CN111100810A

CN111100810A - 一株植物乳杆菌dnb1及其胞外多糖和应用

Info

Publication number: CN111100810A
Application number: CN201911330269.5A
Authority: CN
Inventors: 钟青萍; 上官文丹; 丁楠; 卢承蓉; 方祥; 廖振林; 王洁
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: Zhongkelijun Co ltd
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2020-05-05
Anticipated expiration: 2039-12-20
Also published as: CN111100810B

Abstract

本发明公开了一株植物乳杆菌DNB1及其胞外多糖和应用。该植物乳杆菌DNB1是从柚子皮自然发酵液中分离筛选获得，并于2019年7月15日保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60728。该菌株对酸和胆盐均有较好的耐受性能，对胃肠液的环境具有较好的适应性，其发酵液具有显著的抑菌作用；该菌株产生的胞外多糖具有显著的体外抗氧化能力，显著提高血液中的谷胱甘肽氧化物酶活性和总抗氧化能力，能够调节肠道菌群中乳酸杆菌属的相对丰度，降低葡萄球菌属的相对丰度；因此，该植物乳杆菌DNB1胞外多糖在调节肠道菌群或制备肠道菌群调节剂、提高抗氧化能力或制备抗氧化剂方面具有很好的推广应用前景。

Description

一株植物乳杆菌DNB1及其胞外多糖和应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域。更具体地，涉及一株植物乳杆菌DNB1及其胞外多糖和应用。

背景技术

乳酸菌胞外多糖(Exopoly Saccharides，EPS)是指乳酸菌在生长过程中分泌到细胞壁外的黏液多糖或荚膜多糖的总称，具有分子量大、黏度大、结构复杂等特点，自然界中产胞外多糖的乳酸菌主要包括干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、肠膜明串珠菌和植物乳杆菌等。研究表明乳酸菌胞外多糖是一种安全的天然产物，具有改善发酵乳制品的流变性、组织状态、质构特征以及感官风味等工艺学功能，使其变得更加细腻均匀、平滑稠密，还能提高焙烤类食品的保水性，改善面包体积和柔软度。另外，乳酸菌胞外多糖还具有多种生理功能，包括促进菌体黏附、降血压、抗氧化、抗肿瘤、抗溃疡、调节肠道菌群结构和增强免疫力等。因其具有独特的物化性质及生物活性，近年来，针对高产胞外多糖的乳酸菌的资源开发与应用日益成为当前的研究热点。

肠道菌群是指在肠道中定植的多达100万亿的微生物菌群，肠道菌群作为一种虚拟的“器官”，其在维持宿主健康方面发挥着重要的作用，如影响营养成分的加工利用、肠道免疫功能和粘膜屏障的完整性。近年来的研究表明，肠道菌群的变化不仅影响着人的生长发育、营养与健康，可还与糖尿病、炎症性肠病等多种代谢性疾病有着密不可分的关系。生物氧化是生命有机体的重要生理过程，但不平衡的生物氧化作用会产生自由基的累积，自由基是威胁人体健康的重要因素之一，能够造成机体内氧化损伤逐渐增多，从而导致机体机体代谢异常，产生疾病。

现有大多数的植物乳杆菌需要与其他的益生菌复合才能起到调节肠道菌群的功能，或该植物乳杆菌仅具有抗氧化功能，可知现有筛选得到的乳酸菌无法同时具有调节肠道菌群和抗氧化的功能，使得其应用受到限制。现有技术(申请号为201810113533.9)公开的植物乳杆菌能够产胞外多糖，且产生的胞外多糖具有很好的抗氧化能力和胃肠道逆环境耐受特性，为胞外多糖在提高物抗氧化活性中的应用提供实践依据。因此，更多的分离筛选能够高产胞外多糖，且产生的胞外多糖具有显著的肠道菌群调节能力和抗氧化活性的乳酸菌具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一株植物乳杆菌DNB1及其胞外多糖和应用。

本发明的目的是提供一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DNB1。

本发明的另一目的是提供所述植物乳杆菌DNB1、其菌悬液、其发酵液或其代谢产物在制备胞外多糖中的应用。

本发明的又一目的是提供一种植物乳杆菌DNB1胞外多糖。

本发明的又一目的是提供所述植物乳杆菌DNB1胞外多糖在调节肠道菌群或制备肠道菌群调节剂中的应用。

本发明的又一目的是提供所述植物乳杆菌DNB1胞外多糖在提高抗氧化能力或制备抗氧化剂中的应用。

本发明的再一目的是提供一种肠道菌群调节剂。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明从柚子皮自然发酵液中分离筛选得到了一株植物乳杆菌DNB1，并于2019年7月15日保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60728，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

该植物乳杆菌DNB1对酸和胆盐均有较好的耐受性能，且对胃肠液的环境具有较好的适应性，用pH值为3.0的人工模拟胃液对植物乳杆菌DNB1进行处理2h后，该菌株存活率达90％以上，然后经人工模拟肠液处理8h后，该菌株的活菌数仍高于10⁴CFU/mL；且该菌株的发酵液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌均有显著的抑菌能力。

所述植物乳杆菌DNB1的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

经实验证明所述植物乳杆菌DNB1能够高产胞外多糖，因此，所述植物乳杆菌DNB1、其菌悬液、其发酵液或其代谢产物在制备胞外多糖中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种植物乳杆菌DNB1胞外多糖，由所述植物乳杆菌DNB1发酵而得到。

优选地，所述植物乳杆菌DNB1胞外多糖，其制备方法为：将所述植物乳杆菌DNB1接种于MRS液体培养基中，恒温发酵培养，活化，离心得发酵液；将发酵液与三氯乙酸溶液混合，静置，离心得上清液；将上清液与乙醇混合，静置，再离心得沉淀；在沉淀中加入去离子水溶解后，透析，真空冷冻干燥，即得所述植物乳杆菌DNB1胞外多糖。

优选地，所述植物乳杆菌DNB1的接种量为2％～4％。

更优选地，所述植物乳杆菌DNB1的接种量为3％。

优选地，所述恒温发酵培养的温度为35℃～39℃。

更优选地，所述恒温发酵培养的温度为37℃。

具体优选地，所述植物乳杆菌DNB1胞外多糖，其制备方法包括以下步骤：

S1.将植物乳杆菌DNB1按2％～4％的接种量接种于MRS液体培养基中，35℃～39℃恒温培养箱中培养24h，连续活化3次后，以4℃、10000r/min离心10min除去发酵液中的菌体和杂质，得发酵液；

S2.在发酵液中加入80％三氯乙酸溶液，使溶液中三氯乙酸的终浓度为4％，在4℃冰箱中放置6～8h后，以4℃、10000r/min离心15min除出蛋白质沉淀，得上清液；

S3.在上清液中加入3倍体积的95％乙醇，在4℃冰箱中放置12～15h后，再以4℃、10000r/min离心15min得沉淀；

S4.取沉淀加去离子水溶解后，移至透析袋中，用流动的纯净水透析2d，每隔8h更换一次水，收集透析液后进行真空冷冻干燥，即得所述植物乳杆菌DNB1胞外多糖。

所述植物乳杆菌DNB1胞外多糖能够显著提高对羟基自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的清除率，具有显著的体外抗氧化能力，同时也能够显著提高血液中的谷胱甘肽氧化物酶活性和总抗氧化能力；另外，该菌株的胞外多糖对肠道菌群有调节作用，能够提高乳酸杆菌属的相对丰度，同时降低葡萄球菌属的相对丰度；因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：

所述植物乳杆菌DNB1胞外多糖在调节肠道菌群或制备肠道菌群调节剂中的应用。

优选地，所述调节肠道菌群为提高肠道菌群中乳酸杆菌属的相对丰度，降低葡萄球菌属的相对丰度。

所述植物乳杆菌DNB1胞外多糖在提高抗氧化能力或制备抗氧化剂中的应用。

优选地，所述提高抗氧化能力为提高体外抗氧化能力或血液抗氧化活性。

更优选地，所述提高体外抗氧化能力为提高清除DPPH自由基、羟基自由基或ABTS自由基的能力。

更优选地，所述提高血液抗氧化活性为提高血液中谷胱甘肽氧化物酶活性或总抗氧化能力。

基于以上应用，本发明还提供了一种肠道菌群调节剂，包括所述植物乳杆菌DNB1胞外多糖。

另外，本发明还提供了一种抗氧化剂，包括所述植物乳杆菌DNB1胞外多糖。

本发明具有以下有益效果：

本发明筛选分离得到了一株植物乳杆菌DNB1，该菌株是一种潜在的功能性乳酸菌，安全性高，对酸和胆盐均有较好的耐受性能，在胃肠道液中具有较高的存活率，对胃肠液的环境具有较好的适应性；且该菌株的发酵液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌均有显著的抑菌能力，发挥益生作用；

所述植物乳杆菌DNB1具有高产胞外多糖的能力，由该菌株发酵生产的胞外多糖能够显著提高对羟基自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的清除率，具有显著的体外抗氧化能力，同时也能够显著提高血液中的谷胱甘肽氧化物酶活性和总抗氧化能力；另外，该菌株的胞外多糖对肠道菌群有调节作用，能够提高乳酸杆菌属的相对丰度，同时降低葡萄球菌属的相对丰度，在调节肠道菌群功能和抗氧化方面均具有良好的特性；因此，该植物乳杆菌DNB1胞外多糖在调节肠道菌群或制备肠道菌群调节剂、提高抗氧化能力或制备抗氧化剂方面均具有良好的应用前景。

附图说明

图1是目标菌株的革兰氏染色结果图。

图2是目标菌株在MRS固体培养基中的菌落形态图。

图3是植物乳杆菌DNB1在模拟胃肠道环境中的耐受性测试结果图。

图4是植物乳杆菌DNB1的生长曲线图；其中，“EPS yield”代表植物乳杆菌DNB1胞外多糖的产量。

图5是植物乳杆菌DNB1胞外多糖的体外抗氧化能力测定结果图；其中，(A)图是植物乳杆菌DNB1胞外多糖对羟基自由基的清除率结果；(B)图是植物乳杆菌DNB1胞外多糖对DPPH自由基的清除率结果；(C)图是植物乳杆菌DNB1胞外多糖对ABTS自由基的清除率结果。

图6是样本的稀释曲线和等级聚类曲线图；其中，(A)图是样本的稀释曲线；(B)图是样本的等级聚类曲线。

图7是样本的物种累积箱形图。

图8是不同样本的OTU分布韦恩图。

图9是各样本在科水平上的菌群分析结果图；其中，“Others”代表其他种类、“Lachnospiraceae”代表毛螺菌科、“Ruminococcaceae”代表瘤胃菌科、“Marinifilaceae”代表玛丽莲科、“Moraxellaceae”代表莫拉氏菌科、“Staphylococcaceae”代表葡萄球菌科、“Helicobacteraceae”代表螺旋杆菌科、“Prevotellaceae”代表普雷沃氏菌科、“Lactobacillaceae”代表乳酸杆菌科、“Bacteroidaceae”代表拟杆菌科、“Muribaculaceae”代表木杆菌科。

图10是各样本在属水平上的菌群分析结果图；其中，“Others”代表其他种类、“unidentified Ruminococcaceae”代表未定义的瘤胃菌科、“Staphylococcus”代表葡萄球菌属、“Alistipes”代表另枝菌属、“Alloprevotella”代表拟普雷沃氏菌属、“CandidatusSaccharimonas”代表白念珠菌属、“Odoribacter”代表臭杆菌属、“Psychrobacter”代表嗜冷杆菌属、“Helicobacter”代表螺杆菌属、“Lactobacillus”代表乳酸杆菌属、“Bacteroidetes”代表拟杆菌。

图11是NMDS分析结果图。

图12是UPGMA聚类树；其中，“Firmicutes”代表厚壁菌门、“Bacteroidetes”代表拟杆菌门、“Actinobacteria”代表放线菌门、“Proteobacteria”代表变形菌门、“Tenericutes”代表软壁菌门、“unidentified Bacteria”代表未定义的细菌、“Acidobacteria”代表酸杆菌门、“Gemmatimonadetes”代表芽单胞菌门、“Deferribacteres”代表脱铁杆菌门、“Cyanobacteria”代表蓝细菌、“Others”代表其它种类。

图13是植物乳杆菌DNB1胞外多糖对小鼠血液GSH-Px活性的影响结果图。

图14是植物乳杆菌DNB1胞外多糖对小鼠血液T-AOC活性的影响结果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1植物乳杆菌DNB1的分离与鉴定

1、菌株分离与筛选

将柚子皮自然发酵液在无菌条件下取10mL至90mL无菌生理盐水中，吹打均匀后，按10倍梯度稀释到适宜的浓度后，取100μL稀释后的菌液，用涂布棒均匀地涂布于MRS固体培养基上，在37℃的恒温培养箱中倒置培养48h。挑取具有乳酸菌典型特征(圆形、乳白色、边缘整齐、凸起)的单菌落，在MRS固体培养基上重复划线分离，得到单菌落；

用无菌竹签挑取单菌落，轻轻地往外拉，测量菌落拉丝的长度，选取拉丝长度最大的菌株为目标菌株。

2、目标菌株的鉴定

(1)形态学鉴定

1)实验方法

将目标菌株进行革兰氏染色，并在显微镜下观察菌株的形态。

2)实验结果

目标菌株的革兰氏染色结果如图1所示，可以看出，该菌株为革兰氏阳性菌，圆端短杆状。目标菌株在MRS固体培养基中的菌落形态如图2所示，可以看出，该目标菌株在MRS固体培养基上形成乳白色的圆形菌落，不透明，边缘整齐，表面光滑湿润，有凸起，质地粘稠，直径约1.0～2.0mm。

(2)分子鉴定

1)实验方法

采用SDS法提取目标菌株DNA，然后使用通用引物27F/1492R进行PCR扩增，到深圳华大基因公司对目标菌株的16S rDNA的核苷酸序列进行测序。

上游引物27F的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

下游引物1492R的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。

PCR扩增的反应条件为：94℃5min；94℃30s；51℃30s；72℃延伸1min；经35个循环后，72℃延伸5min，终止反应。

2)实验结果

目标菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，经过比对分析发现目标菌株的16S rDNA的核苷酸序列与Genebank中其他植物乳杆菌的相似率达99％；综上所述，目标菌株为乳杆菌属、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌种，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DNB1，并于2019年7月15日保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60728，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2植物乳杆菌DNB1的耐酸耐胆盐性能测定

1、植物乳杆菌DNB1对酸的耐受性测定

乳酸菌的耐酸性能是确保其通过胃液进入肠道存活的必要条件之一，因此乳酸菌对酸的耐受性是一个重要的指标。

(1)实验方法

将植物乳杆菌DNB1接种到MRS液体培养基中，活化3次，在37℃恒温培养箱中培养24h，以3000r/min、4℃离心10min收集菌体，用等体积无菌生理盐水洗涤菌体2次，并在相同条件下离心，倒出上清液，将菌体悬浮于等体积无菌生理盐水中制成待测菌液；

将待测菌液以4％的接种量分别接种到pH值为2.0、3.0、4.0的MRS液体培养基中，37℃培养3h；使用倾注平板法和菌落计数法在0h和3h进行活菌计数，并根据以下公式计算菌株存活率：

菌株存活率(％)＝log cfu N₂/log cfu N₁×100％；

式中：N₁为胃液处理0h后活菌数；N₂为胃液处理3h后活菌数。

(2)实验结果

植物乳杆菌DNB1的耐酸性能测定结果如表1所示，可以看出，植物乳杆菌DNB1在不同pH环境中培养3h，其存活率均随着pH值的降低而降低；当pH为3.0和4.0时，其存活率分别为95.67％和97.43％，随着pH值继续降低至2.0，植物乳杆菌DNB1的存活率仍有较高的存活率(56.63％)；该结果说明：植物乳杆菌DNB1有较强的耐酸性能。

表1植物乳杆菌DNB1的耐酸性能测定结果(

n＝3)

2、植物乳杆菌DNB1对胆盐的耐受性测定

乳酸菌在通过胃液后，要以活菌的状态到达消化道才能发挥其益生菌功能，但前提是必须能够通过耐受十二指肠中高浓度的胆盐。

(1)实验方法

将植物乳杆菌DNB1分别接种至含0.1g/100mL、0.2g/100mL、0.3g/100mL牛胆盐的MRS液体培养基中，于37℃恒温培养箱中培养24h；使用倾注平板法和菌落计数法分别在0h和24h进行活菌计数，并计算存活率：

菌株存活率(％)＝log cfu N₂/log cfu N₁×100％；

式中：N₁为胃液处理0h后活菌数；N₂为胃液处理24h后活菌数。

(2)实验结果

植物乳杆菌DNB1对胆盐的耐受性测定结果如表2所示，可以看出，在胆盐浓度为0.1g/100mL和0.2g/100mL时，植物乳杆菌DNB1的存活率大于78％，随着胆盐浓度增加至0.3g/100mL，植物乳杆菌DNB1的存活率显著降低，但仍达53.77％；该结果说明：植物乳杆菌DNB1有较强的耐胆盐性能。

表2植物乳杆菌DNB1对胆盐的耐受性测定结果(

n＝3)

3、植物乳杆菌DNB1在模拟胃肠道环境中的耐受性测试

在通过胃肠道后，乳酸菌保持着较高的活菌数和活性，是发挥其生物活性的重要因素，除了要耐受胃肠道高浓度的酸和胆盐外，还需要考虑胃肠道中的生物酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶等。

(1)实验方法

取l mL植物乳杆菌DNB1待测菌液接入9mL无菌的人工模拟胃液(125mmol/L NaCl、7mmol/L KCl、45mmol/L NaHCO₃和3g/L胃蛋白酶，用HCl将溶液pH调至3.0，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌)中，混匀后，37℃、150r/min条件下培养2h；使用倾注平板法和菌落计数法分别于0h和2h进行活菌计数，计算存活率；

然后取1mL经人工胃液处理后的菌液，接种到9mL无菌的人工模拟肠液(1g/L胰蛋白酶、3g/L牛胆盐，用NaOH调pH至7.5，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌)中，37℃、100r/min培养8h；使用倾注平板法和菌落计数法分别于0h、2h、4h、6h、8h进行活菌计数。

(2)实验结果

植物乳杆菌DNB1在模拟胃肠道环境中的耐受性测试结果如图3所示，可以看出，用pH值为3.0的人工模拟胃液对植物乳杆菌DNB1进行处理2h后，其存活率达90％以上；然后经人工模拟肠液处理8h后，活菌数仍高于10⁴CFU/mL；该结果说明：植物乳杆菌DNB1对人工模拟胃肠液有较好地耐受性。

以上结果说明：植物乳杆菌DNB1对酸和胆盐均有较好的耐受性能，且对人工胃肠液的环境具有较好的适应性。

实施例3植物乳杆菌DNB1胞外多糖的提取和产量的测定

1、实验方法

(1)植物乳杆菌DNB1胞外多糖的提取

植物乳杆菌DNB1胞外多糖的提取方法，包括以下步骤：

S1.将植物乳杆菌DNB1按3％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养箱中培养24h，连续活化3次后，以4℃、10000r/min离心10min除去发酵液中的菌体和杂质，得发酵液；

S2.在发酵液中加入80％三氯乙酸溶液，使溶液中三氯乙酸的终浓度为4％(m/v)，在4℃冰箱中放置7h后，以4℃、10000r/min离心15min除出蛋白质沉淀，得上清液；

S3.在上清液中加入3倍体积的95％乙醇，在4℃冰箱中放置13h后，再以4℃、10000r/min离心15min得沉淀；

S4.取沉淀加去离子水溶解后，移至透析袋中，用流动的纯净水透析2d，每隔8h更换一次水，收集透析液后进行真空冷冻干燥，即得植物乳杆菌DNB1胞外多糖。

(2)植物乳杆菌DNB1胞外多糖产量的测定

将植物乳杆菌DNB1按3％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养箱中培养24h，每隔2h取出发酵液，测定其胞外多糖含量，采用倾注平板法和菌落计数法测定活菌数，采用pH计测定pH值。

2、实验结果

植物乳杆菌DNB1的生长曲线如图4所示，可以看出，植物乳杆菌DNB1的生长在16h后开始进入稳定期；而pH值在0-16h内发生了显著下降，在24h后pH值降至4.08；同时植物乳杆菌DNB1胞外多糖的产量在0-20h内呈现快速增长的趋势，在20h时植物乳杆菌DNB1胞外多糖的产量达到最大值92.4mg/L；以上结果说明：植物乳杆菌DNB1能够高产胞外多糖。

实施例4植物乳杆菌DNB1发酵液的抑菌能力测定

1、实验方法

将植物乳杆菌DNB1菌液进行离心(4℃，8000g，20min)，发酵，取其发酵上清液，再通过0.22μm无菌滤膜过滤后得到样品液，测定植物乳杆菌DNB1发酵液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌能力。

2、实验结果

植物乳杆菌DNB1发酵液的抑菌能力测定结果如表3所示，可以看出，植物乳杆菌DNB1发酵液对金黄色葡萄球菌的抑菌直径为14.67mm，枯草芽孢杆菌的抑菌直径为15.33mm，大肠杆菌的抑菌直径为14.67mm；该结果说明：植物乳杆菌DNB1对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌均有显著的抑菌能力。

表3植物乳杆菌DNB1发酵液的抑菌能力测定结果(

n＝3)

实施例5植物乳杆菌DNB1胞外多糖的体外抗氧化能力测定

1、实验方法

配制不同浓度的植物乳杆菌DNB1胞外多糖溶液：0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL和0.4mg/mL，配置Vc溶液(浓度为0.25mg/mL)作为阳性对照，分别测定植物乳杆菌DNB1胞外多糖的体外抗氧化能力。

(1)羟基自由基(·OH)的清除

A₀：将EPS溶液换成蒸馏水；

A₁：2mL 9mM硫酸亚铁溶液+2mL 9mM水杨酸乙醇溶液+2mL EPS溶液+2mL 8.8mM过氧化氢溶液；

A₂：将过氧化氢溶液换成蒸馏水；

混匀后置于37℃的恒温水浴锅中反应30min，在510nm处测定吸光值；

羟基自由基清除率计算公式为：清除率(％)＝[1-(A₁-A₂)/A₀)]×100％；其中，A为各组的吸光度值。

(2)DPPH自由基的清除

A_t：2mL EPS溶液+2mL DPPH溶液(0.2mM)；

A_r：2mL EPS溶液+2mL无水乙醇；

A₀：2mL DPPH溶液+2mL无水乙醇；

混匀后，在室温黑暗中(抽屉)，静置30min，在波长517nm测定吸光值；

DPPH自由基的清除率计算公式为：清除率(％)＝[1-(A_t-A_r)/A₀)]×100％；其中，A为各组的吸光度值。

(3)ABTS自由基的清除

ABTS+工作液：使用前打开分光光度计，将ABTS+溶液稀释成在734nm处的吸光度为0.7±0.02；

A_t：100uL EPS溶液+5mL ABTS+工作液；

A_r：样品液的吸光值；

A₀：将样品液换成蒸馏水；

混匀后置于30℃的恒温水浴锅中反应5min，在734nm处测定吸光值；

ABTS自由基的清除率计算公式为：清除率(％)＝[1-(A_t-A_r)/A₀)]×100％。

2、实验结果

植物乳杆菌DNB1胞外多糖的体外抗氧化能力测定结果如图5所示，可以看出，植物乳杆菌DNB1胞外多糖对DPPH自由基的清除率为57.66％，与0.25mg/mL Vc溶液无显著性差别(P>0.05)；与阳性对照Vc相比，植物乳杆菌DNB1胞外多糖对羟基自由基和ABTS自由基清除的能力较弱，分别为32.65％、28.64％。

综上所述，植物乳杆菌DNB1胞外多糖的浓度为0.05～0.40mg/mL时，随着植物乳杆菌DNB1胞外多糖浓度的逐渐增高，其清除DPPH自由基、羟基自由基和ABTS自由基的能力逐渐增强，呈剂量的依赖关系，表明植物乳杆菌DNB1胞外多糖具有较好的体外抗氧化活性。

实施例6植物乳杆菌DNB1胞外多糖对小鼠肠道菌群的影响

选取5周龄SPF级别的BALB/c雄性小鼠30只，将其随机分为3组，每组10只，依次为：空白对照组：灌胃生理盐水；低剂量EPS组：灌胃50mg/kg/d的EPS；高剂量EPS组：灌胃500mg/kg/d的EPS；灌胃量为200μL/d，灌胃周期为28d；灌胃期间，在灌胃1d、7d、14d、21d和28d采集每只小鼠的粪便；其中，灌胃生理盐水28d的样品组为C组；灌胃低浓度EPS前的样品组为l d组；灌胃低浓度EPS 28d的样品组为Ld组；灌胃高浓度EPS前的样品组为hd组；灌胃高浓度EPS 28d的样品组为Hd组。

将小鼠粪便样品送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司对细菌的16S rRNA的V3-V4可变区进行测序分析，基于IonS5TMXL的测序平台，构建小片段文库，并采用单端测序(Single-End)的方法进行测序分析；通过对Reads剪切过滤、可执行的分类操作单位(OTUs)聚类、物种注释以及相对丰度分析，从而揭示样品的物种构成；α多样性和β多样性的进一步分析，能够探索样品间菌群的差异。

1、样本复杂度分析

1)物种多样性曲线

(1)实验方法

常用来描述组内样品多样性的曲线主要包括稀释曲线和等级聚类曲线。

稀释曲线是以选取的测序数据量与相应的OTU数来构建曲线，主要是通过从样本中随机选取一定量的测序数据，并计算它们所代表物种数量(即OTUs数量)，稀释曲线可直接反映测序数据量的合理性，并间接反映样本中物种的丰富程度，表明了测序数据的数量是渐进和合理的，超过一定范围后，选取更多的数据量只会产生少量新的物种(OTUs)；在稀释曲线中，横坐标是从样品中随机选取的测序数据量，纵坐标是基于测序数构建的OTU数。

等级聚类曲线是以OTUs的排序编号为横坐标，OTUs中的相对丰度为纵坐标，主要通过从大到小排序的相对丰度(或包含的序列数)对OTU数量进行排序所得到对应的排序编号，反映出样本中物种的丰富度和均匀性；在横坐标上，物种的丰富度由曲线的宽度来表示，曲线在横坐标上跨度越大，表示物种的丰富度越高；在纵坐标上，曲线的平滑程度反映了样本中物种的均匀程度，曲线越平缓，物种的分布越均匀。

(2)实验结果

样本的稀释曲线和等级聚类曲线如图6所示，其中，(A)图为样本的稀释曲线，(A)图显示，在测序数据量达到5000后，稀释性曲线上的表现更接近平坦，表明在该实验中使用的测序量是合理的，更多的测序数据仅产生少部分新的OTU数；(B)图为样本的等级聚类曲线，(B)图显示，样本中包含的物种具有高度的丰富度和均匀性，可以合理地进行分析。因此，图6结果表明：小鼠粪便样品中包含的物种具有高度的丰富度和均匀性，可以合理的进行分析，同时实验所选取的样本量已足够充分，基本可以检测出小鼠粪便样品中所有的细菌。

2)物种累积箱形图

(1)实验方法

实验所选取的样本量是否充分可利用物种累积箱形图评估。当有足够充分的样本量时，可以预测物种的丰富度。从结果中可以得知在连续采样期间出现新OTU(新物种)的速率。在一定范围内，随着采样量的增加，若箱形图的位置迅速上升即表示在群落中有大量的新物种，表明样本量不足，需继续增加采样量；当箱形图位置趋于缓慢上升并且趋于平缓时，即表示不再会出现新的物种，表明采样量充分，此时可进行数据分析。

(2)实验结果

样本的物种累积箱形图如图7所示，可以看出，当样本量逐渐增多时，样品中含有的物种数目也不断增多，最终趋于平缓，表明实验所选取的样本量已足够充分，基本可以检测出小鼠粪便样品中所有的细菌。

2、OTU分布韦恩图

(1)实验方法

通过聚类得到的OTUs分析结果，分析不同样本(组)之间共有和独有的OTUs，绘制韦恩图(Venn Graph)。

(2)实验结果

不同样本的OTU分布韦恩图如图8所示，可以看出，在灌胃低剂量EPS 28d后，小鼠肠道内的菌群丰度增加；而灌胃高剂量EPS 28d后，小鼠肠道内的菌群丰度减少，可能是因为肠道内形成了优势菌群，导致其他细菌不能在肠道内定值生长。

3、各样本在科水平和属水平上的菌群分析

(1)实验方法

分别对各样本在科水平和属水平上进行菌群分析，选取每组样本在科水平和属水平上最大丰度排名前10的物种。

(2)实验结果

各样本在科水平上的菌群分析结果图如图9所示，可以看出，与C组相比，Ld组和Hd组均能够提高乳酸杆菌科的相对丰度，降低葡萄球菌科的相对丰度。

各样本在属水平上的菌群分析结果图如图10所示，可以看出，与C组相比，Ld组和Hd组均能够提高乳酸杆菌属的相对丰度，分别增加了4.95％和4.47％，降低葡萄球菌属的相对丰度。

4、β多样性(Beta diversity)分析

1)NMDS分析

(1)实验方法

β多样性是对不同样本中微生物群落组成的不同进行比较分析，其中，无度量多维标定法(NMDS，Non-Metric Multi-Dimensional Scaling)是基于样本中包含的物种信息以点的形式反映在二维平面上。并且不同样品之间的差异程度由点与点之间的距离反映，可以反映样本的组间和组内差异等。

(2)实验结果

NMDS分析结果如图11所示，可以看出，Hd组与hd组，以及Ld组与ld组相对的距离较远，说明两组之间的菌群丰度有所差异。

2)UPGMA聚类树

(1)实验方法

UPGMA(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean)是一种常用的聚类分析方法，其可通过构建样品聚类树，反映不同样品之间菌群结构的相似性。距离越小，表示亲缘关系越近，即样品间的菌群结构越相似。

(2)实验结果

UPGMA聚类树如图12所示，可以看出，Ld组与Hd组亲缘性更近，表明Ld组小鼠的肠道菌群结构与Hd组更为接近，而hd组与ld组亲缘性更近，表明hd组小鼠肠道菌群结构与ld组更为接近。

以上结果说明：植物乳杆菌DNB1胞外多糖能够提高肠道菌群中乳酸杆菌属的相对丰度，降低葡萄球菌属的相对丰度，具有调节肠道菌群的功能。

实施例7植物乳杆菌DNB1胞外多糖对小鼠血液抗氧化活性的影响

以上实施例5表明植物乳杆菌DNB1胞外多糖在体外具有清除自由基的活性，为了科学评价其抗氧化功能，进一步研究了不同剂量的植物乳杆菌DNB1胞外多糖在BALB/c雄性小鼠灌胃28d后，对小鼠血液中谷胱甘肽氧化物酶(GSH-Px)和总抗氧化能力(T-AOC)的影响。

1、实验方法

小鼠血液的采集：在灌胃28d后，将小鼠饥饿过夜处理，眼球取血致死，将小鼠的血液保存于-60℃，备用；

小鼠血液抗氧化功能的测定：小鼠血液中的GSH-Px和T-AOC均采用检测试剂盒进行测定，参照说明书的具体步骤进行检测。

2、实验结果

植物乳杆菌DNB1胞外多糖对小鼠血液GSH-Px活性的影响结果如图13所示，可以看出，Ld组小鼠血液中的GSH-Px活性明显高于C组和Hd组，且Ld组显著(P<0.05)高于C组小鼠血液中的GSH-Px活性。

植物乳杆菌DNB1胞外多糖对小鼠血液T-AOC活性的影响结果如图14所示，可以看出，与C组相比，Ld组小鼠血液中的T-AOC水平上升了78.2％，有显著性差异(P<0.05)，而Hd组上升了19.7％，但无明显差异。

以上结果说明：植物乳杆菌DNB1胞外多糖能够显著提高小鼠血液中谷胱甘肽氧化物酶(GSH-Px)活性和总抗氧化能力，对小鼠血液具有显著的抗氧化活性。

最后应说明的是：以上所述实例仅为对本发明的实施方式进行描述，并不用以限制本发明，本领域的技术人员应当理解：凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应应落入本发明的权利要求确定的保护范围。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一株植物乳杆菌DNB1及其胞外多糖和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 1471

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcatggcgg cgtgctatac atgcagtcga acgaactctg gtattgattg gtgcttgcat 60

catgatttac atttgagtga gtggcgaact ggtgagtaac acgtgggaaa cctgcccaga 120

agcgggggat aacacctgga aacagatgct aataccgcat aacaacttgg accgcatggt 180

ccgagcttga aagatggctt cggctatcac ttttggatgg tcccgcggcg tattagctag 240

atggtggggt aacggctcac catggcaatg atacgtagcc gacctgagag ggtaatcggc 300

cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca 360

caatggacga aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaagggttt cggctcgtaa 420

aactctgttg ttaaagaaga acatatctga gagtaactgt tcaggtattg acggtattta 480

accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt 540

tgtccggatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc 600

cttcggctca accgaagaag tgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag 660

tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg 720

cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagta tgggtagcaa acaggattag 780

ataccctggt agtccatacc gtaaacgatg aatgctaagt gttggagggt ttccgccctt 840

cagtgctgca gctaacgcat taagcattcc gcctggggag tacggccgca aggctgaaac 900

tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagctac 960

gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatact atgcaaatct aagagattag acgttccctt 1020

cggggacatg gatacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1080

taagtcccgc aacgagcgca acccttatta tcagttgcca gcattaagtt gggcactctg 1140

gtgagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct 1200

tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gatggtacaa cgagttgcga actcgcgaga 1260

gtaagctaat ctcttaaagc cattctcagt tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg 1320

aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt 1380

gtacacaccg cccgtcacac catgagagtt tgtaacaccc aaagtcggtg gggtaacctt 1440

ttaggaacca gccgcctaag gtgaacagat t 1471

Claims

1.一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DNB1，其特征在于，该菌株于2019年7月15日保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60728。

2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌DNB1，其特征在于，所述植物乳杆菌DNB1的16SrDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.权利要求1或2所述植物乳杆菌DNB1、其菌悬液、其发酵液或其代谢产物在制备胞外多糖中的应用。

4.一种植物乳杆菌DNB1胞外多糖，其特征在于，由权利要求1或2所述植物乳杆菌DNB1发酵而得到。

5.根据权利要求4所述的植物乳杆菌DNB1胞外多糖，其特征在于，其制备方法为：将权利要求1或2所述植物乳杆菌DNB1接种于MRS液体培养基中，恒温发酵培养，活化，离心得发酵液；将发酵液与三氯乙酸溶液混合，静置，离心得上清液；将上清液与乙醇混合，静置，再离心得沉淀；在沉淀中加入去离子水溶解后，透析，真空冷冻干燥，即得所述植物乳杆菌DNB1胞外多糖。

6.根据权利要求5所述的植物乳杆菌DNB1胞外多糖，其特征在于，所述植物乳杆菌DNB1的接种量为2％～4％；所述恒温发酵培养的温度为35℃～39℃。

7.权利要求4～6任一所述植物乳杆菌DNB1胞外多糖在调节肠道菌群或制备肠道菌群调节剂中的应用。

8.权利要求4～6任一所述植物乳杆菌DNB1胞外多糖在提高抗氧化能力或制备抗氧化剂中的应用。

9.一种肠道菌群调节剂，其特征在于，包括权利要求4～6任一所述植物乳杆菌DNB1胞外多糖。

10.一种抗氧化剂，其特征在于，包括权利要求4～6任一所述植物乳杆菌DNB1胞外多糖。