CN109401992B - 一株高产内毒素蛋白的铜绿假单胞菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株高产内毒素蛋白的铜绿假单胞菌，属于微生物菌株及其应用领域。所述的铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)，PA‑393，已于2015年08月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.11267。本发明筛选得到的铜绿假单胞菌PA‑393，在内毒素蛋白生产培养基中发酵22h，能产生大量的内毒素蛋白，蛋白含量约占内毒素总量的52.3％，远远高于其它标准菌株和临床筛选菌株(P＜0.05)。解决了目前用于制备铜绿假单胞菌内毒素蛋白的菌株，内毒素蛋白含量较低，以及蛋白中杂质较多而引起的内毒素蛋白免疫效果降低、机体不良反应的问题。本发明的铜绿假单胞菌PA‑393可以作为内毒素蛋白制备的生产菌株，应用于防御铜绿假单胞菌感染的免疫领域。

Description

一株高产内毒素蛋白的铜绿假单胞菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物菌株及其应用领域，具体涉及一株高产内毒素蛋白的铜绿假单胞菌及其应用。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa，PA)又称绿脓杆菌，属假单胞菌属，广泛分布于自然界及正常人的皮肤、呼吸道和肠道，是临床上常见的条件致病菌，当机体免疫功能受损或缺损时，可引起严重的甚至致死性的感染。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者以及术后或某些治疗后的患者易感染此菌，可引起术后伤口感染、褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。铜绿假单胞菌引起的感染病灶可导致血行传播而发生菌血症和败血症，烧伤后感染了绿脓杆菌可造成死亡。铜绿假单胞菌已成为医院内感染的重要病原菌之一，亦是战伤感染的常见致病菌。铜绿假单胞菌还可引起禽畜败血性死亡等，对人体健康和养殖业造成了较大的危害和经济损失。
内毒素蛋白(Endotoxin Protein，EP)是铜绿假单胞菌的主要免疫源性物质，在该菌自溶时释放到培养液里，因此包含于铜绿假单胞菌培养液上清里。内毒素蛋白可刺激机体产生体液性抗体、具有激发机体网状内皮系统细胞的活力和增强巨噬细胞吞噬功能的作用；同时，内毒素蛋白还具有毒性低和发热性弱的特点,对防治铜绿假单胞菌的感染是非常有效的。然而目前已有的用于制备铜绿假单胞菌内毒素蛋白的菌株，其产内毒素蛋白的含量较低，杂质较多，而过多的杂质又会降低内毒素蛋白的免疫效果，还会引起机体的不良反应。因此，筛选到具有高产内毒素蛋白特性的铜绿假单胞菌是十分有意义的。
发明内容
本发明的目的是提供一株可用于制备内毒素蛋白的铜绿假单胞菌(PseudomonasAeruginosa)PA-393菌株，所述铜绿假单胞菌PA-393菌株筛选自哈尔滨医科大学附属第二医院。
本发明提供的铜绿假单胞菌PA-393菌株已于2015年08月24日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC NO.11267。
本发明所述的铜绿假单胞菌PA-393菌株具有下述性质：
1.菌落形态：血液琼脂平板培养基上37℃培养18～24h，肉眼观察，菌落为光滑微隆起、边缘整齐、灰色、表面湿润、不透明、直径约1.5～2.5mm；镜检为革兰氏阴性短杆状。
2.培养特性：血液琼脂平板培养基上37℃培养18～24h，有溶血圈出现；内毒素蛋白生产培养基中37℃培养18～24h，产绿色色素，培养基均匀混浊，呈黄绿色。
3.生理生化特征：氧化酶实验阳性，MR试验和VP试验阴性，甘露醇试验阴性，能分解葡萄糖产酸不产气，能液化明胶和利用枸橼酸盐，不产硫化氢。而且，所述铜绿假单胞菌PA-393菌株在内毒素蛋白生产培养基中37℃发酵22h，能产生大量的内毒素蛋白，蛋白含量约占内毒素总量的52.3％。
本发明的有益效果
1.本发明提供了一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)PA-393菌株，该菌株可高产内毒素蛋白，其中蛋白质含量约为52.3％，远远高于其它标准菌株和临床筛选菌株(P＜0.05)。
2.本发明提供的利用铜绿假单胞菌PA-393菌株生产的内毒素蛋白，可应用于防治铜绿假单胞菌感染的免疫领域。
附图说明
图1为PA-393菌株的菌落形态图(血液琼脂平板培养基)。
图2为PA-393菌株的革兰氏染色镜检图。
图3为PA-393菌株在内毒素蛋白生产培养基中产绿色色素图。左1瓶为未经接种的内毒素蛋白生产培养基，中间及右1瓶为内毒素蛋白生产培养基接种PA-393菌株后经37℃发酵18～24h产绿色色素。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明进一步说明，下述实施方式是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施方式来限定本发明的保护范围。
下述实施方式中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明涉及的培养基组成如下：
血液琼脂平板培养基：
每1000mL培养基含：酪蛋白胰酶消化物10.0g，心胰酶消化物3.0g，玉米淀粉1.0g，琼脂14.0g，肉胃酶消化物5.0g，酵母浸出粉5.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL，无菌脱纤维羊血60mL，校正PH值至7.2～7.4。
营养琼脂斜面培养基：
每1000mL培养基含：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉3.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，最终pH7.3±0.2。
普通肉汤培养基：
每1000mL培养基含：蛋白胨10.0g，牛肉膏粉3.0g，氯化钠5.0g，最终pH7.4±0.2。
内毒素蛋白生产培养基：谷氨酸钠20.0g，葡萄糖7.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，Ca(NO3)2 0.01g，FeSO4·7H2O0.00005g，KH2PO4 0.252g，Na2HPO4·12H2O 5.63g，溶于1000mL蒸馏水中，校正pH至7.2～7.4，115℃25min高压蒸汽灭菌。
实施方式(一)：铜绿假单胞菌PA-393菌株的分离与鉴定
1.铜绿假单胞菌PA-393菌株的分离：
⑴菌株分离样品为从哈尔滨医科大学附属第二医院采集的住院患者的痰液。
⑵痰液样品加适量无菌双蒸水充分混匀后，用无菌加样枪吸取30uL，均匀涂布接种于血液琼脂平板培养基中，37℃培养24h。用接种环挑取平板上溶血圈大的典型单菌落，在血液琼脂平板培养基上进行分区划线接种，37℃培养22h。血液琼脂平板培养基纯化2代后，获得铜绿假单胞菌菌株，菌株命名为PA-393，于营养琼脂斜面培养基保藏并进行鉴定。
2.铜绿假单胞菌PA-393菌株的鉴定：
⑴菌落形态特征：
将PA-393菌株在血液琼脂平板培养基上37℃培养18～24h，其菌体形态如图1所示，菌落为光滑微隆起、边缘整齐、灰色、表面湿润、不透明、直径约1.5～2.5mm，溶血。
PA-393菌株镜检结果如图2所示，镜检为革兰氏阴性短杆状。
将PA-393菌株接种到内毒素蛋白生产培养基中37℃发酵18～24h，产绿色色素，其培养基形态如图3所示，其中左1瓶为未经接种的内毒素蛋白生产培养基，中间及右1瓶为内毒素蛋白生产培养基接种PA-393菌株后经37℃发酵18～24h产绿色色素，培养基均匀混浊，呈黄绿色。
⑵生化鉴定：PA-393菌株氧化酶实验阳性，MR试验和VP试验阴性，甘露醇试验阴性，能分解葡萄糖，产酸不产气，能液化明胶和利用枸橼酸盐，不产硫化氢，因此鉴定证实该PA-393菌株为铜绿假单胞菌。
表1PA-393菌株的主要生化特征
Figure BDA0001382503210000031
注：“+”：阳性；“-”：阴性。
实施方式(二)：铜绿假单胞菌发酵制备内毒素蛋白试验
1.生产菌株准备：
⑴选取10株铜绿假单胞菌用于内毒素蛋白的制备试验，其中PA-393株筛选自哈尔滨医科大学附属第二医院，ATCC27853株购自中国药品生物制品检定所，ATCC9027株购自通派上海生物科技有限公司、ATCC15442株和CMCC10104株购自广东环凯微生物科技有限公司，ATCC19429株购自上海柯维化学技术有限公司，PA-526株和PA-1537株筛选自哈尔滨医科大学附属第二医院，PA-025株和PA-182株筛选自黑龙江省医院。
⑵将上述各菌株冻干管无菌开启，接入普通肉汤培养基中，37℃静置培养22h。用无菌加样枪吸取30uL，均匀涂布接种于血液琼脂平板培养基中，37℃培养24h。用接种环挑取平板上溶血圈大的典型单菌落，在血液琼脂平板上进行分区划线接种，37℃培养22h。选取平板上溶血圈大、典型的单菌落接种于营养琼脂斜面培养基上，37℃培养24h。镜检，确定为铜绿假单胞菌。
2.内毒素蛋白制备：
⑴取上述镜检为铜绿假单胞菌的各菌株，接种于普通琼脂斜面培养基上，37℃培养18h，然后用内毒素蛋白生产培养基把菌体洗下，接入装有800～1000mL内毒素蛋白生产培养基的三角瓶中，接种量为3.0×108CFU/mL(细菌浊度计TA-2XJ，北京天安联合科技有限公司)，旋转摇床(175转/min)37℃振荡培养22h。
⑵培养物校正pH至8.5，37℃甲苯重层自溶48h。暗视野镜检自溶完全后，将自溶液校正pH至7.2，G5砂芯漏斗抽滤，得到棕色透明液体，用50％ZnCl2沉淀蛋白(3.2mL 50％ZnCl2/100mL抽滤液)，4℃，4000rpm离心20min，弃掉上清。沉淀用适量20％Na2HPO4·7H2O溶液溶解，37℃静置2h，4℃冰箱过夜保存。
⑶4℃，4000rpm离心20min，收集上清液，校正pH至7.0～7.2，装入透析袋(截留分子量：8000～14000)流水透析48h后，电扇吹风浓缩至体积50～80mL。
⑷浓缩液校正pH至7.0～7.2，冷丙酮沉淀(浓缩液体积：冷丙酮体积＝1：2)，4℃，4000rpm离心20min，弃掉上清，沉淀加少量ddH2O溶解，电扇吹风浓缩，真空冷冻干燥，获得内毒素蛋白。
本实施方式的铜绿假单胞菌发酵制备的内毒素蛋白，其蛋白含量测定具体方法如下：
蛋白含量测定方法选取考马斯亮蓝法(Bradford法)，具体操作步骤如下：
1.试剂配制：
⑴标准蛋白溶液：精确称取酪蛋白25mg，加ddH2O溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用ddH2O稀释至100mL，即为100ug/mL的标准蛋白溶液。
⑵染料溶液：称取0.1g考马斯亮蓝G-250溶于50mL 95％的酒精，再加入85％的浓磷酸100mL，用ddH2O稀释至1000mL，混匀备用。
2.操作步骤：
⑴按下表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min后在595nm波长处以0号管调零，测定各管吸光度值(A)。以吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。
表2标准曲线绘制
Figure BDA0001382503210000041
⑵样品测定：分别取1mL各样品溶液(约含25～250ug蛋白质)，加入染料溶液5mL混匀，5min后测定其595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。
表3蛋白含量测定结果
Figure BDA0001382503210000051
结果表明，铜绿假单胞菌PA-393菌株制备的内毒素蛋白，含量约为52.3％，远远高于其它标准菌株和临床筛选菌株(P＜0.05)，可见PA-393菌株可用于制备内毒素蛋白，应用于防治铜绿假单胞菌感染的免疫领域。

Claims (5)

1.一株高产内毒素蛋白的铜绿假单胞菌，其特征在于：菌株的名称PA-393，分类命名为：铜绿假单胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)，保藏编号为：CGMCC NO.11267，保藏日期：2015年08月24日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.如权利要求1所述的高产内毒素蛋白的铜绿假单胞菌在制备内毒素蛋白中的应用。
3.根据权利要求2所述的高产内毒素蛋白的铜绿假单胞菌应用，其特征在于，制备内毒素蛋白的具体方法是：将铜绿假单胞菌PA-393活化，然后接种到培养基中，发酵22h，即完成。
4.根据权利要求3所述的高产内毒素蛋白的铜绿假单胞菌应用，其特征在于，所述发酵是在37℃温度下振荡培养。
5.根据权利要求3所述的高产内毒素蛋白的铜绿假单胞菌应用，其特征在于，所述培养基是由谷氨酸钠20.0g，葡萄糖7.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，Ca(NO3)2 0.01g，FeSO4·7H2O0.00005g，KH2PO4 0.252g，Na2HPO4·12H2O 5.63g和1000mL蒸馏水配制的。
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