CN116103201B - 一种植物乳植杆菌lp10及其在产胞外多糖和/或抗氧化方面的应用、产品和方法 - Google Patents

一种植物乳植杆菌lp10及其在产胞外多糖和/或抗氧化方面的应用、产品和方法 Download PDF

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Abstract

本发明一种植物乳植杆菌LP10及其在产胞外多糖和/或抗氧化方面的应用、产品和方法，属于微生物技术领域。所述植物乳植杆菌LP10的保藏编号为CCTCC NO:M 2022574。本发明还提供植物乳植杆菌LP10在产胞外多糖、和/或抑菌、和/或抗氧化、和/或细胞黏附、和/或细胞吞噬、和/或细胞增殖方面的应用，以及基于该植物乳植杆菌LP10的抗氧化产品、产胞外多糖的方法及体外抑菌方法。本发明的植物乳植杆菌LP10可产高含量的胞外多糖，高效清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基，对Caco‑2细胞具有较高的黏附能力，对RAW264.7细胞具有较高的吞噬指数和较强的相对增殖率。

Description

一种植物乳植杆菌LP10及其在产胞外多糖和/或抗氧化方面 的应用、产品和方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种植物乳植杆菌LP10及其在产胞外多糖和/或抗氧化方面的应用、产品和方法。
背景技术
乳酸菌作为常见的益生菌，具有抑制病原菌的黏附和定植、增强机体免疫和肠道黏膜屏障等多种生理功能。有研究发现，乳酸菌发挥益生作用，可能和其在生长代谢过程中产生的细菌素、胞外多糖及超氧化物歧化酶等物质有关。乳酸菌胞外多糖是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到胞外的一种多糖类高分子化合物，能够发挥抗氧化、抑菌、降血糖、免疫调节等功能。
活性氧(ROS)，包括羟自由基(OH•)、超氧自由基(O2•−)和过氧化氢(H2O2)，是生命体有氧代谢的产物。在正常情况下，ROS在生命活动中起着重要作用，它们通常是由人体的抗氧化防御和修复系统控制的。然而，由于疾病、感染和辐射，不能有效清除它们时，或由于外源性自由基的入侵或辐射氧化应激而导致它们超过正常水平时，过量的ROS攻击细胞成分(如脂质、蛋白质和核酸)，破坏细胞的完整性，导致严重的健康问题，如癌症、阿尔茨海默氏症、帕金森症和动脉粥样硬化等。使用抗氧化剂可能是缓解活性氧引起的疾病的有效治疗策略。许多类型的抗氧化剂已被证明具有不同的功能，并在体内防御网络中发挥重要作用。尽管据报道合成抗氧化剂在减缓氧化应激过程方面相当有效，但它们的安全性和毒性非常令人担忧。近年来，天然抗氧化剂因其在维护人体健康和预防和治疗疾病方面的作用而受到科学家和公众的广泛关注。多糖被认为是有前途的抗氧化剂，可以作为开发有效和无毒药物的重要候选者，在体外和体内具有更强的抗氧化活性。
可高产胞外多糖的植物乳植杆菌Lactiplantibacillus plantarum，同时发挥抗氧化、抑菌及免疫调节的作用，目前本领域尚未见报道。
发明内容
基于本领域的上述空白，本发明提供一种从自然界中分离得到的高产胞外多糖的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10及其应用，该菌株可同时发挥抗氧化、抑菌及免疫调节作用。
本发明的技术方案如下：
一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：M2022574。
保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10在产胞外多糖、和/或抑菌、和/或抗氧化或制备抗氧化产品、和/或细胞黏附、和/或制备免疫调节产品方面的应用。
培养所述菌株LP10时产胞外多糖；
优选地，所述培养指：菌株LP10在37℃下于MRS培养基中培养24h-48h；
优选地，所述菌株LP10在37℃下于MRS培养基中培养24h产胞外多糖的含量为935.50mg/L；
优选地，所述抑菌指体外抑菌；
优选地，所述体外抑菌指体外抑制病原菌；所述病原菌选自：由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、变异链球菌组成的组；
优选地，所述抗氧化包括：清除自由基；所述自由基选自：由DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基组成的组；
优选地，所述细胞黏附指黏附Caco-2细胞；优选地，菌浓度1×108CFU/mL的所述菌株LP10对Caco-2细胞的黏附能力为8.9 CFU/cell；
优选地，所述免疫调节选自细胞吞噬和/或细胞增殖；
优选地，所述细胞吞噬指菌株LP10产的胞外多糖吞噬RAW264.7细胞；
优选地，菌株LP10产的浓度为50mg/L的胞外多糖对RAW264.7细胞的吞噬指数为1.9；
优选地，所述细胞增殖指菌株LP10产的胞外多糖能够促进RAW264.7细胞增殖；RAW264.7细胞是巨噬细胞的一种，巨噬细胞是先天免疫系统不可或缺的组成部分，一旦机体受到损害，巨噬细胞会迅速引发免疫反应，消除危险并恢复稳定状态。本发明的菌株LP10通过自身产的胞外多糖对RAW264.7细胞发挥增殖及吞噬能力，进而起到免疫调节的作用。
优选地，菌株LP10产的浓度为50mg/L的胞外多糖对RAW264.7细胞的相对增殖率为146.6%。
一种抗氧化产品，包括抗氧化活性成分，其特征在于，所述抗氧化活性成分包括：保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10。
一种产胞外多糖的方法，其特征在于，用保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10产胞外多糖。
培养所述菌株LP10产胞外多糖；
优选地，所述培养指：菌株LP10在37℃下于MRS培养基中培养24h-48h；
优选地，所述菌株LP10在37℃下于MRS培养基中培养24h产胞外多糖的含量为935.50mg/L。
一种免疫调节产品，包含：免疫调节活性成分，其特征在于，所述免疫调节活性成分包括：保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10。
所述免疫调节活性成分还包括：保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10产的胞外多糖。
一种体外抑菌方法，其特征在于，用保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10抑菌。
所述抑菌指抑制病原菌；所述病原菌选自：由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、变异链球菌组成的组；
优选地，活菌数为107CFU的菌株LP10对活菌浓度106CFU/mL的金黄色葡萄球菌的抑菌圈为30mm；
优选地，活菌数为107CFU的菌株LP10对活菌浓度106CFU/mL的大肠杆菌的抑菌圈为37mm；
优选地，活菌数为107CFU的菌株LP10对活菌浓度106CFU/mL的沙门氏菌的抑菌圈为34mm；
优选地，活菌数为107CFU的菌株LP10对活菌浓度106CFU/mL的变异链球菌的抑菌圈为22mm。
本发明从酸奶样品中分离、筛选获得一株具有拉丝现象的菌株，经测定其培养过程中可产生高含量的胞外多糖，将该菌株经分子鉴定得知，其系一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株，将其命名为LP10。通过进一步的实验发现，该菌株LP10可高效清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基，并对Caco-2细胞具有较高的黏附能力。同时，该菌株LP10及其所产的胞外多糖对RAW264.7细胞具有较高的吞噬指数和较强的相对增殖率，说明其具有较好的免疫调节作用。该菌株LP10还对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、变异链球菌等病原菌具有显著的抑制作用。该菌株LP10对包括红霉素、青霉素、阿莫西林、氨苄西林、四环素、庆大霉素、头孢克洛、苯唑西林、头孢曲松、新生霉素、新霉素、头孢噻吩、阿奇霉素、甲氧嘧啶、利福平在内的各类抗生素敏感，具有安全性，可将其制备成益生菌制品或抗氧化产品，应用范围广泛。
本发明的植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10的保藏信息如下：
保藏编号：CCTCC NO：M2022574；
分类命名：Lactiplantibacillus plantarum LP10；
保藏日期：2022年5月09日；
保藏单位：中国典型培养物保藏中心；
保藏地址：中国、武汉、武汉大学。
附图说明
图1为本发明实验例1的LP10菌株的菌苔拉丝现象观察照片。
图2为本发明实验例1复筛菌株产胞外多糖含量测定结果。
具体实施方式
下面结合附图、实施例和实验例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此，也并以此限制本发明的保护范围。
生物材料的来源
本发明实验例2使用的大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌可商购获得；变异链球菌ATCC25175购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
实验例5使用的Caco-2细胞可商购获得。
实验例6使用的RAW264.7细胞可商购获得。
实验试剂及耗材
本发明实验例中使用的培养基：
MRS固体培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、柠檬酸氢二铵2g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min，调节pH 6.8。
MRS液体培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、柠檬酸氢二铵2g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、乙酸钠5g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min，调节pH 6.8。
LB培养基、哥伦比亚培养基均为商业培养基。
改良MRS固体培养基：将MRS固体培养基中葡萄糖浓度改为蔗糖60g/L。
如无特殊说明，本发明实验例和实验例中使用的各类试剂耗材均可商购获得，相关实验步骤均为本领域常见操作，具有本领域技术人员可常规理解的技术含义。
第1组实施例、本发明的菌株LP10
本组实施例提供一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10的保藏编号为CCTCC NO：M2022574。
任何培养、扩繁、发酵、富集、生产、制备、使用、接种、扩增、转化、修饰、改造、销售、许诺销售保藏编号为CCTCC NO：M 2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10的行为、用保藏编号为CCTCC NO：M 2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10产胞外多糖、和/或抑菌、和/或抗氧化或制备抗氧化产品、和/或细胞黏附、和/或制备免疫调节产品的行为均落入本发明的保护范围。
在具体的实施例中，所述的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10在培养时产胞外多糖；
优选地，所述菌株LP10在37℃下于MRS培养基中培养24h产胞外多糖的含量为935.50mg/L；
优选地，所述菌株LP10对抗生素敏感；所述抗生素选自由红霉素、青霉素、阿莫西林、氨苄西林、四环素、庆大霉素、头孢克洛、苯唑西林、头孢曲松、新生霉素、新霉素、头孢噻吩、阿奇霉素、甲氧嘧啶、利福平组成的组。
本领域技术人员可根据实际生产需要，结合药品领域生产工艺的常规技术手段或基本常识（例如，《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等），对药用辅料进行常规选择或调整，进而将保藏编号为CCTCC NO：M 2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10制成不同剂型、不同存储条件、不同保质期的产品，这对于本领域技术人员而言无技术障碍，是可以并容易做到的。
第2组实施例、本发明的菌株LP10的应用
本组实施例提供保藏编号为CCTCC NO：M 2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10在产胞外多糖、和/或抑菌、和/或抗氧化或制备抗氧化产品、和/或细胞黏附、和/或制备免疫调节产品方面的应用。
在一些实施例中，培养所述菌株LP10时产胞外多糖；
优选地，所述培养指：菌株LP10在37℃下于MRS培养基中培养24h-48h；
优选地，所述菌株LP10在37℃下于MRS培养基中培养24h产胞外多糖的含量为935.50 mg/L；
优选地，所述抑菌指抑制病原菌；所述病原菌选自：由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、变异链球菌组成的组；
优选地，所述抗氧化包括：清除自由基；所述自由基选自：由DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基组成的组；
优选地，所述细胞黏附指黏附Caco-2细胞；优选地，菌浓度1×108 CFU/mL的所述菌株LP10对Caco-2细胞的黏附能力为8.9 CFU/cell；
优选地，所述免疫调节选自细胞吞噬和/或细胞增殖；
优选地，所述细胞吞噬指菌株LP10产的胞外多糖吞噬RAW264.7细胞；
优选地，菌株LP10产的浓度为50mg/L的胞外多糖对RAW264.7细胞的吞噬指数为1.9；
优选地，所述细胞增殖指菌株LP10产的胞外多糖能够促进RAW264.7细胞增殖；RAW264.7细胞是巨噬细胞的一种，巨噬细胞是先天免疫系统不可或缺的组成部分，一旦机体受到损害，巨噬细胞会迅速引发免疫反应，消除危险并恢复稳定状态。本发明的菌株LP10通过自身产的胞外多糖对RAW264.7细胞发挥增殖及吞噬能力，进而起到免疫调节的作用。
优选地，菌株LP10产的浓度为50mg/L的胞外多糖对RAW264.7细胞的相对增殖率为146.6%。
在一些实施例中，所述一种抗氧化产品包括抗氧化活性成分，所述抗氧化活性成分包括：保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10。
在另一些实施例中，所述一种免疫调节产品包含：免疫调节活性成分，所述免疫调节活性成分包括：保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10。
在一些进一步的实施例中，所述抗氧化产品还包括：辅料。
在另一些进一步的实施例中，所述免疫调节产品还包括：辅料。
在具体的实施例中，所辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。
根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合药物制备领域的常规技术手段（例如，《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等），本领域技术人员可对上述辅料进行选择和调配，并将保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10制成不同的剂型，例如粉剂、片剂、注射剂、口服液、胶囊剂、颗粒剂、喷雾剂、凝胶剂、膏剂等。
第3组实施例、本发明的抗氧化产品
本组实施例提供一种抗氧化产品。本组所有的实施例都具有如下共同特征：所述一种抗氧化产品包括抗氧化活性成分，所述抗氧化活性成分包括：保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10。
在进一步的实施例中，所述的一种抗氧化产品，还包括：辅料。
在具体的实施例中，所辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。
根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合药物制备领域的常规技术手段（例如，《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等），本领域技术人员可对上述辅料进行选择和调配，并将保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10制成不同的剂型，例如粉剂、片剂、注射剂、口服液、胶囊剂、颗粒剂、喷雾剂、凝胶剂、膏剂等。
第4组实施例、本发明的产胞外多糖的方法
本组实施例提供一种产胞外多糖的方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：用保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10产胞外多糖。
在一些实施例中，培养所述菌株LP10产胞外多糖；
优选地，所述培养指：菌株LP10在37℃下于MRS培养基中培养24h-48h；
优选地，所述菌株LP10在37℃下于MRS培养基中培养24h产胞外多糖的含量为935.50mg/L。
第5组实施例、本发明的免疫调节产品
本组实施例提供一种免疫调节产品。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述一种免疫调节产品包含：免疫调节活性成分，所述免疫调节活性成分包括：保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10。
在进一步的实施例中，所述免疫调节活性成分还包括：保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10产的胞外多糖。
在更进一步的实施例中，所述一种免疫调节产品还包含：辅料。
优选地，所述免疫调节选自细胞吞噬和/或细胞增殖；
优选地，所述细胞吞噬指菌株LP10产的胞外多糖吞噬RAW264.7细胞；
优选地，菌株LP10产的浓度为50mg/L的胞外多糖对RAW264.7细胞的吞噬指数为1.9；
优选地，所述细胞增殖指菌株LP10产的胞外多糖能够促进RAW264.7细胞增殖；RAW264.7细胞是巨噬细胞的一种，巨噬细胞是先天免疫系统不可或缺的组成部分，一旦机体受到损害，巨噬细胞会迅速引发免疫反应，消除危险并恢复稳定状态。本发明的菌株LP10通过自身产的胞外多糖对RAW264.7细胞发挥增殖及吞噬能力，进而起到免疫调节的作用。
优选地，菌株LP10产的浓度为50mg/L的胞外多糖对RAW264.7细胞的相对增殖率为146.6%。
在具体的实施例中，所辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。
根据本发明的内容，出于实际生产应用中的不同需求，再结合药物制备领域的常规技术手段（例如，《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等），本领域技术人员可对上述辅料进行选择和调配，并将保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10制成不同的剂型，例如粉剂、片剂、注射剂、口服液、胶囊剂、颗粒剂、喷雾剂、凝胶剂、膏剂等。
第6组实施例、本发明的体外抑菌方法
本组实施例提供一种体外抑菌方法。本组实施例都具备如下共同特征：用保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10抑菌。
在一些实施例中，所述抑菌指抑制病原菌；所述病原菌选自：由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、变异链球菌组成的组；
优选地，活菌数为107CFU的菌株LP10对活菌浓度106CFU/mL的金黄色葡萄球菌的抑菌圈为30mm；
优选地，活菌数为107CFU的菌株LP10对活菌浓度106CFU/mL的大肠杆菌的抑菌圈为37mm；
优选地，活菌数为107CFU的菌株LP10对活菌浓度106CFU/mL的沙门氏菌的抑菌圈为34mm；
优选地，活菌数为107CFU的菌株LP10对活菌浓度106CFU/mL的变异链球菌的抑菌圈为22mm。
实验例1、产胞外多糖菌株的筛选
（1）样品采集
从青海农家自制酸奶样品中取样30份，将收集到的样品装入样品管，并放置于有冰袋的泡沫盒子内，保持较低温度带回实验室，进行分离。
（2）样品预处理
将采集到的生物样品称取1g样品放入装有9mL无菌水的15mL离心管中，涡旋振荡器振荡3次，每次1min，间隔时间15s。
（3）样品分离
震荡完成后立即吸取100μL悬液加入到900μL无菌水中，振荡混匀，则完成一次稀释；共稀释3次，获得4个稀释梯度，即1、10-1、10-2、10-3这4个梯度稀释液；取10-1、10-2、10-3三个梯度的稀释液各100μL，分别涂布于MRS固体培养基，而后将平板移入37℃恒温培养箱培养；将不同梯度平板上颜色、大小、质地、形态不相同的单菌落分别挑出，共10株，分别编号为01#，02#，……，10#。并对挑出的菌株利用梯度稀释法进行纯化，获得纯培养体后，甘油保存。
（4）产胞外多糖菌株的筛选
①菌液制备：将纯化后得到的菌株分别接种到MRS液体培养基中，37℃恒温培养箱培养12h，再将菌液按1%（v/v）的接种量接种于新鲜培养基中，37℃恒温培养箱培养4-10h，待菌株达到对数生长后期、稳定前期时，收集菌液备用。
②将备用菌液震荡混匀，取2-10 μL菌液点板于改良MRS固体培养基上，而后将平板移入37℃恒温培养箱培养48 h，用无菌牙签挑菌，记录菌株拉丝现象。
③记录每个平板菌苔生长状况，并记录拉丝现象，制作拉丝现象表格，详情见表1。
表1. 菌株产胞外多糖能力记录表
注：+++++表示拉丝最显著；++++表示拉丝极其显著；+++表示拉丝显著；++表示拉丝明显；+表示有拉丝；-表示无拉丝。
实验结果表明，有4株实验菌株其菌落拉丝现象明显，分别编号为01#、02#、05#、10#。
（5）产胞外多糖菌株复筛
在37℃厌氧条件下，将4株菌株01#、02#、05#、10#放入含4％葡萄糖的MRS培养基中培养24h。在此基础上，在4℃、8000×g条件下离心10min，得到无细胞上清液(CFCS)，向上清中加入终浓度为4%的三氯乙酸（用来沉淀蛋白质），在4℃下静置6h，然后再次离心。之后在上清液中加入预冷过的乙醇并在4℃下再放置24h。最后通过离心提取多糖沉淀物，用去离子水溶解定容，即为粗多糖溶液。通过苯酚-硫酸法测定多糖含量。结果如表2、图2所示：
表2. 复筛菌株产胞外多糖含量测定结果
。
结果显示菌株05#、10#的粗多糖的产量相对较高，同时，结合菌落拉丝结果，选取这2株菌进行下一步实验。
实验例2、产胞外多糖菌株对病原菌的抑制能力
指示菌悬液的制备：将大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌分别在LB平板培养基上活化，37℃培养24h，挑取菌苔至生理盐水制备菌悬液，调整菌液浓度至108CFU/mL。变异链球菌ATCC25175按照2％(v/v)接种至BHI液体培养基中，37℃培养16～20 h后，调节菌液浓度为108CFU/mL。
菌株发酵液制备：将初筛得到的2株乳杆菌按1%（v/v）接种至MRS液体培养基中，37℃培养12h。
抑菌实验：将含有1.5%琼脂的MRS肉汤培养基（变异链球菌使用BHI固体培养基）冷却至55℃左右，与指示菌悬液按一定比例混匀，使指示菌的活菌数在106CFU/mL数量级，然后迅速倾注于预先放置牛津杯的平板中，待培养基冷却凝固后，取出牛津杯，于每孔注入200μL菌株发酵液（活菌数为108CFU/mL数量级），37℃过夜培养后，测量抑菌圈直径。
表3. 产胞外多糖菌株对病原菌的抑制作用
。
表3结果表明，初筛菌株10#对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和变异链球菌都有较强的抑制作用，其中对大肠杆菌的抑制作用最为显著。
实验例3、产胞外多糖菌株鉴定
对筛选的目的菌株10#进行培养，收集菌体，提取基因组DNA，采用中国发明专利ZL202210478937.4第58段记载的通用引物27F和1492R扩增其16SrDNA片段，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并对PCR产物进行测序。其中PCR反应体系：10×buffer10μL，10mMdNTP2μL，上下引物各1μL，DNA模板2μL，Taq酶0.5μL，ddH2O34μL。95℃预变性10min；然后94℃30s、60℃30s、72℃1min共35个循环，结束后72℃延伸5min。将PCR产物通过凝胶电泳检测后送往武汉金开瑞生物工程有限公司测序。将鉴定的基因序列用BLAST工具在NCBI数据库中进行比对，根据分子生物学鉴定结果，菌株的拉丁文名称为Lactiplantibacillus plantarum，确定该菌株为植物乳植杆菌。将该菌株命名为LP10，并送保藏，其保藏信息如下：
保藏编号：CCTCC NO：M2022574；
分类命名：Lactiplantibacillus plantarum LP10；
保藏日期：2022年5月09日；
保藏单位：中国典型培养物保藏中心；
保藏地址：中国、武汉、武汉大学。
实验例4、产胞外多糖植物乳植杆菌LP10抗氧化活性检测
（1）植物乳植杆菌LP10发酵上清液和完整细胞菌悬液样品的制备
将上述活化后的LP10菌液经1000r/min离心分别收集上清液（即为发酵上清液）和菌体沉淀，菌体用PBS洗涤2次后重悬，调整菌浓度至109CFU/mL，即为乳酸菌完整细胞悬液；
（2）DPPH自由基清除能力测定
将0.5mL的样品加入到1mL 0.01mmol/L新鲜配制的DPPH-无水乙醇溶液中，混匀，在黑暗中避光室温反应30min，10000r/min离心2min，取上清液在517nm波长处测定吸光值，记为As。空白组以等体积无水乙醇替换DPPH溶液测量吸光值，记为Ab；对照组以等体积蒸馏水（或PBS）替换样品溶液测量吸光值，记为Ac。
DPPH自由基清除率（%）=[1-（As-Ab）/Ac]×100
其中，As为样品组吸光值；Ac为对照组吸光值（蒸馏水替代样品）；Ab为空白组吸光值（无水乙醇替代DPPH）。
（3）羟自由基清除能力测定
1mL2.5mM1,10-邻菲罗啉（Sigma，USA）、1mLPBS（pH7.4）、1mL样品和1mL2.5mMFeSO4混匀。加入1mL20mM的H2O2，37°C恒温水浴反应1.5h，在536nm波长处测定其吸光度AS；用1mL蒸馏水代替1mLH2O2测定其吸光度A0；用1mL蒸馏水代替1mL样品测定其吸光度A1。
羟自由基清除能力（%）=（AS-A1）/（A0-A1）×100
其中，AS是样品的吸光度；A1表示控制溶液的吸光度，含1,10-邻菲罗啉、FeSO4和过氧化氢，不含样品；A0表示空白溶液的吸光度，不含样品和H2O2。
（4）超氧阴离子自由基清除能力测定
取1mL 150mmol/L Tris-HCl（pH 8.2）于试管中，依次加入1mL 3mmol/L二乙三胺五乙酸、1mL 1.2mmol/L邻苯三酚，再加入0.5mL样品，充分混匀，总反应体系体积是3.5mL。混合物于25℃恒温水浴反应10min后，在325nm波长处测吸光度。
O2-·清除率（%）=1-[(A11-A10)/(A01-A00)]×100
式中：A00为不含样品和邻苯三酚吸光度；A01为不含样品、含邻苯三酚吸光度；A10为含样品、不含邻苯三酚吸光度；A11为含样品和邻苯三酚吸光度（注：不含的部分用等体积150mmol/L Tris-HCl（pH 8.2）代替）。
表4. 植物乳植杆菌LP10的自由基清除能力实验结果
。
实验结果表明：植物乳植杆菌LP10表现出较高的DPPH自由基清除能力，以及较强的羟自由基、超氧阴离子自由清除活性，说明该菌株本身具有较强的抗氧化能力。
实验例5、植物乳植杆菌LP10与Caco-2细胞黏附实验
（1）Caco-2细胞培养
人结肠癌细胞系Caco-2来源于中国典型培养物保藏中心（武汉，中国）。Caco-2细胞在DMEM培养基中培养，培养基中添加10％热灭活（56℃，30min）胎牛血清（FBS），1％青霉素和链霉素，37℃，90％湿度，5％CO2培养箱中培养。
（2）细胞黏附实验
①实验菌株的液体培养：使用2代菌液，2%接种量，9mL培养基/15mL离心管，37℃，静置培养15h。
②单细胞层的制备：将Caco-2细胞分别接种至添加了 20%（v/v）胎牛血清的 DMEM培养基中，转移至 12 孔细胞培养板，细胞添加量为每孔1mL的2.4×105cell/ml的细胞，5% CO2、37℃恒温培养，隔天换液，直到获得单细胞层备用；
③菌悬液的制备：与此同时，取已培养好的目标菌株菌液，10000 r/min 室温离心1 min 收集菌体，并用无菌 PBS 洗涤两次，用DMEM 培养基重悬，调整到菌液浓度为1×108CFU/mL；
④共同培养：备好的Caco-2细胞的单细胞层，吸去培养基，加入 PBS 缓冲液漂洗2次，吸去缓冲液，再加入制备好的菌悬液 1 mL/孔，混匀后，5% CO2、37℃共孵育 2 h；
⑤小心移去培养上清，加入无菌 PBS 漂洗 5 次以除去未黏附的细菌；
⑥加入胰酶细胞消化液0.2 mL/孔，消化5min，以使细胞从培养板孔中洗脱下来，收集溶液即为样品；
⑦将收集的样品进行梯度稀释和活菌计数。
上述细胞黏附性实验以鼠李糖乳杆菌LGG作为对比菌株，每个实验做3个平行，鼠李糖乳杆菌LGG是行业内公认的黏附性较好的商业菌株，通过黏附实验对菌株与Caco-2细胞的黏附性进行检测，结果如表5。
黏附能力按如下公式计算：
黏附能力（CFU/cell）=黏附在细胞上的菌数（CFU）/孔中的细胞数（cells）
实验结果如表5所示；
表5. 植物乳植杆菌LP10与Caco-2细胞黏附结果
。
在体外使用细胞模型对益生菌的黏附能力进行评价，是一种快速且直观的办法。目前使用最多的是Caco-2和HT-29细胞，两者均为结肠癌细胞系。其中Caco-2细胞形态和功能与正常的小肠上皮细胞非常接近，例如，含有肠道上皮细胞绒毛以及相应的酶，因此被广泛用于细菌黏附性研究试验。结果如表5所示，植物乳值杆菌LP10与Caco-2细胞的黏附能力为8.90 CFU/cell，而LGG与Caco-2细胞的黏附能力为3.51 CFU/cell，说明植物乳植杆菌LP10在肠上皮细胞上具有良好的定植能力。
实验例6、植物乳植杆菌LP10胞外多糖对RAW264.7细胞增殖和吞噬能力的影响
（1）植物乳植杆菌LP10胞外多糖的提取
在37℃厌氧条件下，将植物乳植杆菌LP10放入含4％葡萄糖的MRS培养基中培养24h。在此基础上，在4℃、8000×g条件下离心10min，得到无细胞上清液(CFCS)，向上清中加入终浓度为4%的三氯乙酸（用来沉淀蛋白质），在4℃下静置6h，然后再次离心。之后在上清液中加入预冷过的乙醇并在4℃下再放置24h。最后通过离心提取多糖沉淀物，用DMEM溶液溶解定容，并用0.22μm 滤头过滤除菌，通过苯酚-硫酸法测定多糖含量，用DMEM溶液稀释到指定浓度。
（2）采用CCK-8法测定胞外多糖对RAW264.7细胞增殖的影响
RAW264.7细胞以1×105个/mL密度接种于96孔细胞培养板中（每孔100μL），细胞贴壁后加入有药品的DMEM细胞培养液替换原培养液。实验设空白组（DMEM培养液）、EPS组（EPS的浓度为50mg/L），每组设5个重复。37℃，5%CO2培养箱中培养24h。培养结束后，吸去旧的培养基，每孔加入100μL含10％CCK-8的DMEM培养基，避光，放入CO2培养箱中继续培养30min；在450nm下检测各孔OD值，按下面的公式计算细胞相对增殖率。
细胞相对增殖率%=实验组OD值/空白组OD值。
（3）采用中性红法测定胞外多糖对RAW264.7细胞吞噬能力的影响
RAW264.7细胞以1×105个/mL密度接种于96孔细胞培养板中（每孔100μL），细胞贴壁后，弃掉原培养基，加入含有药品的DMEM细胞培养液。实验分组同实验例6（1），每组设5个重复。37℃，5%CO2培养箱中培养24h；弃去孔内的上清培养液，然后避光条件下，加入0.1%的中性红-PBS溶液，置于37℃，5%CO2培养箱中孵育1h；孵育结束后，弃去上清液，室温下PBS洗三遍。然后向各孔中加入裂解液（乙酸：无水乙醇＝1：1）避光静置，待细胞完全裂解之后，使用酶标仪在540nm波长处测定各孔的吸光度值。
细胞吞噬指数 =实验组OD值/空白组OD。
表6. LP10胞外多糖对RAW264.7细胞增殖和吞噬能力结果
。
巨噬细胞是先天免疫系统不可或缺的组成部分，一旦机体受到损害，巨噬细胞会迅速引发免疫反应，消除危险并恢复稳定状态。吞噬作用是脊椎动物对抗病原体入侵的重要防御机制，吞噬作用的增加是巨噬细胞活化的主要和显着特征。结果如表6所示，植物乳植杆菌LP10能够促进RAW264.7细胞的增殖，同时促进RAW264.7细胞吞噬活性，有效发挥免疫调节作用。
实验例7、植物乳植杆菌LP10对抗生素敏感性试验
将植物乳植杆菌LP10在MRS固体平板上划线活化后，挑取菌苔至生理盐水中制备菌悬液，调整菌悬液浓度为108CFU/mL，取100μL菌悬液，用无菌棉签均匀涂布于MRS固体平板上，将抗生素药敏试纸片有序置于平板表面，置于厌氧条件下，37℃培养24-36h后，用游标卡尺测量抑菌圈直径。根据美国临床和实验标准协会CLSI的评价标准，判断抗生素对植物乳植杆菌LP10的耐药性，结果见表7。
表7. 植物乳植杆菌LP10对16种常见抗生素的敏感性试验结果
。
表7结果表明，植物乳植杆菌LP10对测试的15种常用抗生素均敏感，表明该菌株是具有开发应用潜力的安全益生菌。

Claims (10)

1.一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：M2022574。
2.保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10在产胞外多糖、和/或抑菌、和/或抗氧化或制备抗氧化产品、和/或细胞黏附、和/或制备免疫调节产品方面的应用；所述抑菌指体外抑菌；所述体外抑菌指体外抑制病原菌；所述病原菌选自：由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、变异链球菌组成的组。
3.根据权利要求2所述的保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10在产胞外多糖、和/或抑菌、和/或抗氧化或制备抗氧化产品、和/或细胞黏附、和/或制备免疫调节产品方面的应用，其特征在于，培养所述菌株LP10时产胞外多糖；
和/或，所述培养指：菌株LP10在37℃下于MRS培养基中培养24h-48h；
和/或，所述菌株LP10在37℃下于MRS培养基中培养24h产胞外多糖的含量为935.50mg/L；
和/或，所述抗氧化包括：清除自由基；所述自由基选自：由DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基 组成的组；
和/或，所述细胞黏附指黏附Caco-2细胞；和/或，菌浓度1×108 CFU/mL的所述菌株LP10对Caco-2细胞的黏附能力为8.9 CFU/cell；
和/或，所述免疫调节选自细胞吞噬和/或细胞增殖；
和/或，所述细胞吞噬指菌株LP10产的胞外多糖促进RAW264.7细胞的吞噬活性；
和/或，菌株LP10产的浓度为50mg/L的胞外多糖促进RAW264.7细胞的吞噬活性达到吞噬指数为1.9；
和/或，所述细胞增殖指菌株LP10产的胞外多糖能够促进RAW264.7细胞增殖；
和/或，菌株LP10产的浓度为50mg/L的胞外多糖对RAW264.7细胞的相对增殖率为146.6%。
4.一种抗氧化产品，包括抗氧化活性成分，其特征在于，所述抗氧化活性成分包括：保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10。
5.一种产胞外多糖的方法，其特征在于，用保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10产胞外多糖。
6.根据权利要求5所述的一种产胞外多糖的方法，其特征在于，培养所述菌株LP10产胞外多糖；
和/或，所述培养指：菌株LP10在37℃下于MRS培养基中培养24h-48h；
和/或，所述菌株LP10在37℃下于MRS培养基中培养24h产胞外多糖的含量为935.50mg/L。
7.一种免疫调节产品，包含：免疫调节活性成分，其特征在于，所述免疫调节活性成分包括：保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10。
8.根据权利要求7所述的一种免疫调节产品，其特征在于，所述免疫调节活性成分还包括：保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10产的胞外多糖。
9.一种体外抑菌方法，其特征在于，用保藏编号为CCTCC NO：M2022574的一株植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）菌株LP10抑菌；所述抑菌指抑制病原菌；所述病原菌选自：由金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、变异链球菌 组成的组。
10.根据权利要求9所说的一种体外抑菌方法，其特征在于，活菌数为107CFU的菌株LP10对活菌浓度106 CFU/mL的金黄色葡萄球菌的抑菌圈为30mm；
和/或，活菌数为107CFU的菌株LP10对活菌浓度106 CFU/mL的大肠杆菌的抑菌圈为37mm；
和/或，活菌数为107CFU的菌株LP10对活菌浓度106 CFU/mL的沙门氏菌的抑菌圈为34mm；
和/或，活菌数为107CFU的菌株LP10对活菌浓度106 CFU/mL的变异链球菌的抑菌圈为22mm。
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