DE3102216A1

DE3102216A1 - Alkalische protease m(pfeil abwaerts)3(pfeil abwaerts), verfahren zu ihrer herstellung, ihre verwendung und mittel zur verhinderung von zahnkaries

Info

Publication number: DE3102216A1
Application number: DE19813102216
Authority: DE
Inventors: Hiromi Kawachinagano Katae; Shigeo Kobe Hyogo Kawata; Yoshiyuki Amagasaki Hyogo Takase; Takeshi Takatsuku Yamamoto; Kanae Nara Yokogawa
Original assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1980-01-24
Filing date: 1981-01-23
Publication date: 1982-03-04
Also published as: JPS56106593A; FR2482131B1; JPS6236671B2; GB2069501B; US4364926A; GB2069501A; FR2482131A1

Description

(1) Kariogene Mikroorganismen, wie Streptococcus mutens oder Streptococcus sanguis wachsen in der Mundhöhle durch Aufnahme von Sucrose aus der Nahrung als Nährstoffquelle.
(2) Die kariogenen Mikroorganismen erzeugen Glucosyltransferase (nachstehend als "GTF" bezeichnet) während ihres Wachstums.

(3) Durch die Einwirkung von GTF wird die in der Mundhöhle enthaltene Sucrose in wasserlösliche oder unlösliche Polysaccharide, wie Dextran, umgewandelt. (4·) Die derart entstandenen Polysaccharide, insbesondere die wasserunlöslichen Polysaccharide bedecken die Oberfläche der kariogenen Mikroorganismen und anderen Bakterien und haften schließlich an der Zahnoberfläche, wobei ein Zahnbelag entsteht.

L J

(5) Die in dem Belag enthaltenen Bakterien erzeugen

Säuren, wie Milchsäure, unter Verwendung der Saccharide. Die so entstandenen Säuren lösen den Zahnschmelz auf, was zum Auftreten der Zahnkaries führt. 5

Entsprechend den vorstehenden Ausführungen ist es möglich, das Auftreten der Karies zu verhindern, wenn das Fortschreiten eines der Vorgänge der genannten fünf Stufen inhibiert wird. In der US-PS 3 751 561 und der GB-Po 1 291 922 wird vorgeschlagen, Speisereste oder Zahnbeläge unter Verwendung von Proteasen, insbesondere neutralen Proteasen, zu zerstören oder zu entfernen. Diese Proteasen zeigen jedoch nur geringe Wirkung bei der Hemmung der

Karies. 15

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue Protease bereitzustellen, die einen Wirkstoff zur Verhinderung der Zahnkaries darstellt. Diese Aufgabe wird durch den überraschenden Befund gelöst, daß eine bestimmte alkalische Protease wirksam die Aktivität der Glucosy!transferase GTP inhibiert, die einen der Faktoren bei der Entstehehung von Zahnkaries darstellt.

Weitere Aufgaben der Erfindung bestehen in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung der neuen Protease sowie in der Schaffung eines Mittels zur Karies-Prophylaxe, das die neue Protease enthält.

Die Erfindung betrifft don in den Patentansprüchen gekenn-'ⁱ⁰ zeichneten Gegenstand. Die neue alkalische Protease der Erfindung zeigt hervorragende Wirksamkeit bei der Hemmung der Zahnkaries (nachstehend einfach als "Karies" bezeichnet ) . Sie wird erstmals in vorliegender Erfindung durch die Kultivierung eines bestimmten Mikroorganismus erhalten. Die neue Protease erhielt die Bezeichnung "alkalische Protease M,".

I- ' J

Die chemischen und physikalischen Eigenschaften der alkalischen Protease M, werden nachstehend mit Bezug auf die Zeichnung erläutert.

In der Zeichnung zeigt Fig. 1 die Beziehung zwischen dem pH-Bereich und der Proteaseaktivität der alkalischen Protease M^. Fig. 2 zeigt die Beziehung zwischen dem pH-Bereich und der restlichen relativen Aktivität, d.h. die pH-Stab L-lität der alkalischen Protease ML. Fig. 3 zeigt üiu Be-Ziehung zwischen der Temperatur und der relativen Aktivität, d.h. den Temperaturbereich, bei dem die alkalische Protease M, ihre Aktivität zeigt. Fig. 4- zeigt die Beziehung zwischen der Temperatur und der restlichen relativem Aktivität, d.h. die Wärmebeständigkeit der alkalischen Protease ML. Fig. 5 zeigt das UV-Absorptionsspektrum der alkalischen Protease M,. Fig. 6 zeigt das IR-Absorptionsspektrum der alkalischen Protease M,.

In den Fig. 1 und 2 bedeutet (1) einen Phosphatpuffer, (2) einen Tris-HCl-Puffer, (3) einen Sörensen-Puffer und

(4) einen Citratpuffer. Diese Pufferlösungen werden in Fig. 1 mit einer Konzentration von 0,05 M und in Fig. 2 in einer Konzentration von 0,02 M verwendet.

(1) Aktivitäten:

Das Enzym der Erfindung ist eine alkalische Protease, die Casein hydrolysieren kann und die Aktivität von GTF hemmt. Das Enzym hat im wesentlichen keine Lyseaktivität für kariogene Mikroorganismen-Zellen und unterscheidet sich in dieser Beziehung von dem Zell-Lyse-Enzym gemäß US-PS

so 3 929 579.

(2) Optimaler pH-Wert und pH-Stabilität:

Fig. Λ zeigt, daß bei Verwendung von Casein als Substrat das Enzym der Erfindung einen optimalen pH-Bereich bei 9 bis 12,5 besitzt. Ferner zeigt Fig. 2, daß das Enzym, wenn es 6 Tage in einer Pufferlösung vom pH-Wert 4- bis 9

ι bei οι nor Temperatur von 37°C gehalten wird, mindestens "?0a> der Proteaseaktivitat behält.

(3) Optimale Temperatur und Wärmebeständigkeit:

Fig. 3 zeigt, daß bei der Verwendung von Casein als Substrat das Enzym der Erfindung eine optimale Temperatur bei etwa 65°C besitzt. Ferner zeigt Fig. 4-, daß auch beim Erhitzen einer wäßrigen Lösung des Enzyms auf 55°C während

10 Minuten die Proteaseaktivitat nicht verlorengeht. 10

(4) Bedingungen für die Inaktivierung:

Fig. ¹V zeigt, daß beim Erhitzen einer wäßrigen Lösung des Enzyms der Erfindung auf 60⁰G während 10 Minuten mindestens etwa 5Ο7Ο der Proteaseakfcivität verlorengehen. Beim ¹^ Erhitzen einer wäßrigen Lösung auf 65°C während 10 Minuten gehen mindestens 9Q/° der Proteaseaktivitat verloren.

(5) Wirkung verschiedener Zusätze:

Die Auswirkungen verschiedener Zusätze, wie Inhibitoren und Metallionen, auf die Proteaseaktivitat des Enzyms der Erfindung sind in nachstehender Tabelle I zusammengefaßt.

— Π _

Tabelle I

Zusatz *1.	relative	Zusatz *1	relativ
	Aktivität,^		Aktivit
—	100	GaGl₂	78
Bernsteinsäure	113	BaCl₂	79
Thioharnstoff	119	CoCl₂	70
Jodessigsäure	118	ZnSO₄	69
Na₂HAsO₄	111	NiCl₂	62
Seaicarbazid-	116	FeSO,	95
hydrochlorid		/j.
L-Ascorbinsäure	110	Fe₂(SO₄ )₃	95
NaN,	111	Pb(CH₃COO)₂	64
DFP *2	86	Hg(CH₃COO)₂	46
NBS *3 (10"^M)	0	CdGl₂	42
NBS *3 (10"⁵M)	85	CuCl₀	64
MnGl₂	61	EDTA^*4	87

Bemerkungen: *1) Die Menge der Zusätze beträgt 10 % *2) DFP = Diisopropylfluorophosphat *3) NBS = N-Bromsuccinimid *4) EDTA = Äthylendiamintetraacetat.

Aus Tabelle I ist zu sehen, daß die Proteaseaktivität des Enzyms der Erfindung durch Jodessigsäure, DFP, FeSO₄ und

EDTA in einer Menge von 10 ⁵M im wesentlichen nicht, da-

—4

gegen durch NBS in einer Menge von 10 M praktisch vollständig gehemmt wird.

Mit anderen als den in Tabelle I aufgeführten Zusätzen, beispielsweise 8-Hydroxychinolin, Kaliumoxalat, Natriumdiäthyldithiocarbamat, Natriumpyrophosphat, NaJHAsO₄I FCH₂GOONa, NH₂OH.HCl, Thiosemicarbazid, HH₂NH₂-HCl.1/2-H₂SO₄, NaHSO₃, HSCH₂CH₂OH, Glutathion, L-Cystein-hydrochlorid,

2,3-Dimercapto-i-propanol, NaF, Tryρsin-Inhibitor, MgGl₂, Li₂SO₄ oder Ag₂SO^, in einer Menge von 1Cf ⁵M liegt die relative Proteaseaktivität des Enzyms der Erfindung im Bereich von 85 bis 110. Dies bedeutet, daß die Proteaseaktivität des Enzyms durch diese Zusätze fast nicht berührt wird.

(6) Isoelektrischer Punkt :

Der isoelektrische Punkt des Enzyms der Erfindung liegt bei etwa pH 9,5, gemessen unter-Verwendung eines Träger-Ampholit (pH-Wert 2 bis 11,5; LKB Produkter AB) bei 300 V während A-Oh.

(7) Molekulargewicht:

^1b Das Enzym der Erfindung hat ein Molekulargewicht von etwa

4
1,7 χ 10 _? bestimmt durch Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-75 (Pharmacia Fine Chemicals).

(8) TTV-Absorptionsspektrum:

Das Enzym der Erfindung besitzt das in Fig. 5 wiedergegebene UV-Absorptionsspektrum.

(9) IR-Absorptionsspektrum:

Das Enzym der Erfindung besitzt das in Fig. 6 wiedergegebene IR-Absorptionsspektrum.

(10) Reinigungsverfahren:

Das Enzym der Erfindung kann nach dem in nachstehendem Beispiel beschriebenen Verfahren gereinigt werden.

3D

(11) Akt ivit ät smessung:

(A) Proteaseaktivität:

2 ml einer 0,6% Casein-0,05 M Tris-HCl-Pufferlösung mit dem pH-Wert 8,0 wird mit 1 ml einer entsprechend verdünnten wäßrigen Lösung von alkalischer Protease K₇. versetzt.

Das erhaltene Gemisch wird 10 Minuten auf 37°C gehalten und danach mit 3 ml einer Lösung versetzt, die einen Stoff enthält, der die Umsetzung abbricht (0,01 M Trichloressigsäure - 0,02 M ITatriumacetat - 0,03 M Essigsäure). Nach dem Entfernen der erhaltenen Niederschläge durch Filtration wird die Absorption des Filtrates bei 275 nm gemes;iv3n. Aus dem erhaltenen UV^nc-^ert _wi_rci ßi_e Henge an Tyrosin durch Vergleich mit dem υ?275~^!^^βΓ^ einer Standard-Tyrosialösung berechnet.
10

Eine Einheit der Proteaseaktivität wird als die Menge des Enzyms definiert, die für eine Erhöhung des Tyrosingehalts um 1 pg in 1 Minute erforderlich ist.

¹⁵ (B) Hemmwirkung gegen GTF:

Reagentien:

(a) GTF-Lösung:

Ein K^,-R Stamm oder ein AHT Stamm von Streptococcus mutans wird auf einem Trypticase-Tryptose-Hefe-Extraktmedium vom pH-Wert 7,0 24 Stunden bei 37⁰G in stationärem Zustand gezüchtet. Sodann wird die Kulturbrühe zentrifugiert und der Überstand mit 50prozentiger Ammoniumsulfatlösung versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird abgetrennt und in einer 0,05 M Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,8 gelöst. Die erhaltene Lösung wird sodann gegen Wasser dialysiert. Die dabei erhaltene Lösung wird als GTF-Lösung verwendet.

(b) 5% Sucrose - 1/15 M Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,8;

(c) Alkalische Protease M, - 1/15 M Phosphatpuffer vom 30 pH-Wert 6,8;

(d) I/15 M Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,8j

(e) Anthronlösung:

200 mg umkristallisiertes Anthron werden unter Kühlen in 100 ml 95prozentige Schwefelsäure gelöst und sodann mit 20 ml Wasser versetzt. Es wird eine Anthronlösung erhalten.

L J

1 Verfahren:

Ein Gemisch aus 0,1 ml Reagenz (a), 2,0 ml Reagenz (b) und 0,05 ml Reagenz (c) wird 13 Stunden auf 37°C gehalten und danach mit Äthanol versetzt, bis eine Konzentration von 70,j erreicht ist. Das erhaltene Gemisch wird sodann 2 Stunden bei 4-⁰C stehengelassen. Dabei bildet sich ein Niederschlag (Polysaccharide), der abzentrifugiert und in 5»O ml des Reagenz (d) gelöst wird. Die erhaltene Lösung wird wie vorstehend beschrieben mit Äthanol behandelt. Hierauf wird der erhaltene Niederschlag erneut in 5>0 ml Reagenz (d) gelöst. 0,1 ml der erhaltenen Lösung werden sodann mit 6,0 ml Reagenz (e) versetzt und das erhaltene Gemisch wird unter gutem Schütteln 10 Minuten auf 1OO°C erhitzt. Nach dem Abkühlen wird die Absorption der Lösung bei 620 nm gemessen und die Menge an Polysacchariden bestimmt.

Die GTF-Aktivität wird durch die Menge an entstandenen Polysacchariden in ₍ug/ml gezeigt. Die GTF-Eemmwirkung

wird sodann nach folgender Gleichung berechnet: 20

Hemmverhältnis, % - iLz_B χ 100

In der Gleichung bedeutet A die GTF-Aktivität ohne Zusatz von alkalischer Protease M, und

25 Zusatz von alkalischer Protease M,.

von alkalischer Protease M, und B die GTF-Aktivität bei

Die erläuternden Eigenschaften der alkalischen Protease ML der Erfindung sind in nachstehender Tabelle II denjenigen bekannter alkalischer Proteasen mit einem optimalen pH-Wert von 10 oder mehr gegenübergestellt.

L J

οι

ω ο

ιο

οι

ro ο

ιη

Tabelle II

Physikochemische ^: Eigenschaft en

i Alkalische ; Protease M

!Optimaler pH-Bereich !Optimale Temperatur,⁰C

jAktivität bei 65°C _v

'Aktivität bei optim.liemp. '$"> jAktivität bei pH 12,5 χ 1pO, !Aktivität bei optim. pH % 'Wirkung von x-^w^ Wirkung von DFP *2)

•Wirkung von EDTA *3) Wirkung von Jodessigsäure

Isoelektrischer Punkt ;Molekulargewicht ^Aus d^er Literatur bekannte alkalische Proteasen 1*)

9-12,5.

100

nicht

inhibiert

nicht

inhibiert

nicht
inhibiert

etwa 9,5

etwa η. 1,7 χ 10

40-50
0

inhib.'

11
40-45

10,7-11 10,5
50-70

inhib.; nicht
^: inhib.

9,75
25000

19500-20500

11-12 etwa

100 etwa

inhib. _: inhib. inhib.

nicht inhib.

10,6

1 Bemerkungen: *1) Literatur: 1 = US-PS 3 503 923

2 = US-PS 3 427 270

3 = US-PS 3 828 OO9

4 = US-PS 3 713 983 5 = JP-OS 92582/1973

*2) DFP = Diisopropylfluorophosphat *3) EDTA = Äthylendiamintetraacetat *4) Das Symbol "-" "bedeutet, daß keine Daten

in der Literatur angegeben sind. 10

Von den bekannten alkalischen Proteasen ist das in der Literaturstelle 5, JP-OS 92582/1973 beschriebene Enzym der alkalischen Protease M, der Erfindung am nächsten. Die beiden unterscheiden sich jedoch voneinander in der Wirkung von DFP und im isoelektrischen Punkt.

Heben den vorstehend genannten Druckschriften werden in mehreren Literaturstellen noch verschiedene alkalische Proteasen beschrieben, die sich jedoch alle von der alkalisehen Protease FL der Erfindung unterscheiden. Beispielsweise zeigen die in den JP-PSen 10193/1966, 10755/1069 und 5038/1971 beschriebenen alkalischen Proteasen geringe Proteaseaktivität bei pH 12,5 und sind in diesem Punkt von der alkalischen Protease M, verschieden. Die alkalischen

^2!) Proteasen, die in den JP-P3en 923O/I97O und 41594/1971 sowie in der JP-OS 71191/1974 beschrieben sind, werden in ihrer Aktivität durch DFP und/oder Jodessigsäure gehemmt und unterscheiden sich somit in diesem Punkt von der alkalischen Protease M-, der Erfindung.

30 ⁵

Die alkalische Protease M-, der Erfindung unterscheidet sich somit von den bekannten alkalischen Proteasen in den physikochemischen Eigenschaften in der vorstehend angegebenen Weise. Sie ist ein neues Enzym. Insbesondere läßt sich die

alkalische Protease M, von den bekannten alkalischen Proteasen in folgenden Eigenschaften unterscheiden:

• · · 4

(i) Ihr optimaler pH-wert liegt im stark alkalischen

Bereich von 9 "bis 12,5; (ii) ihre Aktivität wird durch FeSO^, DFP, EDTA und

Jodessigsäure im wesentlichen nicht gehemmt; (üi) sie weist eine hemmende Wirkung gegen GTF "auf;

(iv) sie hat das niedrigste Molekulargewicht unter den alkalischen Proteasen.

Die neue alkalische Protease M der Erfindung kann durch Kultivierung eines Mikroorganismus der Art Streptomyces erhalten werden, die zur Erzeugung von alkalischer Protease M befähigt ist. Die alkalische Protease K-. wird sodann aus der Kultur "brühe gewonnen.

Ein geeignetes Beispiel für den Mikroorganismus der Art Streptomyces ist der Stamm Streptomyces globisporus B-18?9, der in USA bei American Type Culture Collection unter der Nr, ATCC 21553 und in Japan bei The Fermentation Research-Institute, Agency of Industrial Science & Technology (ΒΙΚΟΚΕΗ) unter der Bezeichnung EERM-P 596 niedergelegt wurde. Die physiologischen und morphologischen Eigenschaften und die Kultivierungsbedingungen dieses Mikroorganismus sind in der US-PS 3 929 579 im einzelnen beschrieben.

Die Gewinnung der alkalischen Protease M aus der Kulturbrühe kann durch eine geeignete Kombination von Behandlungen mit Amberlite CG-50, Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Behandlung mit CM Sephadex C-25, Behandlung mit Carboxymethylcellulose (CMC) oder ähnliche Verfahren durchgeführt wer-

30 den.

Der voistehaid. genannte Stamm Streptomyces globisporus B-1829 erzeugt zusätzlich zu der alkalischen Protease M_ auch ein auf kariogene Mikroorganismenzellen lysierend wirkendes Enzym. Die beiden Enzyme können oecL°^cl1 durch Auftragen des Gemisches auf eine CM Sephadex C-25 oder

L J

1 CMC-Säule voneinander getrennt werden.

Die alkalische Protease M₇ der Erfindung besitzt eine ausgezeichnete prophylaktische Wirksamkeit gegen. Karies und kann in üblicher Weise zur Behandlung der menschlichen Zähne zum Zweck der Verhinderung von Karies benutzt werden. J¹Ui¹ die Verwendung eignen sich übliche Einheitsdosierungen gegebenenfalls mit üblichen Trägern oder Verdünnungsmitteln. Als übliche Trägerstoffe, Verdünnungsmittel, Hilf oder Zusatzstoffe kommen beispielsweise Wasser,Zahn-Reinigungs / Zahnpasta, Kaugummis oder Salben in Frage. Das Enzym der Erfindung ist in den Mitteln in einer Menge von 0,001 bis 5» vorzugsweise von 0,05 bis 1 Gewichtsprozent enthalten.

Bei der Herstellung von Zahnpasta und Zahn-Reinigungspulver mit einem Gehalt an'dem Enzym der Erfindung werden übliche Trägerstoffe verwendet, mit der Maßgabe, daß sie keine wesentlichen unerwünschten Wirkungen auf die Aktivität des Enzyms haben. Ein wasserunlösliches Poliermittel kann in der Zahnpasta bzw. dem Reinigungspulver enthalten sein.

Spezielle Beispiele für verwendbare Poliermittel sind Dicalciumphosphat oder Tricalciumphosphat. Die Poliermittel stellen gewöhnlich einen größeren Gewichtsanteil der festen Bestandteile dar. Der Gehalt an Poliermitteln liegt vorzugsweise bei etwa 30 bis 60 Gewichtsprozent des gesamten Gemisches bei einer Zahnpasta bzw. bei 85 bis 95 Gewichtsprozent in einem Reinigungspulver.

Bei der Herstellung von Zahnpasta können außerdem bestimmte Weichmacher zugesetzt werden. Spezielle Beispiele dafür sind 'Wasser, Glycerin, Sorbit, Propylenglykol, Monoglycerylstearat, weiße Rohvaseline, Cetylalkohol oder Gemische davon. Die Zahnpasta wird vorzugsweise mit einem Gelierungsmittel, wie Natriumcarboxymethylcellulose, Hydroxyäthylcellulose, Polyvinylpyrrolidon oder Tragacanthgummi versetzt, und kann außerdem als weitere Zusätze beispielsweise

L J

^r *i"iV- '"' "^ν *-* *^:* 310221 ^

Aromastoffe, Süßstoffe und Farbstoffe enthalten. Bei der Herstellung von Kaugummi mit einem Gehalt an dem Enzym d^r Erfindung können übliche Gummigrundstoffe, wie Chiclehar:'. oder Polyvinylacetat verwendet werden. Der Kaugummi kann außerdem mit anderen üblichen Trägerstoffen, wie Plastifiziermitteln, Weichmachern, Süßstoffen, Aromastoffen od^r Farbstoffen versetzt werden.

Eine weitere Möglichkeit der Anwendung des Enzyms der Erfindung besteht in Form einer Salbe. Dabei wird die das Enzym der Erfindung enthaltende Salbe auf die zu behandelnden Zähne aufgebracht und danach mit dem Finger oder ein^r Zahnbürste gerieben. Die Salbe kann in üblicher V/eise unter Verwendung herkömmlicher Träger zubereitet werden, welche sich zur Verwendung im Mund eignen, sofern sie keine hemmende oder zerstörende Wirkung auf das Enzym der Erfindung ausüben. Spezielle Beispiele für geeignete Salbengrundlagen sind Natriumcarboxymethylcellulose, Hydroxyäthylcellulose und Piastibase 50 W, die eine pastenartige oder cremige Salbe ergeben.

Das Enzym der Erfindung kann auch in Form einer kaubaren Tablette oder Pastille verwendet werden. Je nach dem Kauen oder Halten der kaubaren Tablette oder Pastille mit einem Gehalt an dem Enzym der Erfindung im Mund kann das Enzym in ausreichendem Maß mit den Zähnen über längere Zeit in Berührung kommen. Die kaubare Tablette oder Pastille kann in üblicher Weise unter Verwendung herkömmlicher Trägerstoffe, wie Mannit oder Sorbit, sowie anderer üblicher Gleitmittel, Süßstoffe oder Farbstoffe hergestellt werden.

Das Enzym der Erfindung kann auch mit Konfekt, wie Candy oder Kuchen vermischt werden. Ferner kann das Enzym der Erfindung im Gemisch mit Nahrungsmitteln oder Getränken verabreicht werden. In diesem Fall kann das Enzym den Nahrungsmitteln oder Getränken vor oder nach ihrer Verar-

L J

¹ beitung zugesetzt werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

5 Beispiel 1

Herstellung der alkalischen Protease M,: Durch Kultivieren des Stammes Stneptomyces globisporus B-1829 (ATCC 21555) in 70 Liter Kulturmedium mit dem pH-Wert 7,5, das aus 2% Dextrin, 0,5% Sojabohnenpulver, 0,25% Pepton, 0,5% Na₂HPO₄, 0,1% KH₂PO₄, 0,1% MgSO₄ und 0,5% NaCl besteht, gemäß US-PS 3 929 579 wird eine Kulturbrühe erhalten, die danach mit einer Filterpresse filtriert wird. Dabei werden 70 Liter Filtrat erhalten.

Das Filtrat wird mit 2,8 kg Amberlite CG-50 in der H⁺~Form versetzt. Das erhaltene Gemisch wird 1 Stunde zur Adsorption des Enzyms in das Harz bewegt. Danach wird das Harz abzentrifugiert. Anschließend wird das Harz mit dem adsorbierten Enzym mit 10 Liter 0,2 M Na₂HPO₄ versetzt, mit wäßrigem Ammoniak auf den pH-Wert 7,5 gebracht und 1 Stunde gerührt. Dadurch wird das Enzym eluiert. Es werden 12 Liter Eluat erhalten, die mit festem Ammoniumsulfat auf 60% Sättigung versetzt werden. Sodann wird das Gemisch etwa 15 Stunden bei 4°C stehengelassen. Der erhaltene Niederschlag wird ab-

²^ filtriert und in 1,8 Liter Leitungswasser gelöst, wobei eine wäßrige Lösung von Enzymen erhalten wird. Die wäßrige Lösung wird mit 1n HCl auf den pH-Wert 2,0 eingestellt und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Neutralisieren auf den pH-Wert 6,0 mit 1n Natronlauge wird die Lösung gegen fließendes Wasser dialysiert. Es werden 2,3 Liter Lösung erhalten.

Die derart erhaltene Lösung wird durch eine Säule (4- χ 40 cm) geschickt, die mit CM Sephadex C-25 in der Na -Form gefüllt ^3a ist. Danach wird die Säule mit entionisiertem Wasser gewaschen, bis keine Absorption bei 280 nm mehr beobachtet wird.

L ' J

— ι / —

Die Säule wird anschließend mit einem linearen Konzentrationsgradienten unter Verwendung von 3. Liter Wasser und 3 Liter 0,2 M Phosphatpuffer vom pH-'^ert 7,0 eluiert. Die Fraktionen (etwa 4-00 ml), die bei einer Pufferkonzentration von etwa 0,03 bis 0> 05 M eluiert werden, werden gesammelt, entsalzt und mit Dia-Filter AS 201 (Bio Engineering Co., Ltd.) konzentriert. Es werden etwa 50 ml konzentrierte Lösung erhalten, die lyophilisiert werden. Ausbeute: 0,7 g alkalische Protease M,. Das Enzym besitzt

eine Proteaseaktivitat von 730 U/mg.

Die .Aminosäureanalyse des Enzyms ergibt die in Tabelle III aufgeführten Ergebnisse. In Tabelle III sind zum Vergleich auch die Werte der alkalischen Protease gemäß JP-OS 92532/1973 aufgeführt.

Tabelle III

Aminosäure

!Asparaginsäure
!Threonin
Serin
,Prolin

Glutaminsäure
!Glycin
[Alanin
Valin
Cystin
!Methionin
isoleucin
Leucin
Tyrosin
Phenylalanin
Tryptophan
Lysin
Histidin
Arginin

Alkalische Protease M.

Alkalische Protease nach JP-OS 92582/1973

15

21

24

7 27

13 15 2 1 M-8 8 6 2 2 1 8

19 11 21 10

24

25

17

0 2 6 13 5 1 2 3 3 5

Molukulargewicht

17

Versuch GTF-Hemmwirkung:

Die hemmende Wirkung der alkalischen Protease M, sowie "bekannter Proteasen auf GTP, die vom K^-R Stamm und AHT Stamm von Streptococcus mutans erzeugt wird, wird in der vorstehend angegebenen Weise bestimmt. Die Proteasen werden in einer Menge von 160 U/ml eingesetzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.

10

20 25 30

	- 19	*·· · ·**	—	Erzeugt vom K_-1-R Stamm	_	* * * • · ♦ #*	3 102216-	vom AHT	76,8
	Tabelle IV	Enzym- ■ Hemmrate,				Hemmrabe,
		aktivität.;	72,5			! aktivität % \	27,8
Proteasen	GTF	577,5 ;			I	j 580,0	26,0 ; i
(Oütimaler pH-Wert)		27,0	Erzeugt . Stamm	ι	14,0
	160,4 j	25,1	[ Enzym-	; 155,0	0
		15,5
- Vergleich	421,3	-2,0	418,5 i	8,2
Alkalische	4-32,8		4-29,0
'Protease M, (9-12,5)	489,0	10,0	; 498,5
Pronase (0,8)	589,4 I	erzeugtes	579,4-
ov. -Chymotryp sin (7,8)
!Proctase (2,6)	520,0 ;	552,4
Papaine (5,0)	*) Ein von Bacillus subtilis	Enzym
Neutrale
Protease* (7,0)

Tabelle IV zeigt, daß die alkalische Protease M, der Erfindung eine stark hemmende Wirkung auf GTF besitzt. Wie bereits erwähnt, wird die Messung der hemmenden Wirkung auf GTF bei einem pH-Wert von 6,8 durchgeführt, bei dem eine neutrale Protease eine hohe Aktivität zeigt. Trotzdem besitzt die zum Vergleich untersuchte neutrale Protease fast keine Hemmwirkung auf GTF. Auch die bekannten alkalischon Proteasen Pronase und ^v. -Chymotrypsin besitzen sehr geringe Hemmwirkung auf GTF.

35

310221&1

1 Versuch 2

Inhibierung der Karies:

Eine Gruppe von 10 Goldhamstern mit einem Alter von drei Wochen wird mit der kariogenen Diät Nr. 2000 gemäß Archives of Oral Biology, Bd. 9 (1964), 8. 377-400 1 Woche lang ernährt, jiine Kultur des Stammes Streptococcus mutant AHT wird in beide Backentaschen der Hamster in einer Menge von 0,1 ml überimpft.

Sodann werden die Hamster weitere 4 Wochen mit der vorstehend bezeichneten kariogenen Diät Nr. 2000 mit einem Gehalt an Proteasen ernährt. Die Karies der Backenzähne der Hamster wird sodann nach dem Verfahren von P.H. Keyes und Mitarb., J. Dental Research, Bd. 23 (1944), S. 439-444 ausgewertet. Die Probenummer der Backenzähne ist dabei den mit der Auswertung beschäftigten Personen nicht bekannt. Die Ergebnisse sind in Tablle V zusammengefaßt.

• · f

31022Ί6"¹

Tabelle V

!Proteasen

Hemmung der Karies

j Art Menge, \ Punktwertung

ι(Optimaler pH-Wert) U/g j

Hemmrat a, % *2

Alkalische Pro	600	t I 62,	81	± 7,	12	*3	ί 62,	5
tease M,	1200	I 41,	29	ί 4,	03	*3	! 90,	2
(9-12,5)	2400	! 10,	16	ί 3,	24	*3	7

IPronase !(8,0)

600 1200

+ 8,43 *4-93,55 + 6,98 *4

0,1 14,4

I <Λ -Cymotrypsin !(7,8)

;Proctase

^! 600 h09,82 + 8,12 *4 j 1200 ; 99,60 + 6,74 *4

600 108,93 + 6,23 *4 1200 110,54 + 5,38 *4

-0,5 8,8

0,3 -1,2

: Papaine 1(5,0)

'Neutrale !Protease |

! 600 110,13 + 7,82 *4

j 1200 hi5,2O + 8,68 *4

600 '110,23 + 7,84 *4-

ι

hi0,00 + 8,23 *4

Vergleich

;1O9,24 + 4,19 *4

-0,8 -5,5

-0,9 -0,7

(0)

*1) Von Bacillus subtilis erzeugtes Enzym *2) Die Hemmrate wird nach folgender Gleichung berechnet:

Hemmrate = -A-JlJ* χ 100

A dabei bedeutet A die Punktzahl bei den Vergleichstieren

und B die Punktzahl beim Zusatz der Protease *3) Nennenswerter Unterschied zu den Vergleichstieren, P <0,01

* 4) kein nennenswerter Unterschied zu den Vergleichstieren.

Aus den Werten in Tabelle V ist zu ersehen, daß die alkalische Protease M der Erfindung hervorragende Hemmwirkung auf Karies zeigt, während andererseits die bekannten Proteasen keine Hemmwirkung gegen Karies besitzen.

Beispiel2

Aus den nachstehenden Bestandteilen wird in üblicher Weise eine Zahnpasta hergestellt.

Bestandteil Gewicht sproz ent

Glycerin	25,70
Katriurncarboxymethylcellulose	0,95
Destilliertes Wasser	20,15
Dicalciumphosphat	46,00
Calciumcarbonat	5,80
Saccharin	0,25
Geschmacksstoff	0,65
Alkalische Protease M, gemäß	0,005
Beispiel 1 ⁵	7 •

Gesamt 100,00

Beispiel 3

Ein Zahn-Seinigungspulver wird in üblicher Weise aus fol genden Bestandteilen hergestellt.

Bestandteil Gewichtsprozent

Natriumlaurylsulfat	0,3
Natriumcarboxymethylcellulose	1
Dinatrxumhydrogenphosphat	2
Saccharin	0,2
Geschmacksstoff	1,8
Alkalische Protease M₂- gemäß	0
Beispiel 1
Dicalciumphosphat	Rest

rse

Leerseite

Claims

Patentansprüche

1. Alkalische Protease M-,, gekennzeichnet durch die nachstehenden chemischen und physikalischen Eigenschaften:

(1) Aktivitäten: Sie kann Casein hydrolysieren und inhibiert die Wirkung von Glykosyltransferase.

(2) Optimaler pH-;7ert und pH-Stabilität: Der günstigste pH-Bereich beträgt 9 bis 12,5 (Substrat: Casein). Bei der Aufbewahrung in Pufferlösung mit einem pH-Wert von 4 bis 9 "bei 3 7° C verbleiben nach 6 Tagen mindestens etwa 50% der Protease-

aktivität.

(3) Günstigste Temperatur und Wärmestabilität: Die günstigste Temperatur beträgt etwa 65°C (Substrat : Casein). Eine wäßrige Lösung des Enzyms ist sogar bei 10 Minuten Erhitzen auf 55⁰C stabil.
(4·) Bedingungen der Inaktivierung: Beim Erhitzen

einer wäßrigen Lösung des .Enzyms während 10 Minuten auf 60°C geht etwa 50% der Proteaseaktivitat verloren; beim Erhitzen der wäßrigen Lösung

auf 65⁰C während 10 Minuten gehen mindestens 90% der Aktivität verloren.

L J

(5) Wirkung verschiedener Zusätze: Die Proteaseaktivität des Enzyms wird vollständig inhibiert durch 10 M N-Bromsuccinimid, dagegen praktisch nicht inhibiert durch 10 M Jodessigsäure, Diisopropylfluorophosphat, A'thylendiamintetraacetat und

(6) isoelektrischer Punkt: etwa pH 9i5.

(7) Molekulargewicht: etwa 1,7 χ 10 .

2. Verfahren zur Herstellung der alkalischen Protease ML gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Art Streptomyces kultiviert, der in der Lage ist alkalische Protease M_ zu erzeugen,

3 und die alkalische Protease ML aus der Kulturbrühe ge-

15 winnt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces globisporus verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm von Streptomyces globisporus B-1829 (ATCG 21553) verwendet.

_or 5-· Verwendung der alkalischen Protease M gemäß Anspruch 1 zur Vorbeugung und Verhinderung-von Zahnkaries.

6. Mittel zur Verhinderung von Zahnkaries, gekennzeichnet

durch einen Gehalt an alkalischer Protease M, im Ge-

3 misch mit üblichen Träger-, Hilfs- und Zusatzstoffen.

7. Mittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die alkalische Protease M, in einer Menge von 0,001 bis 5 Gewichtsprozent enthalten ist.

L. J