DE2610504A1

DE2610504A1 - Verfahren zur herstellung einer von pseudomonas aeruginosa stammenden komponente aus zucker, lipoid und protein, mit antitumor- und interferon bildenden eigenschaften

Info

Publication number: DE2610504A1
Application number: DE19762610504
Authority: DE
Inventors: Yuzuru Prof Homma
Original assignee: University of Tokyo NUC
Current assignee: University of Tokyo NUC
Priority date: 1975-05-14
Filing date: 1976-03-12
Publication date: 1976-11-25
Also published as: GB1537509A; SE7601841L; CA1060797A; FR2311093B1; JPS6123167B2; US4079126A; DE2610504C2; JPS51133489A; FR2311093A1; SE434701B

Description

PRESIDENT OP THE UNIVERSITY OP TOKIO, Tokyo / Japan

Verfahren zur Herstellung einer von Pseudomonas aeruginosa stammenden Komponente aus Zucker, ILipoid und Protein, mit Antitumor- und Interferon bildenden Eigenschaften

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von originalem bzw. ursprünglichem Endotoxinprotein von Pseudomonas aeruginosa· Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von originalem Endotoxinprotein von Pseudomonas aeruginosa (im folgenden als OEP abgekürzt) durch Verarbeitung mit entweder proteolytischem Enzym oder Reduktionsmittel und weiterer Verarbeitung mit proteolytischem Enzym nach der Behandlung mit Reduktionsmittel.

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Es ist bekannt, daß Pseudomonas aeruginosa natürlich resistent gegen die meisten allgemein verwendeten Antibiotika sind. Zwar sind einige wenige Antibiotika wirksam, doch ist die Anwendung von Antibiotika bei Neugeborenen, die in ihrer Immunität sreaktion physiologisch unreif sind oder bei Verabreichung von die Immunität herabsetzenden- Mitteln, nicht wirksam· Andererseits werden sowohl erwachsene Menschen als auch !Eiere, die eine· normale Immunität besitzen, kaum von natürlichen Infektionen durch diesen Bakteriengenus befallen, und selbst bei einer Infektion sind für sie Antibiotika wirksam.

Aus dem Vorstehenden ist ersichtlich, daß eine Immunität gegen diesen Bakteriengenus wirksam gegen die Infektion durch diesen Bazillus ist. Hir eine gewisse Infektionsart durch diesen Bakteriengenus jedoch sind weder aktive noch passive Immunität (Serum oder Plasma) wirksam.

Das thermostabile O-Antigen, ein Lipopolysaecharid (IPS), hergeleitet von Pseudomonas aeruginosa, ist als ein in Pseudomonas aeruginosa erzeugtes Antigen bekannt, das die Eigenschaft besitzt, Menschen, Mäuse und Kaninchen vor der Infektion durch Stämme von Pseudomonas aeruginosa mit homologem Serotyp zu schützen.

Da jedoch dieses O-Antigen in seiner Schutzwirkung immunologisch spezifisch wirkt, weist es den Nachteil auf, daß Menschen oder Tiere, die mit einem speziellen O-Antigen immunisiert sind, lediglich vor Infektionen geschützt werden können, die von Bakterienstämmen erzeugt werden, die dem Stamm vom zum Immunogen homologen Serotyp angehören, jedoch kaum eine Schutzwirkung gegenüber Infektionen durch Bakterienstämme aufweisen kann, deren serologische Spezifität heterolog ist.

Jedoch konnte gemäß einer aus der britischen Patentschrift 1 365 950 bekannten Methode zur Isolierung von OEP aus Pseudomonas aeruginosa (das hierin erwähnte OEP ist äquivalent zu dem

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in der genannten britischen Patentschrift bezeichneten CWP) isoliert werden, das fast kein O-Aiitigen enthielt und es hat eich gezeigt, daß dieses OEP ein Antigen war, das Menschen, Mäuse und Kaninchen in einem breiten Ausmaß auch vor Infektionen durch Stämme von Pseudomonas aeruginosa von unterschiedlichem Serotyp schützen kann·

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer Verbesserung des Verfahrens der vorstehend genannten britischen Patentschrift 1 365 950· Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Herstellung einer bakteriellen Komponente von Pseudomonas aeruginosa, die eine wirksamere biologische Aktivität (Antitumor- und Interferon-induzierende Wirksamkeiten) besitzt, durch weitere Verarbeitung von gemäß der britischen Patentschrift 1 365 950 erhaltenem OEP mit entweder einem Reduktionsmittel oder einem proteolytischen Enzym nach der Behandlung mit dem Reduktionsmittel.

Weitere Gegenstände und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung·

Die beigefügte Figur 1 stellt ein Elutionsdiagramm von mit 2-Mercaptoäthanol behandeltem OEP mittels einer Säulenchromatographie an Sephadex G75 (quervernetztes Dextran) dar und die Figur stellt ein Elutionsdiagramm der Substanz des Peaks I der Figur dar, behandelt mit alkalischer Protease durch eine Säulenchromatographie an Sephadex G75-

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Dissoziations-Stamm von Pseudomonas aeruginosa in eiuem Fermentor inokuliert und bei 37⁰C kultiviert. Eine Menge eines autolysierenden Mittels, wie !Toluol oder Chloroform, wird zu der Bakterienkultur einige Stunden nach Erreichen des stationären Zustande zugefügt, so daß eine Autolyse eintreten kann. Eine Komponente, die im wesentlichen aus Protein und einer geringen Menge

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von Lipoid und Zucker besteht (im folgenden als OEP abgekürzt), ■wird aus dem Kulturfiltrat isoliert und durch physikochemische Methoden bis zur Homogenität gereinigt.

Anschließend wird das so erhaltene OEP entweder mit einem proteolytischen Enzym oder einem Reduktionsmittel verarbeitet oder nach dem Verfahren mit dem Reduktionsmittel weiter mit proteolytischen Enzymen digeriert, die sich von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen ableiten, wodurch die bakterielle Komponente von Pseudomonas aeruginosa erzeugt wird, die äußerst starke Antitumoreigenschaften und Interferon induzierende Eigenschaften besitzt.

Die bakterielle Komponente von Pseudomonas aeruginosa, die nach der von den Erfindern beschriebenen Methode erhältlich ist, be- ' sitzt eine äußerst starke biologische Aktivität. ¥as die Methode der Isolierung von OEP betrifft, das aus hoch gereinigtem Protein besteht, so sind weitere Details der vorstehend genannten britischen Patentschrift 1 365 950 zu entnehmen, die zum Teil den gleichen Erfindern zuzuschreiben ist.

Deutlicher ausgedrückt bedeutet der Ausdruck "starke biologische Aktivität" Antitumorwirksamkeit und Interferon induzierende Wirksamkeit, sowie eine nicht spezifische Schutzwirkung gegen den Bazillus und darüberhinaus eine Yaccine-Aktivität, die die Infektion durch Pseudomonas aeruginosa Stämme unabhängig von ihren Sero typen bewirkt.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung der bakteriellen Komponente mit einer äußerst starken biologischen Aktivität, wie sie vorstehend erwähnt wurde, durch Verarbeitung von OEP mit einer starken biologischen Aktivität mit einem Reduktionsmittel und anschließendes Digerieren mit proteolytischem Enzym.

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Unter Anwendung der vorstehenden Methode wurde OEP durch Massenkultur von Bakterienstämmen von Pseudomonas aeruginosa erhalten. Es erwies sich, daß dieses OEP eine beträchtliche biologische Aktivität aufweist. Ausgedrückt als Inhibitionswirkung auf das Wachstum von Ascites-Tumor (Sarcom 180) beträgt die Dosis an OEP zur 50 $-igen Inhibierung (ED₅₀) 1 /Ug/kg Maus/Tag gemäß der Methode von Kuretani et al.

Wird dieses OEP mit Reduktionsmitteln, wie Fatriumborhydrid, 2-Mercaptoäthanol, flatriummonothiophosphat und Dithiothreitol bzw. Dithiothreit behandelt und durch eine Praktionierungsmethode, wie Gelfiltration, Behandlung mit Ionenaustauscherharz, Aussalzen von Ammoniumsulfat und Elektrophorese sowie nach der Methode unter Anwendung organischer Lösungsmittel, wie Aceton und Äthanol oder deren Kombination, fraktioniert, so kann man eine bakterielle Komponente erhalten, die eine biologische Wirksamkeit aufweist, die in ihrer Antitumor-Wirksamkeit und Interferon-induzierenden Wirksamkeit effektiver ist (vgl. Beispiel 1).

Wie die Beispiele zeigen, beträgt seine Aktivität gegen das Sarcom 180 A, ausgedrückt als ED^Q-Wert, 0,45/Ug/kg Maus/Tag und die Interferon-induzierende Aktivität beträgt 0,01 /Ug/ml in der 18 Einheiten darstellenden Konzentration. Anschließend wird die durch das Reduktionsmittel isolierte Substanz, mit einer starken biologischen Wirksamkeit mit einem proteolytischen Enzym digeriert« Für das erfindungsgemäße Verfahren sind proteolytische Enzyme anwendbar, die sich von Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen ableiten. Erhältliche derartige Enzyme sind beispielsweise alkalische Protease, die sich von Bacillus subtilis ableiten, Trypsin und Chymotrypsin und alkalische Protease, die sich von Pseudor monas aeruginosa ableitet.

Es kann auch eine bakterielle Komponente isoliert werden, die eine äußerst starke biologische Aktivität aufweist, wenn man eine der Praktionierungsmethoden, wie Gelfiltration, Diaphragma, Ionen-

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austauscherharz, Elektrophorese und Aussalzen von Ammoniumsulfat, sowie die Methode unter Anwendung von organischen Lösungsmitteln, wie Aceton und Äthanol oder Kombinationen davon, anwendet, nachdem das Digerierverfahren mit einem oder einer Mischung dieser proteolytischen Enzyme durchgeführt wurde (vgl. Beispiele 2 und 3).

Die Substanz, die man durch Behandeln mit dem Enzym erhält, besteht aus Komponenten wie Protein, Zucker, Aminozucker und Lipoid, deren chemisch analysierte Werte 15-50 fo, 10-20 #, 10-20 # bzw. 25-40 fo betragen.

1) Genauere Angaben über die chemisch analysierten Werte dieser Substanzen und die chemischen Eigenschaften sind in den geweiligen Beispielen 1, 2 und 3 angegeben.

2) Biologische Aktivität (obwohl diese Aktivität durch Injektion bewirkt werden kann, ist sie auch bei oraler Verabreichung zu erwarten).

i) Aktivität als ein Antigen (Taccine) mit spezifischen oder unspezifischen Eigenschaften zur Verhinderung von Infektionen.

Als unspezifischer preventiver Effekt wurde tatsächlich die Infektion von Mäusen, bewirkt durch Klebsiella, Salmonella typhi und Salmonella typhimurium 24 Stunden nach der Immunisierung mit OEP (vor der Behandlung mit dem proteolytischen Enzym) erfolgreich verhindert.

Mäuse wurden gegen Erkrankungen, hervorgerufen durch sieben Fisher's Immunotyp-Stämme und vierzehn Arten von Homma's Serotyp-Stämmen, aufgeführt in den nachfolgenden Tabellen A und B, geschützt.

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Tabelle A

Wirkung der OEP-Vaecination zum Schutz von Mäusen gegen Erkrankung, hervorgerufen durch jeden der folgenden vierzehn Serotyp-Stämme von Homma's Serotyp.

Serotyp des LD zur Infektion	1	2.6	50	(Anzahl der lebenden Bazillen)	Unter schied	2.6	X	10³	S
von Mäusen ver- ^ wendeten Stammes	2	3.2	mu]	nisiert (A) unbehandelt(B) (\|)^S°^h(B	2.0	X	10¹	S
T	" 3	2.8	X	10⁴	2.8	X	10²	S
T	4	>2.0	X	10³	2.0	X	10⁷	S
T	5	>2.2	X	10³	2.2	X	IO¹	S
T	6	>1.5	X	10⁸	1.5	X	10⁵	S
T	7	2.4	X	10⁷ <	2.4	X	10¹	S
T	8	1.5	X	10⁸	1.5	X	10*	S
T	9	3.8	X	10²	3.8	X	10²	S
T	10	4.1	X	10⁶	1.0	X	10^s-	S
T	11	1.9	X	io⁴ · <	7.5	X	ΙΟ¹	S
T	12	5.3	X	10⁶ .	2.1	X	10³	S
T	13	3.3	X	10³	6.6	X	10¹	S .
T	14	>2.9	X	10⁵ <	2.9	X	10*	S
' T	X	10⁴
T	X	10⁶

Mäuse wurden durch intraperitoneale Verabreichung von OEP immunisiert und eine Woche nach der letzten Injektion wurden jeder Maus intraperitoneal 0,5 ml einer Suspension von lebenden Bazillen in 2-5 i° Mucinlösung injiziert (S bedeutet beträchtlich).

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Tabelle B

Die Auswirkung der OEP-Impfung (Vaccination) zum Schutz von Mäusen gegen die Infektion mit jedem von sieben Arten von Stämmen des Fisher-Immunotyps

Serotyp des zur EDeq (Anzahl der lebenden Unterschied Infektion τοη ^p Bazillen) zwischen

Mäusen verwende- ^ ten Stammes τΡ. bit	1	1.4	Ώ.ΜΊ	10⁷	unbehandelt (B)	X	10⁴	(A) + (B)
F	2	>1.7	X	10⁶	8.8	X	10⁴	S
F	3	>1Λ	X	10⁷	2.1	X	10³	s ·
F	4	3.8	X	10⁵ .	5.4	X	10⁴	s
F	5	>3.9	X	10⁵	1.5	X	10⁴	S
• F	6	1.0	X	ίο⁶	1.0	X	10⁴	S
F	7	>1.4	X	10⁷	6.3	X	10³	S
F	X	1.8	S '.

An Mäuse wurde OEP intraperitoneal injiziert und eine Woche nach der letzten Injektion wurden die Mäuse intraperitoneal mit einer Suspension von lebenden Bazillen in 0,5 ml 2-5 ^-iger Mucinlosung infiziert.

Wie die experimentellen Ergebnisse des Beispiels 5 zeigen, konnte die Komponente, die mit dem proteolytischen Enzym behandelt worden war und in Peak 1 isoliert worden war, die Mäuse nicht von allen Serotyp-Stämmen gemäß Pisher's Immunotypen schützen, in gleicher Weise wie vor der Behandlung mit dem proteolytischen Enzym (vgl, Tabelle C) ·

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Tabelle G

Auswirkung einer Impfung bzw. Vaccination durch mit Protease behandeltem OEP auf den Schutz von Mäusen gegen die Infektion mit jedem von sieben Stämmen von Fisher's Immunotypen von Pseudomonas aeruginosa

Serotyp des zur · IiDcq Infektion von ^p	1	1.5	imu: ler	(Anzahl der Bazillen)	lebenden	X	10² -	Unterschied zwischen
Mäusen verwende- ., ten Stammes ~:	2	7.9	X	t (A)	unbehandelt (B)	X	10²	(A) + (B)
F	3	2.1	X	10⁴ <	3.7	X	10² ·	■s
F	4	3.1	X	10³	2.0	X	10*	S
F	:5	3.7	X	10²	1.5	X	10²	NS
F	6	3.9	X	10⁴	1.9	X	10²	^; NS ·
. F	7	6.5	X	10⁴ <	2.4	X	10²	S
F	X	10⁵	6.3	s-
F	10⁴	4.1	S

Mäusen wurde das mit Protease behandelte OEP intraperitoneal injiziert und eine Woche später wurden die Mäuse intraperitoneal mit lebenden Bazillen, suspendiert in 0,5 ml einer 2,5 $-igen Mucinlösung, infiziert. (S bedeutet beträchtlich, NS bedeutet unwesentlich).

Obwohl eine Taccine, die aus mit Protease behandelt am OEP hergestellt wurde, nicht so wirksam wie das intakte OEP ist, das keiner Enzymbehandlung unterzogen wurde, weist es daher noch eine große Wirksamkeit in einem breiten Ausmaß als Immunopotentiator beim in vivo-Schutzmechanismus auf.

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(ii) Antitumor-Aktivität

Zur Messung der Antitumoraktivität wurde die Wirkung der Inhibierung des Tumorwachstums des Ascites-Tumors von Mäusen (Sarcom 180) nach der von Kuretani eta al. (Chem. Pharm. Bull., 17, 848, 1969) verwendeten Methode untersucht.

Weibliche Mäuse mit einem Gewicht von 18-20 g ddU wurden in Gruppen von 6 Mäusen zur Untersuchung herangezogen. Jeder Maus v/urden 0,05 ml 7 Tage alte Ascites-Tumorzellen (1 χ 10^) intraperitoneal transplantiert und vom folgenden Tage an wurde eine Salzlösung, die die zu untersuchende Probe enthielt, intraperitoneal einmal täglich pro Maus während 5 Tagen injiziert. Eine Ascites-Flüssigkeit wurde 7 Tage nach der Transplantation des Tumors entnommen und das darin enthaltene gesamte Zellvolumen wurde prozentual zum Gesamtzellvolumen der Eontrollgruppen (denen physiologische Salzlösung verabreicht wurde) bewertet.

Bei der Untersuchung nach dieser Methode erwies sich das HEP vor der Behandlung mit dem proteolytischen Enzym als eine Substanz mit einer ED,-Q-Dosi8, erforderlich zur Inhibierung des Wachstums von 50 fo Tumorzellen von 1 /ug/kg Maus/Tag und zeigte fast keine Abweichung bei den unterschiedlichen Gruppen, die für die Kultur verwendet wurden, wie in Tabelle D gezeigt.

Tabelle D

Antitumor-Aktivität von OEP. hergeleitet von verschiedenen Gruppen bzw. Stämmen

Gruppen EDc_n (/Ug/kg Maus/Tag) ITr. . OM i -

1	1	1,50	,13
2	609	1,20	960
3	0,90
4-	1,00
5	0,72
Durchschnitt	,06 + 0
	848/0

Tabelle E

Antitumor-Wirkung anderer bakterieller Komponenten von Pseudo monas aeruginosa, die sich von OEP unterscheiden, sowie die anderer Mikroorganismen

Testlösung ^EI>50

Komponente I (Pseudomonas

aeruginosa P I-III) 100

Komponente II (Pseudomonas

aeruginosa P I-III) 500

Pyocin Emc *^ (Pseudomonas

aeruginosa P 15) 1 000

konjugiertes Protein

(Shigella dysenteriae) 14

Zymosan (Saccharomyces

cerevisiae) 700

*1 OEP-^S-Konjugat

Hueleinsäure-Polyribosephosphat-Konjugat einfaches Protein

konjugiertes Protein
*5 Bydroglukan

Es zeigte sich auch, daß es eine Substanz "war, die eine äußerst große Wirksamkeit aufwies im Vergleich mit bakteriellen Komponenten, die sich von anderen Mikroorganismen ableiten und mit den Komponenten, die sich von OEP unterscheiden und vie in !Tabelle E gezeigt, von Pseudomonas aeruginosa stammen, Darüberhinaus wurde bestätigt, wie in den Beispielenil, 2 und 3 gezeigt, daß der vorstehende EDcQ-Wert von OEP nach chemischen Behandlungen auf 0,2/Ug/kg Maus/Tag angestiegen war und daß diese Antitumor-Aktivitäten auch bei oraler Verabreichung zu erwarten waren.

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(iil) Interferon-induzierende Wirksamkeit

Die Interferon-induzierende Wirksamkeit (IP) wurde nach der von Kojima et al ("Interferon", Igakushoin, 74-83, 1970, Kitasato Arch. Exp. Med., 43, 1970, Japan J. Microbiol., 18, 217-222, 1974) angewendeten Methode gemessen.

Die Kulturlösung, die 0,005 1° Calciumchlorid und 10 <fo Kälberserum enthielt, wurde als 1/200 mol Pufferlösung verwendet. Anschließend wurde eine zehnfache Verdünnung der Testlösung hergestellt und diese Testlösung wurde mit 1 bis 2 ζ 1O^ Zellen von jungen Kaninchen mit einem Gewicht von 800-1000 g vermischt (Milz- oder Lymphknotenzellen). Diese Mischung wurde in einem Eulturrohr 24 Stunden bei 25⁰C kultiviert. In der zentrifugierten überstehenden Flüssigkeit wurde die Interferon-induzierende Eigenschaft unter Anwendung der EK13-Zellinie der Eaninchenniere und des Vesicular StomatitisJ-Virus bestimmt.

Die Interferoneinheit (IP-Wert) wurde als reziproker Wert des Verdünnungs-Vielfachen der vorstehenden überstehenden Kulturflüssigkeit ausgedrückt, die zur Verminderung der Scheibenanzahl (etwa 100) der Kontrollgruppe auf etwa 50 $ erforderlich war. Wie die Beispiele 1, 2 und 3 sowie die Tabelle P zeigen, wurde gefunden, daß der IP-Wert von OEP bis zu einer Potenz von etwa 10-fach höher angehoben werden konnte, wenn das OEP mit Enzym behandelt wurde.

Tabelle P
Interferon (IP) induzierende Eigenschaften

IP-Wert

Probenkonzentration ( /Ug/ml) 1 0,1 0,01

OEP 450 140 12

OEP-ME⁺¹ 490 310 18

OEP-ME-Pro"¹"²

(Heu- bzw. Hay-Bazillus) 470 440 184

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OEP-ME-PrO⁺^ (Pseudomonas aeruginosa) OEP-ME-Pep⁺^ OEP-ME-Try"¹"⁵

470	310	132
480	330	202
490	390	214

+1 Peak I isoliert in Beispiel 1

+2 Peak I isoliert in Beispiel 2

+3 Peak I isoliert in Beispiel 1, digeriert mit Protease, hergeleitet von Pseudomonas aeruginosa und erhalten durch Gelfiltration

+4 Peak I isoliert in Beispiel 1, digeriert mit Pepsin (hergestellt durch Sigma) und erhalten durch Gelfiltration

+5 Peak I isoliert in Beispiel 3.

Die Erzeugung von Seruminterferon wurde verdeutlicht, wenn OEP intravenös an Kaninchen injiziert wurde. Die Bildung eines Vaecinevirus auf der Haut wurde durch orale Verabreichung von OEP an das Kaninchen inhibiert (vgl. Beispiel 4)·

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß ein Stamm (Dissoziation) von Pseudomonas aeruginosa in einen Permentor inokuliert und bei 37⁰C kultiviert wurde. Eine Menge eines autolysierenden Mittels, wie Toluol oder Chloroform wurde zu der Bakterienkultur einige Stunden nach Erreichen des stationären Zustandes gefügt, so daß eine autolyse auftreten konnte. Eine Komponente (OEP), die hauptsächlich aus Protein, einer geringen Menge Idpoid und Zucker bestand, wurde aus dem Kulturfiltrat isoliert und durch physikochemische Methoden bis zur Homogenität gereini^. Anschliessend wurde das so erhaltene OEP entweder mit einem proteolytischen Enzym oder einem Reduktionsmittel behandelt oder nach der Behandlung mit dem Reduktionsmittel weiter mit den von einem !Eier, einer Pflanze oder einem Mikroorganismus erhaltenen proteolytischen Enzymen digeriert, wobei man eine bakterielle Komponente von Pseudomonas aeruginosa erhielt, die eine äußerst starke

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Antitumorwirkung und Interferon-induzierende Wirkung aufwies. Die Komponente besitzt eine spezielle Schutzwirkung gegen die Infektion durch Pseudomonas aeruginosa und eine nicht spezifische Schutzwirkung gegen Infektionen von Pseudomonas aeruginosa sowie durch andere Bakterienstämme. Bei der Immunisierung mit der vorstehend erwähnten bakteriellen Komponente von Pseudomonas aeruginosa konnte ein ausgezeichneter vorbeugender Schutz gegen Tiren und Tumorinvasion erzielt werden und diese bakterielle Komponente konnte auch Infektionen durch Stämme von Pseudomonas aeruginosa von bestimmtem Serotyp verhindern.

Beispiel 1

90 mg OEP wurden in einer Pufferlösung vom pH-Wert 8,0 gelöst und es wurde 2-Mercaptoäthanol zugefügt, so daß eine 4 f°-tge Lösung (Vol/Vol) erzielt wurde. Die Lösung reagierte bei Raumtemperatur 18 Stunden und wurde durch Säulenchromatographie an Sephadex G-75, equilibriert mit der Pufferlösung in Anwesenheit von 4 i° 2-Mercaptoäthanol fraktioniert und anschließend in zwei Fraktionen aufgetrennt, wie in Figur 1 gezeigt.

Aus der Fraktion vom Peak I wurden 42 mg Trockengewicht (46 fo) gewonnen und der Rest wurde in der in Peak II isolierten Fraktion gesamnelt.. Eine Untersuchung der Aktivitäten dieser beiden Fraktionen zeigte eine ED₅₀ von Peak I gegen Ascites-Tumor (Sarcom 180) von 0,45/Ug/kg Maus/Tag; diese betrug bei Peak II über 30/Ug. Die IF-Aktivität betrug 18 Einheiten mit der Konzentration von 0,01 /ug/ml, während sie beim Peak II über 1 /Ug/ml lag. Wie das vorstehende Ergebnis zeigt, konnte der größte Teil des aktiven Teils von OEP (Antitumor- und IF-induzierende Eigenschaften) fraktioniert werden, was die Corelation zwischen der Aktivität und der Ausbeute bei Peak I zeigt.

Bei der Untersuchung nach einer modifizierten Methode von Lowry et al unter Anwendung von Rinderserum als Standardprotein zeigte eine aus der Fraktion beim Peak I erhaltene Substanz mit großer Aktivität einen Gehalt von 77 f° Protein und die Untersuchung in

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einem Aminosäureana Iy sat or zeigte in Bezug auf die Mol Verhältnisse, daß ihre Aminosäure zusammengesetzt war aus 6,6 fo lysin, 2,3 5^ Histidin, 4»3 S^ Arginin, 8,4 fo Asparaginsäure, 5,7 $> Threonin, 5,4 io Serin, 11,7 f° Glutaminsäure, 4,6 $ Prolin, 8,3 $ Glycin, 11,6 5$ Alanin, 7,3 $ Valin, 2,1 fo Methionin, 4,8 $ Isoleucin, 8,9 io leucin, 2,8 $ Tyrosin, 3,9 io Phenylalanin, 1,2 io Tryptophan, 1,2 io Cystin.

Bei der Messung unter Anwendung· des Anthronreagenz erwies sich der Zucker als 4»5 i» Glucose und die Messung im Gaschromatogramm zeigte, daß er aus 13,9 io Khamnose, 4,2 io Mannose, 61,8 io Glucose bestand, wobei die restlichen Prozente nicht identifiziert wurden·

Die Aminosäure betrug 4,5 i°, gemessen nach der Elson-Morgan-Methode unter Verwendung von Glucosamin als Standardprobe. 2-Eeto-3-deoxyoctonat (EDO) betrug 1,3 io, bestimmt nach der Methode unter Anwendung von Thiobarbiturat und der Phosphor, bestimmt nach der Methode von Allen, betrug 1,2 ^. Durch chemische Analyse wurde das Iiipoid als 8,8 io bestimmt, die Zusammensetzung der Fettsäure, gemessen durch Gaschromatographie ergab sich als:

C16:0 43,5 #, 016:1 5,8 io, C18:0 4,8 #, 018:1 22,2 %

Eine Elektrofokusierungsmethode zeigte einen isoelektrischen Punkt dieser Substanz beim pH-Wert 4,35 und die maximale Absorption im Ultraviolettgebiet lag bei 278 mn.

Die biologischen Eigenschaften des OEP wurden vor und nach der Behandlung mit sauren und alkalischen lösungen anhand der Antitumor-Wirksamkeit und der Interferon-induzierenden Wirksamkeit bestimmt. Beim Auflösen in 0,05 n-HaOH-lösung und 20-stündigem Halten bei 2O⁰G wurden die beiden biologischen Eigenschaften der Probe völlig beibehalten. Wurde anstelle der 0,05 n-Na0H- 0,5 n-HaOH verwendet, so blieben die Wirksamkeiten der Probe während

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20 Stunden bei O⁰G unverändert, verringerten sich jedoch nach 20 Stunden bei 20⁰C. Die biologischen Aktivitäten des OEP wurden beträchtlich herabgesetzt, wenn es 20 Stunden bei O⁰C in einer 1 n-HaOH-lösung gehalten wurde.

Wurde das OEP in einer 1 $-igen Essigsäurelösung in einem verschlossenen Rohr 4 Stunden gekocht, so fielen die Aktivitäten um bzw. auf 1/100 ab.

Beispiel 2

20 mg der Substanz beim Peak I des Beispiels 1, die eine starke Aktivität aufwies, wurden in einer Pufferlösung vom pH-Wert 8,0 gelöst. Zu dieser Lösung wurden 1 mg (5 i° Gew./Gew.) alkalische Protease, erhalten aus B. subtilis (Hagase Sangyo K.K., Japan), gefügt und 18 Stunden bei 37⁰C gehalten. Anschließend wurde die Mischung einer Säulenchromatographie an Sephadex 75 unterzogen und in drei Fraktionen aufgetrennt (das Elutionsschema einer Säulenchromatographie ist in Figur 2 aufgezeigt). Die Untersuchung der Aktivitäten dieser drei Fraktionen zeigten eine ED^₀ von Peak I von 0,2 /Ug/kg Maus/Tag gegen Sarcom 180A und von Peak II und Peak III über 10/Ug.

Andererseits zeigte sich eine Interferon-induzierende Aktivität in einer Konzentration von 0,01 /Ug/ml von 184 Einheiten bei Peak I und 10/Ug/ml von 45 Einheiten bei Peak II und geringere Konzentrationen zeigten keine Aktivität, Mit anderen Worten wurde bei Peak I eine Substanz fraktioniert, die eine äußerst starke Wirksamkeit aufwies. Bei der Messung nach der in Beispiel 1 angewendeten Methode zeigten sich folgende chemische Eigenschaften dieser bei Peak I fraktionierten Substanz: 17 $ Protein¹? 14,5 $ Zukker, 12,5 $ Aminozucker, 3,8 fo KDO, 2,7 fo P und 31 i> Idpoid. Die Zusammensetzungen von Zucker und Fettsäure waren die gleichen wie in Beispiel 1.

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Beispiel 3 . - .

20 mg der Substanz von Peak I des Beispiels 1 mit einer starken Wirksamkeit wurden in einer Pufferlösung vom pH-Wert 7,8 gelöst. Zu dieser Lösung wurden 1 mg Trypsin (Sigma Co.) gefügt und es wurde 18 Stunden bei 37⁰C gehalten, worauf durch. Säulenchromatographie an Sephadex G-75 fraktioniert wurde und man drei Fraktionen, in gleicher Weise wie in Beispiel 2 erhielt. 8 mg der Substanz (Trockengewicht) wurden aus der ersten eluierten Fraktion gewonnen. Bei der Untersuchung der Aktivität zeigte die Fraktion vom Peak I 0,25/Ug/kg Maus/Tag gegen Sarcom 180A und die Interferon-induzierende Aktivität erwies sich bei einer Konzentration von 0,01 /Ug/ml als 214 Einheiten. Eine bakterielle Komponente mit einer starken Aktivität wurde so aus dem Peak I isoliert. Es wurde auch gefunden, daß die Substanz, die bei diesem Peak fraktioniert wurde, 47 fo Protein enthielt.

Beispiel 4

OEP wurde oral an junge Kaninchen mit einem Gewicht von 600-900 g insgesamt siebenmal in einer einzigen Dosis von 1 mg/kg 6, 4» 2 und 0 Tage sowie 1, 3 und 5 Tage vor bzw. nach der Infektion mit Viren verabreicht. Am Tage der Verabreichung von OEP wurden 0,1 ml verschiedener Verdünnungen von Viruslösungen intrakutan an die Kaninchen verabreicht. Die Bestimmung erfolgte 7 Tage nach der Infektion mit dem Virus und die Vaccineläsion an der Kaninchenhaut wurde erfolgreich durch die in Tabelle G aufgeführte Komponente inhibiert.

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Tabelle G

Die Wirkung von oral verabreichtem OEP bei der Inhibierung einer durch Virusvaccine hervorgerufenen Krise

Anzahl der Kaninchen

Größe der Läsion

Tiru sve rdünnung

10

,-5

,-7

10'

-8

OEP-Gruppe

11x11** 6x6

12x12

Kontroll-Gruppe

19x22 18x18 10x11

18x20 17x20 20x20

19x21 12x12

18x18 12x12

(-) Yirusinfektion inhibiert

die Zahlen zeigen die Größe, nämlich die Länge und die Breite einer Läsion in mm an.

Beispiel 5

Es wurden jeweils Gruppen von 5 Mäusen verwendet. Die in Beispiel 2 gezeigte, bei Peak I isolierte Fraktion wurde durch zweimal wöchentliche intraperitoneale Verabreichung während 3 Wochen immunisiert. Eine Woche nach dem letzten Injektionstag wurden lebende Bazillen von jeweils 7 Iinmunotyp-Stämmen von Fisher et al in einer sterilen Lösung suspendiert und die Suspension wurde zur intraperitonealen Infizierung von Mäusen verwendet. Nach der Infizierung wurden die Mäuse eine Woche beobachtet und es wurde

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ein beträchtlicher Unterschied der Sterblichkeit bei den immunisierten und nicht immunisierten Gruppen durch diagrammatische Analyse (probit) festgestellt. Wie aus der Tabelle 6 ersichtlich ist, wurden die Mäuse gegen die Infektion von 5 von 7 Fisher's Immunotyp-Stämmen durch die in Peak I des Beispiels 2 isolierte Fraktion immunisiert·

Aminosäurezusammensetzung: (Molverhältnis) vor und nach der Behandlung mit proteolytischem Enzym:

vor der Behandlung nach der Behandlung mit proteolytischem mit proteolytischem Enzym . Enzym

Lys	3.48	4.10
His	2.28	2.52
NH₃	9.35	6.43
Arg	5..32	5.83
. CysO₃H	0.10	N D
Asp	6.93	6.19
Thr	4.56	3.44
Ser	4.22	3.06
GIu	10.68	5.59
Pro	4.42	2.71
GIy	8.59	6.82
AIa	10.74	19.96
VaI	7.36	4.87
Met	1.14	0.39
Heu	5.16	4.17

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8.33	5.75
2.92	6,83
4.29	11.32
0.12	N D

- 20 -

vor der Behandlung nach der Behandlung mit proteolytischem mit proteolytischem Enzym Enzym

Leu Tyr Phe Try

U" D: nicht bestimmt

Chemische Analyse von OEP vor und nach dem Digerieren mit Protease (alkalische Protease, opt pH 8, B. subtilis) zeigte folgende Ergebnisse:

vor dem Digerieren nach dem Digerieren

17
31

12,5 3,8

2/7

Beispiele für erfindungsgemäß zur Herstellung von OEP und anderweitig eingesetzte Stämme von Pseudomonas aeruginosa sind insbesondere: Der mit der Hinterlegungsnummer ATCC 21726 beim Bureau of American Type Culture Collection hinterlegte Stamm, sowie die mit den Hinterlegungsnummern JFCC HD P1 Lis P10, P12, P13 und P15 bis P23 bei der Japanese Federation of Culture Collections of Microorganisms, Tokyo, hinterlegten Stämme (vgl. JFCC Catalogue of Cultures, der Japanese Federation of Culture Collections of Microorganisms, Additional Edition 1968, insbesondere Seiten 115 und 116).

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Gesamtzucker	4,5
Folin-ciocalteu-Protein	77
lipoid	8,8
Hexosamin	4,5
KDO	1,3
P	1,2

Claims

Patentansprüche

1> Verfahren zur Herstellung einer bakteriellen Komponente von Pseudomonas aeruginosa, gekennzeichnet durch:

Kultivieren eines Stammes (Dissoziation oder Variante) von Pseudomonas aeruginosa bei einer Temperatur von 37⁰C in flüssigem Medium, zur Erzielung eines Autolysats,

Isolieren der bakteriellen Komponente aus diesem Autolysat durch physikochemische Arbeitsgänge, wie Elektrophorese, Ionenaustauscherchromatographie oder Gelfiltration,

•wobei diese bakterielle Komponente eine ursprüngliche Endotoxinproteinkomponente ist, die hauptsächlich aus Protein, Zucker und Lipoid besteht, und

diese ursprüngliche Endotoxinproteinkomponente eine Antitumoraktivität, Interferon-induzierende Aktivität und nicht spezifische und spezifische Schutzwirkungen gegen die Infektion durch Pseudomonas aeruginosa oder andere Bakterienstämme besitzt.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die bakterielle Komponente eine ursprüngliche Endotoxinproteinkomponente mit 77 f° Protein, 4,5 $ Zucker und 8,8 # Lipoid ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ursprüngliche Endotoxinproteinkomponente mit einem Reduktionsmittel behandelt wird, wodurch sie eine äußerst starke biologische Aktivität erhält.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß die behandelte ursprüngliche Endotoxinproteinkomponente 17 $> Protein, 31 i° Lipoid, 14 & Zucker und 12 fo Aminozucker enthält und spezifische Antitumor-Eigenschaften und Interferon-induzierende Eigenschaften aufweist, die bis auf etwa das 10-fache erhöht sind.

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5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ursprüngliche Endotoxinproteinkomponente mit einem proteolytischen Enzym behandelt wird, wodurch sie eine äußerst starke biologische Aktivität aufweist.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß diese behandelte ursprüngliche Endotoxinproteinkomponente 17 f° Protein, 31 $> Idpoid, 14 fo Zucker und 12 fo Aminozucker aufweist und spezifische Antitumor-Eigenschaften und Interferon-induzierende Eigenschaften aufweist, die bis auf etwa das 10-fache erhöht sind.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend mindestens eine der Substanzen, hergestellt gemäß einem der vorhergehenden Patentansprüche.

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