa 150.000, einer optimalen Temperatur
von 60°C
und optimalem pH 4, und der zweite Mutanase erzeugende Mikroorganismus
produziert Mutanase mit einem Molekulargewicht von etwa 140.000,
einer optimalen Temperatur von 65°C
und optimalem pH 4,5, wohingegen der FERM-P4765-Stamm Mutanase mit
einem Molekulargewicht von mehr als etwa 70.000 bei einer optimalen
Temperatur von 30 bis 40°C
und optimalem pH von 6,2 bis 6,7 produziert. Somit sind der erste
und der zweite Mutanase erzeugende Mikroorganismus von dem FERM-P4765-Stamm
unterscheidbar.
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Der
dritte Mutanase erzeugende Mikroorganismus produziert Mutanase mit
einem Molekulargewicht von etwa 160.000, einer optimalen Temperatur
von 50°C
und optimalem pH 4,5, wohingegen der FERM-P4765-Stamm Mutanase mit
einem Molekulargewicht von mehr als etwa 70.000, einer optimalen
Temperatur von 30 bis 40°C
und optimalem pH von 6,2 bis 6,7 produziert. Somit ist der dritte
Mutanase erzeugende Mikroorganismus von dem FERM-P4765-Stamm unterscheidbar.
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Weiterhin
gehören
die in der JP-S52-034980 beschriebenen, Mutanase erzeugenden Mikroorganismen
zu der Gattung Streptomyces, gehören
die in der JP-S50-145583 beschriebenen, Mutanase erzeugenden Mikroorganismen
zu der Gattung Flavobacterium, und die in der JP-S-47-9743 beschriebenen,
Mutanase erzeugenden Mikroorganismen sind Trichoderma hargianum,
Penicillium lilacinum, Penecillium funiculosum, Penecillium melinii
und Penicillium janthinellum. Somit sind die ersten bis dritten
Mutanase erzeugenden Mikroorganismen von diesen bekannten Mutanase
erzeugenden Mikroorganismen unterscheidbar.
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Hinsichtlich
der oben genannten Eigenschaften sind die Stämme der ersten bis dritten
Mutanase erzeugenden Mikroorganismen von diesen bekannten Stämmen verschieden.
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Wir
haben einen ersten Stamm, Bacillus sp. RM1, bei dem es sich um einen
neuen Mutanase erzeugenden Mikroorganismus handelt, beim National
Institute of Bioscience and Human -Technology, Japanese Agency of
Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungsnummer
14836 (FERM P-14836) hinterlegt. Dieser RM1-Stamm besitzt die oben
spezifizierten mikrobiologischen Eigenschaften. Der Boden, aus welchem
dieser Stamm isoliert worden ist, wurde 1994 in Ninomiya-cho, Naka-gun,
Kanagawa Prefecture, Japan, gesammelt.
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Wir
haben einen zweiten Stamm, Bacillus sp. RM4, bei dem es sich um
einen neuen Mutanase erzeugenden Mikroorganismus handelt, beim National
Institute of Bioscience and Human-Technology, Japanese Agency of
Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungsnummer
14837 (FERM P-14837) hinterlegt. Dieser RM4-Stamm besitzt die oben
spezifizierten mikrobiologischen Eigenschaften. Der Boden, aus welchem
dieser Stamm isoliert worden ist, wurde 1994 in Kusatsu Onsen, Gunma
Prefecture, Japan, gesammelt.
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Wir
haben einen dritten Stamm, Bacillus sp. M7, bei dem es sich um einen
neuen Mutanase erzeugenden Mikroorganismen handelt, beim National
Institute of Bioscience and Human-Technology, Japanese Agency of
Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungsnummer
14835 (FERM P-14835) hinterlegt. Dieser M7-Stamm besitzt die oben
spezifizierten mikrobiologischen Eigenschaften. Der Boden, aus welchem
dieser Stamm isoliert worden ist, wurde 1993 in Mitama-Fudo, Niigata
Prefectu re, Japan, gesammelt.
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Die
oben genannten RM1- und RM4-Stämme
werden aus dem Boden mittels folgendem Screening-Verfahren isoliert.
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Ein
Spatel Boden wird in 5 ml sterilisierter, physiologischer Kochsalzlösung suspendiert.
100 μl der Suspension
werden auf einem Agarmedium mit zugesetztem Mutan ausgebreitet und
bei 45°C
während
3 bis 5 Tagen kultiviert. Diejenigen Kolonien, welche einen Halo
entwickeln, werden als Mutanase erzeugender Mikroorganismus isoliert.
Der Mikroorganismus wird kultiviert und das resultierende Enzym
hinsichtlich physikochemischer Eigenschaften überprüft. Durch dieses Screening-Verfahren
wurden RM1- und RM4-Stämme
ausgewählt,
welche ausgezeichnetes Belagentfernungsvermögen und Stabilität in oralen
Zusammensetzungen zeigten.
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Mutanase
wird erzeugt durch Inokulation des RM1- oder RM4-Stammes in ein
natürliches
oder synthetisches Kulturmedium und Kultivieren unter üblichen
Bedingungen. Das bevorzugte Medium enthält für das Wachstum von Mikroorganismen
notwendige Komponenten, wie beispielsweise Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen
und anorganische Salze. Nährstoffe
für das
Medium sind diejenigen, welche herkömmlicherweise für Mikroorganismen
verwendet werden, beispielsweise Glucose, Inositol, Fructose, Mutan
und Stärke
als Kohlenstoffquelle, Pepton, Sojabohnenpulver und Hefeextrakt
als Stickstoffquelle und Salze von Phosphorsäure, Natrium, Kalium und Magnesium
als anorganisches Salz. Diese Nährstoffe
können
alleine oder in Form einer Mischung aus zwei oder mehreren eingesetzt
werden. Unter anderem sind Inositol, Mutan, Pepton und Phosphate
bevorzugt. Das Kulturmedium sollte bei pH 5 bis 8,5 für den ersten
Mutanase erzeugenden Mikroorganismus und bei pH 5 bis 7,5 für den zweiten
Mutanase erzeugenden Mikroorganismus liegen, insbesondere bei pH
7 für beide.
Die Kultivierungstemperatur sollte 35 bis 48°C, insbesondere 40°C betragen.
Der Kultivierungszeitraum beträgt
im allgemeinen 1 bis 3 Tage.
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Der
obengenannte M7-Stamm wird aus dem Boden mittels dem folgenden Screening-Verfahren
isoliert.
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Ein
Spatel Boden wird in 5 ml sterilisierter, physiologischer Kochsalzlösung suspendiert.
100 μl der Suspension
werden auf einem Agarmedium mit Mutanzusatz ausgebreitet und bei
30°C während 3
bis 5 Tagen kultiviert. Diejenigen Kolonien, welche einen Halo entwickeln,
werden als Mutanase erzeugender Mikroorganismus isoliert. Der Mikroorganismus
wird kultiviert und das resultierende Enzym hinsichtlich physikochemischen
Eigenschaften geprüft.
Durch dieses Screening-Verfahren wurde ein M7-Stamm ausgewählt, welcher ausgezeichnetes
Belagentfernungsvermögen
und Stabilität
in oralen Zusammensetzungen zeigte.
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Mutanase
wird erzeugt durch Inokulation des M7-Stammes in ein natürliches
oder synthetisches Kulturmedium und Kultivieren unter üblichen
Bedingungen. Das bevorzugte Medium enthält für das Wachstum von Mikroorganismen
notwendige Komponenten, wie beispielsweise Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen
und anorganische Salze. Nährstoffe
für das
Medium sind diejenigen, welche herkömmlicherweise für Mikroorganismen
verwendet werden, beispielsweise Inositol, Galactose und Mutan als
Kohlenstoffquelle, Pepton, Polypepton, Sojabohnenpulver und Hefeextrakt
als Stickstoffquelle und Salze von Phosphorsäure, Natrium, Kalium und Magnesium
als anorganisches Salz. Diese Nährstoffe
können
alleine oder in Form einer Mischung aus zwei oder mehreren eingesetzt
werden. Unter anderem sind Inositol, Mutan, Polypepton und Phosphate
bevorzugt. Das Kulturmedium sollte bei pH 6 bis 8, insbesondere
bei pH 7 liegen. Die Kultivierungstemperatur beträgt vorzugsweise
20 bis 33°C,
insbesondere 30°C.
Der Kultivierungszeitraum beträgt
im allgemeinen 1 bis 3 Tage.
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Bakterienzellen
werden aus dem kultivierten Medium jedes Stammes durch Zentrifugation
oder Filtration entfernt. Der Überstand
wird als Rohenzymlösung
gewonnen, welche das erfindungsgemäße Enzym enthält. Diese
Rohenzymlösung
kann direkt verwendet werden, obwohl es bevorzugt ist, sie weiter
zu reinigen. Die Reinigungsverfahren sind beispielsweise Ultrafiltration,
Vakuumkonzentrierung, Aussalzen unter Verwendung von Ammoniumsulfat
etc., Ausfällung
unter Verwendung von Ethanol etc., Ausfällung am isoelektrischen Punkt
und Säulenchromatographie.
Diese Methoden können
einzeln oder in Kombination eingesetzt werden. Die Reinigung wird
wünschenswerterweise
so lange durchgeführt,
bis eine einzelne Bande durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
bestätigt
wird.
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Es
versteht sich, dass die vorliegende Erfindung zur Erzeugung von
Mutanase ebenso anwendbar ist auf sowohl Mutanten, welche von diesen
Stämmen
abgeleitet sind, als auch rekombinante Mikroorganismen, welche das
Mutanasegen tragen.
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Gemäß dem obigen
Aspekt ist die gemäß der Erfindung
einzubringende Mutanase eine solche, welche durch Kultivieren der
obengenannten, Mutanase erzeugenden Mikroorganismen erhalten wird,
sowie eine solche mit den folgenden physikochemischen Eigenschaften.
- (1) Wirkung: Sie ist in der Lage, α-1,3-glucosidische
Bindungen von Mutan zu spalten.
- (2) Substratspezifität:
Sie ist fähig,
in wirksamer Weise Mutan zu zersetzen.
- (3) Optimaler pH: Sie besitzt einen optimalen pH-Bereich von
pH 4 bis 4,5 bei der Einwirkung auf ein Mutansubstrat bei 35°C während 10
Minuten.
- (4) Stabiler pH: Sie ist stabil im Bereich von pH 4 bis 10,
wenn sie bei 25°C
während
24 Stunden gehalten wird.
- (5) Optimale Temperatur: Sie besitzt eine optimale Temperatur
im Bereich von 50 bis 65°C
bei der Einwirkung auf ein Mutansubstrat bei pH 5.
- (6) Wärmestabilität: Ihre
Aktivität
bleibt stabil unterhalb 50°C
nach Inkubation bei pH 5 während
10 Minuten.
- (7) Wirkung von Metallionen: Quecksilber und Silber zeigen Inhibitorwirkung
auf einem Mutansubstrat.
- (8) Wirkung von Inhibitoren: p-Chlorquecksilberbenzoesäure (PCMB)
zeigt Inhibitorwirkung auf einem Mutansubstrat.
- (9) Molekulargewicht: Sie besitzt ein Molekulargewicht im Bereich
von 140.000 bis 160.000, bestimmt durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese.
-
Das
zur Spezifizierung der obengenannten Eigenschaften als Substrat
verwendete Mutan wird durch gut bekannte Methoden erhalten, beispielsweise
durch Kultivieren von Streptococcus mutans oder Streptococcus sobrinus
zur Erzeugung von unlöslichem
Glucan, und Spalten von α-1,6-Bindungen
des unlöslichen
Glucans mit Dextranase.
-
Bevorzugte
Mutanasen sind eine Mutanase, welche der erste Mutanase erzeugende
Mikroorganismus produziert (Mutanase A mit den nachfolgend gezeigten
Eigenschaften), eine Mutanase, welche der zweite Mutanase erzeugende
Mikroorganismus produziert (Mutanase B mit den nachfolgend gezeigten
Eigenschaften) und eine Mutanase, welche der dritte Mutanase erzeugende
Mikroorganismus produziert (Mutanase C mit den nachfolgend gezeigten
Eigenschaften).
-
Mutanase A
-
- (1) Wirkung: Sie ist in der Lage, α-1,3-glucosidische
Bindungen von Mutan zu spalten.
- (2) Substratspezifität:
Sie ist fähig,
in wirksamer Weise Mutan zu zersetzen.
- (3) Optimaler pH: Ihre Wirkung ist optimal bei pH 4 bei der
Einwirkung. auf ein Mutansubstrat bei 35°C während 10 Minuten und bleibt
erhalten bei pH 4 bis 6.
- (4) Stabiler pH: Sie ist stabil im Bereich von pH 4 bis 10 bei
der Aufbewahrung bei 25°C
während
24 Stunden.
- (5) Optimale Temperatur: Ihre Wirkung ist optimal bei einer
Temperatur von 60°C
bei der Einwirkung auf ein Mutansubstrat bei pH 5.
- (6) Wärmestabilität: Ihre
Aktivität
ist stabil unterhalb 60°C
und sie wird bei 75°C
inaktiviert, nach Inkubation bei pH 5 während 10 Minuten.
- (7) Wirkung von Metallionen: Quecksilber-, Silber- und Eisen
(III)-Ionen zeigen Inhibitorwirkung auf einem Mutansubstrat.
- (8) Wirkung von Inhibitoren: PCMB zeigt Inhibitorwirkung auf
einem Mutansubstrat.
- (9) Molekulargewicht: Sie besitzt ein Molekulargewicht von 150.000,
bestimmt durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese.
-
Mutanase B
-
- (1) Wirkung: Sie ist fähig, α-1,3-Bindungen von Mutan zu
spalten.
- (2) Substratspezifität:
Sie ist fähig,
in wirksamer Weise Mutan zu zersetzen.
- (3) Optimaler pH: Ihre Wirkung ist optimal bei pH 4,5 bei der
Einwirkung auf ein Mutansubstrat bei 35°C während 10 Minuten und bleibt
erhalten bei pH 4 bis 7.
- (4) Stabiler pH: Sie ist stabil im Bereich von pH 4 bis 11,
wenn sie bei 25°C
während
24 Stunden gehalten wird.
- (5) Optimale Temperatur: Ihre Wirkung ist optimal bei einer
Temperatur von 65°C
bei der Einwirkung auf ein Mutansubstrat bei pH 5.
- (6) Wärmestabilität: Ihre
Aktivität
ist stabil unterhalb 60°C
und sie wird bei 75°C
inaktiviert, nach Inkubation bei pH 5 während 10 Minuten.
- (7) Wirkung von Metallionen: Quecksilber und Silber zeigen Inhibitorwirkung
auf einem Mutansubstrat.
- (8) Wirkung von Inhibitoren: PCMB zeigt Inhibitorwirkung auf
einem Mutansubstrat.
- (9) Molekulargewicht: Sie weist ein Molekulargewicht von 140.000
auf, bestimmt durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese.
-
Mutanase C
-
- (1) Wirkung: Sie ist fähig, α-1,3-Bindungen von Mutan zu
spalten.
- (2) Substratspezifität:
Sie ist fähig,
in wirksamer Weise Mutan zu zersetzen.
- (3) Optimaler pH: Ihre Wirkung ist optimal bei pH 4,5 bei der
Einwirkung auf ein Mutansubstrat bei 35°C während 10 Minuten und bleibt
erhalten bei pH 4 bis 5.
- (4) Stabiler pH: Sie ist stabil im Bereich von pH 4 bis 10,
wenn sie bei 25°C
während
24 Stunden gehalten wird.
- (5) Optimale Temperatur: Ihre Wirkung ist optimal bei einer
Temperatur von 50°C
bei der Einwirkung auf ein Mutansubstrat bei pH 5.
- (6) Wärmestabilität: Ihre
Aktivität
ist stabil unterhalb 50°C
nach Inkubation bei pH 5 während
10 Minuten.
- (7) Wirkung von Metallionen: Quecksilber und Silber zeigen Inhibitorwirkung
auf einem Mutansubstrat.
- (8) Wirkung von Inhibitoren: PCMB zeigt Inhibitorwirkung auf
einem Mutansubstrat.
- (9) Molekulargewicht: Sie besitzt ein Molekulargewicht von 160.000,
bestimmt durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese.
-
Die
Eigenschaften der Mutanasen A bis C werden nachfolgend näher beschrieben.
-
(1) Enzymatische Wirkung
-
Mutanase
oder α-1,3-Glucanase
wird eingeteilt in einen exo-Typ mit endständiger Inzision und einen endo-Typ
mit statistischer Inzision. Es wird angenommen, dass die Mutanasen
A bis C gemäß der Erfindung die
Eigenschaft haben, α-1,3-Bindungen
im Muster des endo-Typs zu spalten.
-
Im
einzelnen wurden 50 μl
einer Mutanaselösung
gemäß der Erfindung
oder Novozym 234 (Handelsbezeichnung Novo Nordisk A/S, aus Trichoderma
hargianum stammend), die zur Zersetzung von α-1,3-Bindungen fähig ist,
zu 100 μl
einer 3%igen Mutanlösung
gegeben. Die Mischung wurde bei 37°C während 20 Stunden inkubiert.
Das Reaktionsprodukt wurde zentrifugiert, um einen Überstand
zu erhalten, welcher auf eine Dünnschichtchromatographieplatte
getüpfelt
und mit einer Mischung aus 1-Butanol/Isopropanol/Wasser =
4/7/1 entwickelt wurde. Konzentrierte Schwefelsäure wurde auf die Platte gesprüht, welche
bei 100°C
während
5 Minuten erhitzt wurde. Die Saccharide konnten als gefärbte Flecken
nachgewiesen werden. Die Flecken von mittels diesen Mutanasen gespaltenen Produkten
zeigten geringere Mobilität
als die von Glucose. Im Falle von Novozym 234 zeigte sich gleiche
Mobilität
wie Glucose. Basierend auf dieser Beobachtung bestätigt sich, daß die erfindungsgemßen Mutanasen
A bis C Enzyme vom endo-Typ sind.
-
(2) Substratspezifität
-
Die
erfindungsgemäßen Mutanasen
A bis C sind hinsichtlich der Zersetzung von Mutan wirksam.
-
Im
einzelnen wurden 100 μl
einer Lösung
der erfindungsgemäßen Mutanasen
A, B oder C (500 Einheiten/ml) während
30 Minuten mit 100 μl
einer 1%igen Lösung
jedes des in Tabelle 3 gezeigten Substrats inkubiert. Die Menge
an reduzierendem Zucker wurde mittels des nachstehend beschriebenen
Verfahrens bestimmt. Die Ergebnisse sind ebenso in Tabelle 3 gezeigt.
Die in Tabelle 3 angegebene Hydrolyserate ist ein relativer Wert,
welcher unter der Annahme angegeben ist, dass die Rate für Mutan
100 ist.
-
Messung der
enzymatischen Aktivität
-
Zu
100 μl eines
0,1 M Essigsäurepuffers,
enthaltend 3% Mutan (pH 5), wurden 100 μl der Mutanaselösung gegeben.
Die Mischung wurde bei 35°C
während
10 Minuten unter Schütteln
mit 100 Stößen/min.
inkubiert. Die Umsetzung wurde beendet durch Zugabe von 0,4 ml einer
4,6-Dinitrosalicylsäure
(DNS)-Lösung.
Die Reaktionsmischung wurde zentrifugiert, und 0, 5 ml des Überstandes
wurden in ein Prüfrohr übertragen.
Das Rohr wurde mit einer Glaskugel abgedeckt und 10 Minuten in siedendem
Wasser gehalten. Das Rohr wurde mit Wasser während 5 Minuten gekühlt. Dann
wurden 4 ml destilliertes Wasser zugegeben und die optische Extinktion
bei 530 nm gemessen. Unter Verwendung von Glucose als Standard wurde
ein Titer bestimmt. Die Menge an Enzym, welche 1 μg reduzierenden
Zucker pro Minute freisetzt, wird als eine Einheit definiert. Es
ist zu bemerken, dass die enzymatische Aktivität, welche nachfolgend in Verbindung
mit irgendeiner der physikochemischen Eigenschaften genannt wird,
durch diese Methode gemessen wird.
-
-
(3) Optimaler pH
-
3%
Mutan enthaltende Puffer wurden wir folgt hergestellt.
-
Puffer
-
- pH 3 bis 7: Zitronensäure/Na2HPO4-Puffer
- pH 3 bis 7: NaH2PO4/Na2HPO4-Puffer
- pH 9 bis 10: Glycin/NaOH-Puffer
- pH 10 bis 11: Na2HPO4/NaOH-Puffer
-
Erfindungsgemäße Mutanase
wurde zu dem Puffer in einer Menge von 50 Einheiten/ml gegeben.
Die Reaktionsmischung wurde bei 35°C während 10 Minuten inkubiert.
Die relative Aktivität
bei einem bestimmten pH-Wert
wird wiedergegeben, basierend auf der Annahme, daß die Aktivität bei optimalem
pH 100% ist. Die pH-Profile der erfindungsgemäßen Mutanasen A, B und C sind
in den 1 bis 3 gezeigt. Die Wirkung von Mutanase
A ist optimal bei pH 4 und bleibt erhalten bei pH 4 bis 6, wie in 1 gezeigt.
Die Wirkung von Mutanase B ist optimal bei pH 4,5 und bleibt er halten
bei pH 4 bis 7, wie in 2 gezeigt. Die Wirkung von Mutanase
B ist optimal bei pH 4,5 und bleibt erhalten bei pH 4 bis 5, wie
in 3 gezeigt.
-
(4) Stabiler pH-Bereich
-
Erfindungsgemäße Mutanase
wurde zu dem obengenannten 20 mM Puffer in einer Menge von 300 Einheiten/ml
gegeben. Nach Inkubation bei 25°C
während
24 Stunden wurde die Restaktivität
gemessen. Der Prozentsatz an Restaktivität bei einem bestimmten pH-Wert
wird wiedergegeben, basierend auf der Annahme, daß die Anfangsaktivität 100% ist.
Für die
erfindungsgemäßen Mutanase
A, B und C sind die Restaktivitäten bei
verschiedenen pH-Werten in den 4 bis 6 gezeigt.
Mutanase A zeigt eine Restaktivität von nahezu 100% im Bereich
von pH 4 bis 10 und eine Restaktivität von mehr als 90% selbst bei
pH 3 oder pH 11, wie in 4 gezeigt. Mutanase B zeigt
eine Restaktivität
von nahezu 100% im Bereich von 3 bis 11, wie in 5 gezeigt.
Mutanase C zeigt eine Restaktivität von nahezu 100% im Bereich
von pH 4 bis 10, eine Restaktivität von mehr als 70% bei pH 11,
und eine Restaktivität
von mehr als 40% bei pH 3, wie in 6 gezeigt.
-
(5) Optimale Temperatur
-
Zu
einem 20 mM Essigsäurepuffer
bei pH 5, enthaltend 3% Mutan, wurde erfindungsgemäße Mutanase
in einer Menge von 50 Einheiten/ml gegeben. Die Umsetzung wurde
bei verschiedenen Temperaturen während
10 Minuten durchgeführt.
Die relative Aktivität
bei einer bestimmten Temperatur wird wiedergegeben, basierend auf
der Annahme, dass die Aktivität
bei 35°C
100% beträgt.
Für die
erfindungsgemäßen Mutanasen A,
B und C sind die relativen Aktivitäten bei verschiedenen Temperaturen
in den 7 bis 9 gezeigt. Mutanase A zeigt
eine optimale Wirkung bei 60°C,
wie in 7 gezeigt. Mutanase B zeigt eine optimale Wirkung bei
65°C, wie
in 8 gezeigt. Mutanase C zeigt eine optimale Wirkung
bei 50°C,
wie in 9 gezeigt.
-
(6) Wärmestabilität
-
Mit
20 mM Essigsäurepuffer
(pH 5) wurde eine 300 Einheiten/ml Mutanaselösung gemäß der Erfindung hergestellt.
Die Enzymlösung
wurde bei verschiedenen Temperaturen während 10 Minuten inkubiert
und mit Eis gekühlt.
Der Prozentsatz an Restaktivität
wird wiedergegeben, basierend auf der Annahme, dass die enzymatische
Aktivität
einer unbehandelten Probe 100% beträgt. Für die erfindungsgemäßen Mutanasen
A, B und C sind die Restaktivitäten
bei verschiedenen Temperaturen in den 10 bis 12 gezeigt.
Mutanase A zeigt eine Restaktivität von 100% bei 30 bis 60°C und 30%
bei 65°C
und wurde bei 75°C
denaturiert, wie in 10 gezeigt. Mutanase B zeigt
eine Restaktivität
von 100% bei 30 bis 60°C
und etwa 85% bei 65°C
und wurde bei 75°C
denaturiert, wie in 11 gezeigt. Mutanase C zeigt
eine Restaktivität
von 100% bei 30 bis 50°C
und 22% bei 55°C,
wie in 12 gezeigt.
-
(7) Wirkung von Metallionen
-
sErfindungsgemäße Mutanase
wurde zu einem 50 mM Essigsäurepuffer
(pH 5) in einer Menge von 50 Einheiten/ml gegeben. Verschiedene
Metallsalze wurden hierzu in einer Endkonzentration von 1 mM einzeln zugegeben.
Die Lösung
wurde bei 35°C
während
30 Minuten inkubiert. Die relative Aktivität wird wiedergegeben, basierend
auf der Annahme, dass die enzymatische Aktivität einer metallsalzfreien Probe
100% beträgt. Für die erfindungsgemäßen Mutanasen
A, B und C wurden die relativen Aktivitäten auf diese Weise bestimmt, wobei
die in Tabelle 4 gezeigten Ergebnisse erhalten wurden. Wie aus Tabelle
4 ersichtlich, wird Mutanase A durch die Zugabe von Quecksilber,
Silber und Eisen (III)-Ionen inhibiert; und die Mutanasen B und
C werden durch Quecksilber und Silber inhibiert.
-
-
(8) Wirkung von Inhibitoren
-
Erfindungsgemäße Mutanase
wurde zu einem 50 mM Essigsäurepuffer
(pH 5) in einer Menge von 50 Einheiten/ml gegeben. Verschiedene
Inhibitoren wurden hierzu in einer Endkonzentration von 1 mM einzeln zugegeben.
Die Lösung
wurde bei 35°C
während
30 Minuten inkubiert. Die relative Aktivität wird wiedergegeben, basierend
auf der Annahme, dass die enzymatische Aktivität einer inhibitorfreien Probe
100% beträgt.
Für die
erfindungsgemäßen Mutanasen
A, B und C wurden die relativen Aktivitäten auf diese weise bestimmt,
wobei die Ergebnisse in Tabelle 5 gezeigt sind. Wie aus Tabelle
5 ersichtlich, inhibiert die Zugabe von p-Chlorquecksilberbenzoat
(PCMB) stark die Mutanasen A, B und C.
-
-
(9) Molekulargewicht
-
Unter
Verwendung eines 5 bis 20% Polyacrylamid-Gradientengels (Ready Made
Gel von Biorad K.K.) wurde die erfindungsgemäße, gereinigte Mutanase der
Elektrophorese bei 40 mA während
einer Stunde unterzogen. Das Molekulargewicht wurde unter Verwendung
von Sigma Marker (Handelsbezeichnung, Sigma Chemical Co.) bestimmt.
Mutanase A besaß ein
Molekulargewicht von 150.000, Mutanase B besaß ein Molekulargewicht von
140.000 und Mutanase C besaß ein
Molekulargewicht von 160.000.
-
Soweit
sie die obengenannten physikochemischen Eigenschaften aufweist,
ist die erfindungsgemäße Mutanase
nicht durch ihr ursprüngliches
Enzym beschränkt.
Obwohl aus RM1-, RM4- und M7-Stämmen
produzierte Mutanasen im allgemeinen ausreichend sind, können aus
RM1-, RM4- und M7-Stämmen erzeugte Mutanasen
in stabiliere und wirksamere Enzyme durch chemische Modifikation
oder Proteinengineering umgewandelt werden.
-
Die
erfindungsgemäßen Mutanasen
besitzen die obengenannten physikochemischen Eigenschaften und sind
von gut bekannten Mutanasen in vielen Punkten unterscheidbar. Beispielsweise
sind die erfindungsgemäßen Mutanasen
A bis C und Novozym 234 unterschiedlich hinsichtlich des Musters
der Spaltung von α-1,3-Bindungen.
Mutanase A besitzt einen optimalen pH-Wert von 4 und eine optimale
Temperatur von 60°C, Mutanase
B besitzt eine optimale Temperatur von 65°C und Mutanase C besitzt einen
stabilen pH-Bereich von pH 4 bis 10 (25°C, 24 Stunden) und ein Molekulargewicht
von etwa 160.000, wohingegen die vom BC-8-Stamm abstammende Mutanase
einen optimalen pH-Wert von 4,5, eine optimale Temperatur von 45
bis 50°C,
einen stabilen pH-Bereich von pH 7,0 bis 9,0 und ein Molekulargewicht
von 180.000 aufweist. Mutanase A besitzt ein Molekulargewicht von
150.000, eine optimale Temperatur von 60°C und einen optimalen pH-Wert von
4, Mutanase B besitzt ein Molekulargewicht von 140.000, eine optimale
Temperatur von 65°C
und einen optima len pH-Wert von 4,5, Mutanase C besitzt ein Molekulargewicht
von etwa 160.000, eine optimale Temperatur von 50°C und einen
optimalen pH-Wert
von 4,5, wohingegen die von dem FERM P-4765-Stamm abstammende Mutanase
ein Molekulargewicht von mehr als 70.000, eine optimale Temperatur
von 30 bis 40°C und
einen optimalen pH-Wert von 6,2 bis 6,7 aufweist. Die in JP-A-S52-034980,
S50-145583 und S47-9743 beschriebenen Mutanasen werden produziert
durch Mikroorganismen der Gattung Streptomyces, Mikroorganismen
der Gattung Flavobacterium und Mikroorganismen von Trichoderma hargianum,
Penicillium lilacinum, Penicillium funiculosum, Penicillium melinii
und Penicillium janthinellum. Beispielsweise besitzt die in JP-A-S52-034980
beschriebene Mutanase einen optimalen pH-Wert von 5,5 und einen
stabilen pH-Bereich von 5 bis 7, die in der JP-A-S50-145583 beschriebene
Mutanase einen optimalen pH-Wert von 6,0 und einen stabilen pH-Bereich
von 5,0 bis 7,0. Sie sind hinsichtlich vieler physikochemischer
Eigenschaften von den erfindungsgemäßen Mutanasen verschieden.
Es ist zu bemerken, dass die physikochemischen Eigenschaften der
in JP-A-S47-9743 beschriebenen Mutanase unbekannt sind.
-
Bei
der erfindungsgemäßen oralen
Zusammensetzung wird die Mutanase vorzugsweise in einer Menge von
1 bis 50.000 Einheiten/Gramm, weiter vorzugsweise 10 bis 10.000
Einheiten/Gramm eingemischt. Weniger als 1 Einheit/Gramm Mutanase
wären unwirksam
bei der Verhinderung von Zahnkaries, wohingegen mehr als 50.000
Einheiten/Gramm an Mutanase in nachteiliger Weise die Empfindlichkeit
gegenüber
dem Mund der oralen Zusammensetzung beeinträchtigen würde.
-
Eine
Einheit an Mutanase ist diejenige Menge an Enzym, welche eine Menge
an freiem, reduzierendem Zucker freisetzt, welche 1 μg Glucose
pro Minute auf einem Mutansubstrat entspricht. Das hierin verwendete
Mutan ist ein wasserunlösliches,
weißes
Pulver, das erhalten wird, wenn Dextranase auf das unlösliche Glucan
(α-1,3-
und α-1,6-Bindungen)
einwirkt, das durch den Streptococcus mutans-Stamm 6715 produziert wird
(siehe Carbohydrate Research, Band 38, 1974).
-
Bei
der Durchführung
der Erfindung kann die Mutanase alleine oder in Mischung mit anderen
Enzymen verwendet werden, beispielsweise Dextranase, Amylase, Lysozym,
Protease und lytische Enzyme. Insbesondere bei der Verwendung in
Kombination mit Dextranase wird Mutanase wirksamer bei der Inhibierung
von Zahnbelagsbildung.
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Die
hierin verwendete Dextranase kann irgendeine der gut bekannten sein,
beispielsweise eine solche, die von Chaetomium sp. abstammt. Dextranase
wird vorzugsweise in einer Menge von 10 bis 50.000 Einheiten/Gramm,
weiter vorzugsweise 200 bis 20.000 Einheiten/Gramm der oralen Zusammensetzung
eingemischt. Weniger als 10 Einheiten/Gramm an Dextranase wäre unwirksam
bei der Hinderung von Zahnbelagsbildung, wohingegen mehr als 50.000
Einheiten/Gramm an Dextranase in nachteiliger Weise das Gefühl gegenüber dem
Mund der oralen Zusammensetzung beeinträchtigen würde.
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Eine
Einheit an Dextranase ist diejenige Menge an Enzym, welche eine
Menge an freiem, reduzierendem Zucker freisetzt, entsprechend 1 μg Glucose
pro Minute bei der Umsetzung mit Dextran als einem Substrat.
-
In
die erfindungsgemäße orale
Zusammensetzung können
bekannte Bestandteile gemäß einer
besonderen Anwendung oder Form der Zusammensetzung eingemischt werden.
-
Im
Falle eines Zahnpflegemittels können
beispielsweise weitere Bestandteile eingemischt werden, einschließlich Scheuermitteln,
Bindemitteln, Feuchthaltemitteln, Tensiden, Süßungsmitteln, Konservierungsmitteln
und Färbemitteln.
-
Beispiele
des Scheuermittels umfassen Aluminiumoxid, Aluminiumhydroxid, dibasisches
Calciumphosphatdihydrat und -anhydrid, Silika-Scheuermittel, Calciumcarbonat, Calciumpyrophosphat,
Aluminiumsilikat, unlösliches
Natriummethaphosphat, tribasisches Magnesiumphosphat, Calciumsulfat
und synthetische Harze, alleine oder in Mischung.
-
Das
Scheuermittel wird im allgemeinen in einer Menge von etwa 10 bis
90 Gew.-% der gesamten Zusammensetzung, typischerweise 10 bis 60
Gew.-% einer Zahnpasta, eingemischt. Bei der vorliegenden Erfindung
ist es bevorzugt, Silika-Scheuermittel als Hauptscheuermittel zu
verwenden, da die Wirksamkeit von Mutanase weiter gesteigert wird.
Beispiele des Silika-Scheuermittels
umfassen ausgefälltes
Silika, Silikagel, Aluminosilikat und Zirkonsilikat. Scheuermittel
mit einer Teilchengröße von 1
bis 30 μm
sind unter dem Gesichtspunkt der Empfindlichkeit bei der Anwendung
des Zahnpflegemittels bevorzugt.
-
Beispiele
des Bindemittels umfassen Carrageen, Natriumcarboxymethylcellulose,
Alkalimetallsalze von Alginsäure,
wie Natriumalginat, Gummen, Polyvinylalkohol und Bienengummi. Das
Bindemittel wird im allgemeinen in einer Menge von 0,3 bis 5 Gew.-%
der gesamten Zusammensetzung eingemischt. Beispiele des Feuchthaltemittels
umfassen Sorbitol, Glycerin, Propylenglykol, 1,3-Butylenglykol,
Polyethylenglykol, Xylitol, Maltitol und Lactitol. Das Feuchthaltemittel
wird im allgemeinen in einer Menge von 10 bis 70 Gew.-% der gesamten
Zusammensetzung eingemischt.
-
Beispiele
des Tensids umfassen anionische Tenside, wie Natriumlaurylsulfat,
Lauroylsarcosinat, α-Olefinsulfonate,
Thaurate, Laurylmonoglyceridsulfat und Seife; nichtionische Tenside,
wie Laurinsäurediethanolamid,
Stearylmonoglycerid, Saccharidfettsäureester, Lactosefettsäureester,
Lactitolfettsäureester,
Maltitolfettsäureester,
Polyoxyethylensorbitanmonostearat; und ampholytische Tenside einschließlich Betain-
und Aminosäuretypen.
Das Tensid wird im allgemeinen in einer Menge von 0,5 bis 7 Gew.-%
der gesamten Zusammensetzung eingemischt.
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Beispiele
des Süßungsmittels
umfassen Natriumsaccharin, Steviosid, Neohesperidyldihydrochalcon, Thaumatin,
Glycyrrhizin und Perillartin. Geschmacksstoffe umfassen Anethol,
Carvon, Cineol, Methylsalicylat, Eugenol, Ethylbutyrat und Zimtsäurealdehyd
sowie essentielle Öle,
welche diese Geschmackskomponenten enthalten, wie Spearmintöl, Pfefferminzöl und Wintergrünöl. Beispielhafte
Konservierungsstoffe sind p-Hydroxybenzoate und Natriumbenzoat.
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Eine
erfindungsgemäße Zahnpflegemittelzusammensetzung,
typischerweise eine Zahnpasta kann hergestellt werden durch Kneten
der obengenannten Komponenten mit einer geeigneten Menge an Wasser. Die
resultierende Zahnpasta ist in einem geeigneten Behälter enthalten,
beispielsweise in tubenförmigen
Behältern,
wie Aluminiumtuben, aus Aluminiumfolie mit einer auf jeder Oberfläche laminierten
Kunststoffolie hergestellte Laminattuben, Kunststofftuben, Flaschen
und Aerosolbehälter.
-
Wenn
die erfindungsgemäße orale
Zusammensetzung beispielsweise ein Mundwasser ist, können weitere
Bestandteile eingemischt werden, einschließlich Feuchthaltemitteln, Süßungsmitteln,
pH-Einstellungsmitteln, Konservierungsmitteln und Lösungsmitteln.
Beispiele des pH-Einstellungsmittels umfassen organische Säuren, wie
Citronensäure,
Phosphorsäure, Äpfelsäure und
Essigsäure.
Die Lösungsmittel
umfassen Ethanol und Wasser. Falls erwünscht, können beliebige andere geeignete
Komponenten eingemischt werden.
-
Im
Falle eines Kaugummis und einer Pastille können herkömmlicherweise verwendete Bestandteile
in üblichen
Mengen eingemischt werden, wobei für die Herstellung herkömmliche
Techniken eingesetzt werden können.
-
In
der erfindungsgemäßen oralen
Zusammensetzung können
andere Enzyme als Mutanase und Dextranase eingemischt werden sowie
Fluorverbindungen, wie Natriumfluorid und Natriummonofluorphosphat, Antikörper, Zinn(III)-Verbindungen,
Chlorhexidinsalze, epsilon-Aminocapronsäure, Tranexamsäure, Aluminiumchlorhexidylallantoin,
Dihydrocholesterin, Glycyrrhetinsäure und Salze, Natriumchlorid
und wasserlösliche, anorganische
Phosphorsäuren.
Beispiele der wasserlöslichen,
anorganischen Phosphorsäure,
welche in die erfindungsgemäße orale
Zusammensetzung eingemischt werden können, umfassen Kalium- und
Natriumsalze von Orthophosphorsäure,
Pyrophosphorsäure
und Polyphosphorsäure.
-
Nachfolgend
wird die Erfindung unter Bezugnahme auf Beispiele näher erläutert. Zunächst werden
Experimente beschrieben.
-
Herstellungsbeispiel
-
(1) Herstellung von Mutan
-
Das
in den folgenden Beispielen verwendete Mutan wurde wie folgt hergestellt.
-
Streptococcus
sobrinus-Stamm 6715 wurde in 200 ml BHI-Medium (Brain Heart Infusion
von Oxoid Company) inokuliert und bei 37°C während einem Tag kultiviert.
Die resultierende Kultur wurde in 4 Liter BHI-Medium, enthaltend
5% Saccharose, inokuliert und bei 37°C während 5 Tagen kultiviert. Das
Präzipitat wurde
gesammelt, in 500 ml 1N Natriumhydroxidlösung gelöst und eine Stunde bei Raumtemperatur
stehengelassen. Nach der Zentrifugaltrennung wurde der Überstand
mit Chlorwasserstoffsäure
neutralisiert. Das Präzipitat
wurde durch Filtration gewonnen. Zu dem gewonnenen Präzipitat
wurde Dextranase gegeben, um α-1,6-Bindungen
zu spalten.
-
(2) Herstellung von Mutanase
-
Die
in den folgenden Beispiele verwendete Mutanase wurde wie folgt hergestellt.
-
Zunächst wurde
ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt. Mediumzusammensetzung
| Inositol
10 | g/l |
| Mutan
1 | g/l |
| Pepton
5 | g/l |
| Hefeextrakt
3 | g/l |
| KH2PO4 | 2
g/l |
| NH4NO3 | 2
g/l |
| MgSO4·7H2O | 0,3
g/l |
| pH
7,0 | |
-
Mutanase A
-
Der
durch das oben erwähnte
Screening-Verfahren erhaltene RM1-Stamm wurde in dem obigen Medium
inokuliert und bei 40°C
während
2 Tagen kultiviert. Das Medium wurde bei 8.000 U/min während 15
Minuten zentrifugiert, um einen Überstand
zu sammeln, welcher durch Ultrafiltration konzentriert wurde. Zu
dem Überstand
wurde eine Menge an Ammoniumsulfat gegeben, um eine 90%ige Sättigung
vorzusehen. Die Mischung wurde gründlich gerührt, länger als eine Stunde in Eis
gehalten und danach zentrifugiert. Das Präzipitat wurde gewonnen. Es
wurde in 10 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Puffer
(pH 8) suspendiert und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Die
dialysierte Probe wurde bei 8.000 U/min während 10 Minuten zentrifugiert.
Der resultierende Überstand
enthielt die erfindungsgemäße Mutanase
(als RM1-Enzym bezeichnet). Sie wurde wie folgt gereinigt. Sie wurde
auf einen Anionenaustauscherchromatographen DE 52 (Handelsbezeichnung:
Whatman Co.) (pH 8,0) aufgebracht und nicht absorbierte Fraktionen
wurden gesammelt. Diese Fraktionen wurden gegen 10 mM Tris-HCl-Puffer
(pH 8,5) dialysiert und dann auf DE 52 (pH 8,5) aufgebracht. Mutanase
wurde mit einer linearen Gradientenkonzentration von NaCl von 0
bis 0,2 M eluiert unter Erzielung des gereinigten Enzyms.
-
Mutanase B
-
Der
durch das oben genannte Screening-Verfahren erhaltene RM4-Stamm
wurde in dem obigen Medium inokuliert und bei 40°C während 2 Tagen kultiviert. Das
Medium wurde bei 8000 U/min während
15 Minuten zentrifugiert, um einen Überstand zu sammeln, welcher
durch Ultrafiltration konzentriert wurde. Es wurde eine Menge an
Ammoniumsulfat zu dem Überstand
bis zu einer 90%igen Sättigung
gegeben. Die Mischung wurde gründlich
gerührt,
mehr als 1 Stunde in Eis gehalten und danach zentrifugiert. Das
Präzipitat
wurde gewonnen. Es wurde in 10 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Puffer
(pH 8) suspendiert und gegen den gleichen Puffer dialysiert. Die
dialysierte Probe wurde bei 8000 U/min während 10 Minuten zentrifugiert.
Der resultierende Überstand
enthielt die erfindungsgemäße Mutanase
(als RM4-Enzym bezeichnet). Sie wurde wie folgt gereinigt. Sie wurde
auf einen Anionenaustauscherchromatographen DEAE-Toyopearl 650M
(Handelsbezeichnung: Toso K.K.) (pH 7,0) aufgebracht, und es wurden
nicht absorbierte Fraktionen gesammelt. Nicht absorbierte Fraktionen
wurden in gleicher Weise durch DEAE-Toyopearl (pH 8,5) gesammelt.
Mutanase-aktive Fraktionen wurden dann mittels eines Gelpermeationschromatographen
Sephacryl S-300 HR (Handelsbezeichnung, Pharmacia) gesammelt, wobei
ein gereinigtes Enzym erhalten wurde.
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Mutanase C
-
Der
durch das obengenannte Screening-Verfahren erhaltene M7-Stamm wurde
in das obige Medium inokuliert und bei 30°C während 2 Tagen kultiviert. Das
Medium wurde bei 8000 U/min während
15 Minuten zentrifugiert, um einen Überstand zu sammeln, welcher
mittels einer Ultrafiltrationsvorrichtung (Amicon Co.) konzentriert
wurde. Eine Menge an Ammoniumsulfat wurde zu dem Überstand
gegeben, um 90%ige Sättigung zu
erreichen. Nach dem Aussalzen wurde das Präzipitat in 10 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Puffer
(pH 8) suspendiert, welcher über
Nacht dialysiert wurde. Die dialysierte Lösung wurde auf einen Anionenaustauscherchromatographen
DE52 (Handelsbezeichnung: Whatman Co.) aufgebracht, welcher mit
10 mM Tris-Chlorwasserstoffsäure-Puffer
(pH 8) äquilibriert
worden ist. Ein die erfindungsgemäße Mutanase (als M7-Enzym bezeichnet)
enthaltendes Eluat wurde in Form nicht absorbierter Fraktionen erhalten.
Das Eluat wurde gegen 10 mM Essigsäurepuffer (pH 4,8) dialysiert.
Das dialysierte Eluat wurde auf einen Kationenaustauscherchromatographen
CM-Toyopearl 650M (Toso K.K.) aufgebracht, welcher mit 10 mM Essigsäurepuffer (pH
4,8) äquilibriert
worden ist, wodurch M7-Enzym adsor biert wurde. Das adsorbierte M7-Enzym
wurde mit 10 mM Essigsäurepuffer
(pH 4,8), enthaltend 0 bis 0,2 M Natriumchloridlösung in Form eines linearen
Gradienten, eluiert.
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Eine
Mischung aus der M7-Enzymlösung
und dem gleichen Volumen an 0,1 M Phosphatpuffer, enthaltend 1 M
Ammoniumsulfat (pH 7,5), wurde auf einen hydrophoben Chromatographen
aufgebracht, der mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 0,5
M Ammoniumsulfat, äquilibriert
worden ist. Das M7-Enzym wurde eluiert durch Verringern der Ammoniumsulfatkonzentration
von 0,5 M auf 0 M. Die resultierende aktive Fraktion wurde gegen
10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert. Das M7-Enzym wurde auf
diese Weise gereinigt.
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Die
gereinigten RM1-, RM4- und M7-Enzyme wurden hinsichtlich den physikochemischen
Eigenschaften geprüft,
wobei sich zeigte, daß sie
die obengenannten physikochemischen Eigenschaften aufwiesen, welche
die erfindungsgemäße Mutanase
haben sollte. Die Ergebnisse der Prüfung der physikochemischen
Eigenschaften an den gereinigten RM1-, RM4- und M7-Enzymen entsprechen
den vorangehend beschriebenen und sind in den 1 bis 12 sowie
den Tabellen 1 bis 5 gezeigt.
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Experiment 1
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Bewertung
der Wirksamkeit zur Entfernung von Belag
-
Streptococcus
mutans-Stamm 10449 wurde in eine statische Kultur unter Verwendung
von Brain Heart Infusion (BHI)-Brühe bei 37°C über Nacht inkubiert, um ein
Vorkulturmedium zu bilden. 100 μl
dieses Vorkulturmediums wurden zu 3 ml BHI, enthaltend 1% Saccharose,
in einer M2-Prüfröhre gegeben.
Bei Schrägstellung
des Prüfrohrs
wurde eine statische Kultur bei 37°C über Nacht durchgeführt, um
auf der Rohrwand Belag zu bilden. Nach Verwerfung des Mediums wurde
das Rohrinnere zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Dann
wurden 3 ml künstlicher
Speichellösung
(0,85 mM CaCl2, 6,22 mM KH2PO4, 50 mM NaCl, 0,15 mM MgCl2,
pH 5,94) zugegeben und 1 ml jedes der in Tabelle 6 gezeigten Enzyme
dem Prüfrohr zugesetzt,
welches 3 Minuten bei 37°C
gehalten wurde. Danach wurde die Enzymlösung verworfen und das Rohrinnere
zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Danach wurden 4 ml destilliertes
Wasser in das Rohr gegeben, welches dann einer Ultraschallbehandlung
unterzogen wurde. Die Lösung
wurde hinsichtlich der Trübung
gemessen. Unter Verwendung einer enzymfreien Probe als Kontrolle
wurde das Belagentfernungsvermögen
jeder Enzymlösung
berechnet. Es ist zu bemerken, daß bei der Prüfung von
Systemen, bei denen Dextranase gleichzeitig anwesend war, eine Enzymlösung, enthaltend
10 Einheiten RM1-, RM4- oder M7-Enzym oder Novozym 234 und 2000
Einheiten Dextranase, nach Zugabe der künstlichen Speichellösung verwendet
wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
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-
Wie
aus Tabelle 6 ersichtlich, übt
Mutanase in Kombination mit Dextranase bei der Belagentfernung eine
synergistische Wirkung aus. Diese Wirkung mit den erfindungsgemäßen Enzymen
ist größer als
mit Novozym 234. Es ist daher davon auszugehen, daß eine Mutanase
vom endo-Typ als Belagentfernungsenzym überlegen ist. Hinsichtlich
eines Belags, der vom Streptococcus mutans-Stamm 10449 gebildet
wird, zeigt das M7-Enzym hervorragendes Belagentfernungsvermögen.
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Experiment 2
-
Tierversuch
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Zur
Prüfung
der kariesverhindernden Wirkung der drei Mutanasen RM1-, RM4- und
M7-Enzym wurde ein Tierversuch durchgeführt.
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Das
hierin verwendete Kariesmodell umfaßte verschiedene Gruppen, die
jeweils aus 10, 3 Wochen alten, männlichen Goldhamstern bestanden.
Die Hamster wurden mit einem streptomycinbeständigen, kariesverursachenden
Bakterium, Streptococcus mutans-Stamm 10449, infiziert. Die Infektion
wurde bewirkt durch Inokulieren einer Platinschleife des Stammes
in 4 ml BHI-Medium (hergestellt von BBL), Inkubieren unter anaeroben
Bedingungen bei 36°C
während
20 Stunden, und Zuführen
von 0,1 ml der Kulturflüssigkeit
tropfenweise in den Mund eines jeden Hamsters. Diese Prozedur wurde
3 Tage wiederholt. Die Fixierung des Bakteriums in dem Hamster wurde
unter Verwendung einer MS-Agarplatte (hergestellt von Difco), enthaltend
0,1% Streptomycin, bestätigt.
Nachdem die Fixierung des Bakteriums bestätigt war, wurde jedes der in
Tabelle 7 gezeigten, pharmazeutischen Mittel an die Hamster während 5
Wochen verabreicht. Die Methode der Verabreichung des pharmazeutischen
Mittels bestand in der tropfenweisen Verabreichung des Mittels in
den Mund sowie die linke und rechte Backentasche eines Hamsters
von jeweils 0,1 ml und insgesamt 0,3 ml. Diese Methode wurde zweimal
täglich
wiederholt. Für
die Kontrollgruppe wurde filtriertes, ionenaustauscherbehandeltes Wasser
tropfenweise mittels der gleichen Methode verabreicht.
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Das
während
des Versuchszeitraums verabreichte Futter war ein kariesinduzierendes
Pulverfutter Diet 2000 (hergestellt von Nihon Crea K.K.). Ebenso
wurde durch ein Membranfilter mit einer Porengröße von 0,2 μm filtriertes, ionenaustauscherbehandeltes
Wasser gefüttert.
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Die
Hamster wurden hinsichtlich Karies gemäß der Kyese-Methode (J. Dent.
Res., Band 23, 1944) überprüft. Eine
Kariesunterdrückungsrate
wurde gemäß der folgenden
Gleichung berechnet Kariesunterdrückungsrate
(%) = [1-(Kariesbewertung der Gruppe, welcher pharmazeutisches Mittel
verabreicht wurde)/(Kariesbewertung der Kontrollgruppe)] × 100
-
Die
Kariesunterdrückungsraten
der jeweiligen pharmazeutischen Mittel sind in Tabelle 7 aufgeführt.
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Experiment 3
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Stabilität bei der
Herstellung
-
Zu
10 Gramm im Handel erhältlicher
Zahnpasta wurden 200 Einheiten RM1-Enzym, RM4-Enzym oder Novozym
234 gegeben. Die Zahnpasta wurde 10 Minuten vermahlen. Die Zahnpasta
wurde bei 37°C über etwa
1 Monat gelagert, während
eine Probe von 0,8 Gramm in Abständen
gezogen wurde. Die Probe wurde in 2,4 ml Phosphatpuffer bei pH 8
suspendiert, welcher zentrifugiert wurde. Der Überstand wurde hinsichtlich der
enzymatischen Aktivität
mittels des vorangehend beschriebenen Verfahrens gemessen. Die Ergebnisse der
Restaktivitätsmessung
sind in Tabelle 8 gezeigt.
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-
Es
ist zu bemerken, daß RM1-
und RM4-Enzyme in Präparaten,
wie Zahnpulver, flüssigem
Zahnpflegemittel, Mundwasser, Gebißreiniger, Gurgeltablette,
Zahnfleisch-Massagecreme, Pastille und Mundpaste vollkommen stabil
waren, wenn 200 Einheiten des Enzyms alleine oder in Kombination
mit Dextranase pro 10 Gramm jedes Präparats eingemischt wurden.
Ebenso war das M7-Enzym in Präparaten,
wie Zahnpulver, flüssigem
Zahnpflegemittel, Mundwasser, Gebißreiniger, Gurgeltablette,
Zahnfleisch-Massagecreme, Pastille und Mundpaste vollkommen stabil,
wenn 500 Einheiten des Enzyms alleine oder in Kombination mit Dextranase pro
Gramm jedes Präparats
eingemischt wurden.
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In
den folgenden Beispielen sind alle Prozentangaben auf das Gewicht
bezogen. Die Gehalte an Dextranase und Mutanase sind in Einheit
pro Gramm der Zusammensetzung angegeben. Beispiel
1: Zahnpasta
| Silika | 20% |
| Sorbitol | 60 |
| Natriumlaurylsulfat | 0,9 |
| Natriumsaccharin | 0,15 |
| Gelatine | 0,3 |
| Palmitinsäurediethanolamid | 1,5 |
| Propylenglykol | 5 |
| Geschmack | 0,3 |
| Anethol | 0,2 |
| 1-Menthol | 0,7 |
| Natriumlauroylsarcosinat | 0,5 |
| Natriumfluorid | 0,2 |
| Xanthangummi | 0,5 |
| Polyethylenglykol
Nr. 4000 | 0,5 |
| Chlorhexidingluconat | 0,03 |
| Dextranase | 3000
U/g |
| RM1-Enzym | 300
U/g |
| Wasser | Rest |
| Gesamt | 100,0% |
Beispiel
2: Zahnpasta
| Aluminiumhydroxid | 45% |
| Sorbitol | 30 |
| Natriumlaurylsulfat | 0,8 |
| Natriumalginat | 0,6 |
| Natriumsaccharin | 0,1 |
| Gelatine | 0,2 |
| Laurinsäurediethanolamid | 1,6 |
| Propylenglykol | 5 |
| Geschmack | 0,3 |
| Anethol | 0,3 |
| 1-Menthol | 1,0 |
| Natriumlauroylsarcosinat | 0,4 |
| Natriumfluorid | 0,75 |
| M7-Enzym | 500
U/g |
| Wasser | Rest |
| Gesamt | 100,0% |
Beispiel
3: Zahnpasta
| Aluminiumhydroxid | 45% |
| Sorbitol | 30 |
| Natriumlaurylsulfat | 0,8 |
| Natriumalginat | 0,6 |
| Natriumsaccharin | 0,1 |
| Gelatine | 0,2 |
| Palmitinsäurediethanolamid | 1,6 |
| Propylenglykol | 5 |
| Geschmack | 0,3 |
| Carvon | 0,2 |
| 1-Menthol | 0,7 |
| Natriumlauroylsarcosinat | 0,4 |
| Natriumfluorid | 0,75 |
| RM1-Enzym | 2000
U/g |
| Wasser | Rest |
| Gesamt | 100,0% |
Beispiel
4: Zahnpasta
| Calciumcarbonat | 45% |
| Sorbitol | 24 |
| Natriumlaurylsulfat | 1,3 |
| Carrageen | 0,7 |
| Natriumalginat | 0,3 |
| Natriumsaccharin | 0,1 |
| Gelatine | 0,2 |
| Palmitinsäurediethanolamid | 0,8 |
| Propylenglykol | 4 |
| Geschmack | 0,7 |
| Eugenol | 0,1 |
| 1-Menthol | 0,4 |
| Natriumlauroylsarcosinat | 0,4 |
| Natriumfluorid | 0,75 |
| Dextranase | 2000
U/g |
| RM1-Enzym | 300
U/g |
| Wasser | Rest |
| Gesamt | 100,0% |
Beispiel
5: Zahnpasta
| Dibasisches
Calciumphosphatdihydrat | 50% |
| Natriumlaurylsulfat | 1 |
| Carrageen | 0,6 |
| Xanthangummi | 0,3 |
| Natriumsaccharin | 0,1 |
| Gelatine | 0,2 |
| Palmitinsäurediethanolamid | 1 |
| Propylenglykol | 4 |
| Geschmack | 0,8 |
| Anethol | 0,1 |
| 1-Menthol | 0,3 |
| Natriumlauroylsarcosinat | 0,4 |
| Natriummonofluorphosphat | 0,5 |
| Glycerin | 20 |
| Tranexamsäure | 0,05 |
| Dextranase | 3000
U/g |
| RM1-Enzym | 200
U/g |
| Wasser | Rest |
| Gesamt | 100,0% |
Beispiel
6: Zahnpasta
| Denaturiertes
Aluminiumhydroxid | 50% |
| Natriumlaurylsulfat | 1,5 |
| Carrageen | 0,5 |
| Xanthangummi | 0,5 |
| Natriumsaccharin | 0,14 |
| Propylenglykol | 5 |
| Geschmack | 1,0 |
| Anethol | 0,1 |
| 1-Menthol | 0,3 |
| Natriummyristoylsarcosinat | 0,3 |
| Natriumfluorid | 0,5 |
| Glycerin | 20 |
| Kieselsäureanhydrid | 5 |
| Titanoxid | 0,5 |
| Natriumcarboxymethylcellulose | 0,1 |
| Triclosan | 0,04 |
| Dextranase | 5000
U/g |
| RM4-Enzym | 300
U/g |
| Wasser | Rest |
| Gesamt | 100,0% |
Beispiel
7: Flüssiges
Zahnpflegemittel
| Silika | 18% |
| Sorbitol | 50 |
| Natriumlaurylsulfat | 1 |
| Natriumsaccharin | 0,1 |
| Gelatine | 0,2 |
| Laurinsäurediethanolamid | 1,2 |
| Propylenglykol | 2 |
| Geschmack | 1,0 |
| Carvon | 0,1 |
| 1-Menthol | 0,4 |
| Natriumpalmitoylsarcosinat | 0,4 |
| Natriumfluorid | 0,2 |
| Glycerin | 1
g |
| Xanthangummi | 0,1 |
| Decaglyceryllaurat | 0,5 |
| Natriumsulfatanhydrid | 0,3 |
| Dextranase | 3000
U/g |
| RM1-Enzym | 300
U/g |
| Wasser | Rest |
| Gesamt | 100,0% |
Beispiel
8: Mundwasser
| Modifiziertes
Ethanol | 1,6% |
| Polyoxyethylen-gehärtetes Rizinusöl | 2 |
| Citronensäure | 0,01 |
| Trinatriumcitrat | 0,3 |
| Geschmack | 0,15 |
| Anethol | 0,05 |
| 1-Menthol | 0,2 |
| Natriumlauroylsarcosinat | 0,1 |
| Natriumfluorid | 0,08 |
| Glycerin | 10 |
| DL-Alanin | 1 |
| Dextranase | 4600
U/g |
| RM1-Enzym | 500
U/g |
| Wasser | Rest |
| Gesamt | 100,0% |
Beispiel
9: Mundwasser
| 90%
Ethanol | 20% |
| Polyoxyethylen
(80 Mol) -sorbitan-monothaurat | 0,5 |
| Geschmack | 1,5 |
| Anethol | 0,3 |
| 1-Menthol | 0,8 |
| Natriummonofluorphosphat | 0,15 |
| Natriumlauroylsarcosinat | 0,1 |
| Dextranase | 2000
U/ml |
| RM1-Enzym | 500
U/ml |
| Wasser | Rest |
| Gesamt | 100,0% |
Beispiel
10: Mundwasser
| 90%
Ethanol | 20% |
| Polyoxyethylen
(80 Mol) -sorbitan-monothaurat | 0,5 |
| Geschmack | 1,5 |
| Anethol | 0,3 |
| 1-Menthol | 0,8 |
| Natriummonofluorphosphat | 0,15 |
| Natriumlauroylsarcosinat | 0,1 |
| Dextranase | 3000
U/ml |
| RM4-Enzym | 200
U/ml |
| Wasser | Rest |
| Gesamt | 100,0% |
Beispiel
11: Pastillen
| Gummiarabikum | 6% |
| Geschmack | 0,7 |
| Anethol | 0,5 |
| 1-Menthol | 0,3 |
| Natriumfluorid | 0,05 |
| Natriumlauroylsarcosinat | 0,01 |
| Glukose | 36 |
| Palatinose | 36 |
| Dextranase | 4600
U/ml |
| RM1-Enzym | 500
U/ml |
| Wasser | Rest |
| Gesamt | 100,0% |
Beispiel
12: Kaugummi
| Gummigrundstoff | 20% |
| Geschmack | 0,7 |
| Anethol | 0,3 |
| 1-Menthol | 0,3 |
| Natriumfluorid | 0,1 |
| Natriumlauroylsarcosinat | 0,01 |
| Calciumcarbonat | 2 |
| Stärkehydrolysat | 15 |
| Puderzucker | 58 |
| Dextranase | 2000
U/ml |
| RM1-Enzym | 200
U/ml |
| Wasser | Rest |
| Gesamt | 100,0% |
Beispiel
13: Gebißreiniger
| Kaliumhydrogenmonopersulfat | 35% |
| Natriumperborat | 15 |
| Natriumcarbonat | Rest |
| Natriumhydrogencarbonat | 25 |
| Citronensäureanhydrid | 10 |
| Polyethylenglykol | 1 |
| Polyvinylpyrrolidon | 1 |
| Natriumtripolyphosphat | 5 |
| Natriumlaurylsulfat | 1 |
| Dextranase | 6000
U/g |
| RM1-Enzym | 500
U/g |
| Pulvergeschmack | 0,5 |
| Blau Nr. 1 | Spuren |
| Gesamt | 100,0% |
Beispiel
14: Gebißreiniger
| Kaliumhydrogenmonopersulfat | 25% |
| Natriumperborat | 15 |
| Natriumcarbonat | Rest |
| Natriumhydrogencarbonat | 20 |
| Citronensäureanhydrid | 10 |
| Kristalline
Cellulose | 3 |
| Lactose | 2 |
| Polyvinylpyrrolidon | 2 |
| Natriumtripolyphosphat | 3 |
| Natriumlaurylsulfat | 1 |
| Dextranase | 5000
U/g |
| RM4-Enzym | 1000
U/g |
| Pulvergeschmack | 2 |
| Blau Nr. 1 | Spuren |
| Gesamt | 100,0% |
-
Die
erfindungsgemäßen oralen
Zusammensetzungen besitzen die verbesserte Wirkung der Inhibierung
von Belagsbildung, wobei Mutanase aus einem spezifischen Ursprung
in orale Zusammensetzungen, wie ein Zahnpflegemittel, in vollkommen
stabiler Weise als kommerzielle Produkte eingemischt werden kann.
