CN113373084B - 一种抗菌且产胞外多糖的弯曲乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗菌且产胞外多糖的弯曲乳杆菌及其应用，涉及微生物领域。本发明提供的弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116，保藏编号为CGMCC No.21575，该弯曲乳杆菌对酸碱和温度的适应性很强，耐受模拟胃肠道环境；该弯曲乳杆菌及其发酵上清液有抑制致病菌和抗氧化的能力。此外，该弯曲乳杆菌可以产生胞外多糖，弯曲乳杆菌经发酵、离心和沉淀获得的胞外多糖和经纯化获得的胞外多糖中性组分有抑制致病菌和抗氧化的能力。本发明分离得到的弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116既具有广谱抑菌功能，又能产生具有生物活性的胞外多糖，因此，该弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116可广泛应用于抗菌和抗氧化领域。

Description

一种抗菌且产胞外多糖的弯曲乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种耐受模拟胃肠道环境、抗菌且产胞外多糖的弯曲乳杆菌及其应用。
背景技术
乳酸菌作为重要的益生菌之一，对人类健康起着积极的作用，并且它们通常被认为是安全的(generally recognized as safe，GRAS)。乳酸菌的益生作用表现在可以调节免疫力、降低血清胆固醇含量、预防心血管疾病，维持肠道内菌群平衡、促进营养物质吸收、缓解乳糖不耐症和抑制肿瘤细胞的形成等，同时对致病菌有抑制作用。乳酸菌的益生作用与其产生的代谢产物密切相关，比如有机酸、细菌素、甘露醇、1,3-丙二醇、脂肪酸以及胞外多糖等。
近年来，随着对乳酸菌胞外多糖研究的兴起，国内外学者从不同来源的乳酸菌中分离提纯了不同类型的胞外多糖并研究其理化性质和功能特性。胞外多糖是一种被分泌在细胞外或轻微吸附于细菌细胞或以囊状形式黏附于细菌细胞表面的大分子聚合物，属于微生物次级代谢产物。胞外多糖按照其组成单体的不同，可分为同多糖(由同一种单糖组成)和杂多糖(由不同种单糖组成)。研究表明，乳酸菌所产生的胞外多糖可以被用作天然和安全的增稠剂、乳化剂或稳定剂来改善食品质地。此外，胞外多糖还具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤、调节免疫力、降高血压、降胆固醇以及促进益生菌在宿主肠道中定植等多种功能特性。因此，从具有益生潜力的乳酸菌中分离提取胞外多糖，研究菌株本身和其胞外多糖的生物活性，对于开发功能性食品和饲料，扩展胞外多糖在食品、药品和化妆品行业的应用具有重要意义。
目前已报道的研究主要针对弯曲乳杆菌菌株的益生功能及所产细菌素进行开展，没有涉及弯曲乳杆菌的广谱抑菌和胞外多糖。因此，筛选一株既具有益生潜力和广谱抑菌功能，又能产具有生物活性胞外多糖的菌株对食品、饲料和药品行业具有重大意义。
鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种广谱抑菌，且产具有生物活性的胞外多糖的弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116。
发明内容
为实现上述目的，本发明提供了一种广谱抑菌，且产具有生物活性的胞外多糖的弯曲乳杆菌。弯曲乳杆菌包括Lactobacillus curvatus SJTUF 62116菌株及其衍生菌株。本发明还提供弯曲乳杆菌及其胞外多糖的应用。
本发明从青海湖裸鲤中分离筛选得到了一株弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)SJTUF 62116，并于2020年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21575，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院。
弯曲乳杆菌包括SJTUF 62116菌株及其衍生菌株。
进一步地，弯曲乳杆菌衍生菌株包括经插入、缺失或突变弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116中的碱基对获得的菌株。
进一步地，弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116对酸碱或冷热的生长条件有很强的适应性，耐受模拟胃肠液的环境。在pH为3、4、9和10或者在温度为5、10、45和50℃的环境下依然具有生长能力，用pH2.5的人工模拟胃液对弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116处理3h，该菌株的存活率基本保持不变，再经人工模拟肠液处理8h后，该菌株存活率依然高达91.33％，显著性高于鼠李糖乳杆菌GG(P<0.5)。
进一步地，弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116发酵产生胞外多糖；胞外多糖经纯化后获得胞外多糖中性组分。
进一步地，胞外多糖中性组分分子量为31.9kDa，单糖组成为：阿拉伯糖：氨基葡萄糖：葡萄糖：甘露糖，其摩尔比为：0.09:0.22:1:1.10。
本发明还提供了弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116及其发酵上清液的应用。
弯曲乳杆菌及其发酵上清液用于抑制致病菌和/或制备致病菌抑制剂。
进一步地，弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116的发酵上清液对十种致病菌均有显著的抑菌作用。
进一步地，弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116及其发酵上清液抑制的致病菌包括大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、痢疾志贺氏菌、粘质沙雷菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌和弗氏柠檬酸杆菌。
弯曲乳杆菌产生的胞外多糖和胞外多糖中性组分用于抑制致病菌和/或制备致病菌抑制剂。
进一步地，弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116产生的胞外多糖和胞外多糖中性组分能够一定程度抑制致病菌的生长，具有体外抑菌能力。
进一步地，弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116产生的胞外多糖和胞外多糖中性组分抑制的致病菌包括大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。
弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116及其发酵上清液用于抗氧化和/或制备抗氧化剂。
进一步地，弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116的发酵液上清液具有体外抗氧化作用。
进一步地，弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116的发酵液上清液对DPPH(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl)自由基和ABTS[2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)]自由基有较强的清除率。
弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116产生的胞外多糖和胞外多糖中性组分用于抗氧化和/或制备抗氧化剂。
进一步地，弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116的胞外多糖和胞外多糖中性组分具有体外抗氧化作用。
进一步地，弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116的胞外多糖和胞外多糖中性组分对DPPH自由基和ABTS自由基有较强的清除率。
本发明还提供一种弯曲乳杆菌产生的胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116接种于MRS(deMan,Rogosa and Sharpe)液体培养基中，恒温静置培养，得到发酵液；
步骤2、将步骤1得到的发酵液，经沸水浴后冷却至室温，加入三氯乙酸溶液，搅拌混合；离心收集上清液，减压浓缩，加无水乙醇混合后静置，离心收集沉淀；
步骤3、将步骤2得到的沉淀加入蒸馏水溶解后，透析，真空冷冻干燥，得到胞外多糖。
进一步地，步骤3还包括：将得到的胞外多糖经DEAE-纤维素-52离子交换柱分离纯化后，收集蒸馏水洗脱的组分，透析，冷冻干燥，得到弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)SJTUF 62116的胞外多糖中性组分。
进一步地，步骤1中，弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116的接种量为1-3％。
更进一步地，步骤1中，弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116的接种量为2％。
进一步地，步骤1中，恒温发酵培养的温度为28-32℃。
更进一步地，步骤1中，恒温发酵培养的温度为30℃。
进一步地，步骤1中，恒温发酵培养的时间为22-26h。
更进一步地，步骤1中，恒温发酵培养的时间为24h。
进一步地，弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116制备胞外多糖的方法还包括以下步骤：
(1)将活化两次的弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116按1-3％的接种量接种于MRS液体培养基中，28-32℃静置培养22-26h；
(2)发酵液经沸水加热10min后冷却至室温，加入80％三氯乙酸至终浓度为4％(w/v)，室温下搅拌2h，离心(12 000g，15min，4℃)收集上清液，减压浓缩为原体积的1/3(v/v)。向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，4℃静置12h后离心(12000g，20min，4℃)收集沉淀。
(3)将沉淀溶于蒸馏水，减压浓缩后转移到截留分子量为14KDa的透析袋中透析2天，每隔4小时换一次蒸馏水。收集透析液后进行真空冷冻干燥，即得胞外多糖。
进一步地，步骤(3)还包括用蒸馏水将胞外多糖配制成20mg/mL的溶液，经0.22μm滤膜过滤后上样于DEAE-纤维素-52离子交换柱，依次用0、0.1、0.2和0.5M的NaCl溶液梯度洗脱，洗脱速度为1mL/min。收集洗脱液(5mL/管)，用硫酸-苯酚法逐一检测每管的多糖含量，合并收集蒸馏水洗脱下来的单一峰组分，随后透析，浓缩，冻干，即得胞外多糖中性组分。
在本发明的较佳实施方式实施例1中，详细说明了弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)SJTUF 62116的分离、筛选与鉴定过程；
在本发明的另一较佳实施方式实施例2中，详细说明了弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116的益生功能评价的实验及结果；
在本发明的另一较佳实施方式实施例3中，详细说明了弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116胞外多糖的提取和纯化过程；
在本发明的另一较佳实施方式实施例4中，详细说明了弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116胞外多糖中性组分的性质；
在本发明的另一较佳实施方式实施例5中，详细说明了弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116胞外多糖生物活性鉴定。
本发明的技术效果体现在如下三方面：
1、筛选分离得到了一株弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116，该菌株能广谱抑菌。该菌株对酸碱和冷热环境均有较好的适应性，耐受模拟胃肠道环境；该菌株的发酵上清液对大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、痢疾志贺氏菌、粘质沙雷菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌均有显著的抑菌能力，且该菌株的发酵上清液对DPPH自由基和ABTS自由基有较强的清除率，具有潜在的益生作用；
2、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116具有高产胞外多糖的能力，由该菌株发酵产生的胞外多糖及胞外多糖中性组分对DPPH自由基和ABTS自由基具有较强的清除率，有体外抗氧化能力；
3、该菌株的胞外多糖及中性多糖组分对致病菌有抑制作用，其中高浓度胞外多糖可以杀灭大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌；因此，该弯曲乳杆菌(Lactobacilluscurvatus)SJTUF 62116在提高抑菌或制备抑菌剂、提高抗氧化能力或制备抗氧化剂方面均具有良好的应用前景。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是本发明的一个较佳实施例2的弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF62116菌株耐受模拟胃肠道环境实验结果图；
图2是本发明的一个较佳实施例5的弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF62116产生的胞外多糖和其中性组分抗氧化能力的测试结果图；
图3是本发明的一个较佳实施例5的弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF62116产生的胞外多糖和其中性组分抑菌能力的测试结果图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1：弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116的分离、筛选与鉴定
1、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116的分离
菌株分离自中国青海湖裸鲤体内。将裸鲤的内脏无菌收集4℃冰箱保存，在无菌条件下，取5g样品加入到45mL无菌水中，均质5min后梯度稀释(10-1-10-5)并震荡均匀。分别取100μL不同梯度的稀释液，涂布于MRS固体培养基上，30℃下厌氧培养48h。观察各平板上形成的菌落，挑取单菌落在MRS固体培养基平板上划线，30℃厌氧培养48h。
2、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116的筛选
挑取单菌落到MRS液体培养基中，30℃静置培养24h。发酵液经离心和0.22μm滤膜过滤后获得发酵上清液。将浓度为1.5％的琼脂培养基冷却至50℃，按每平皿10mL倒入90mm无菌平皿中，等琼脂培养基凝固后轻轻放入无菌牛津杯。将过夜培养的肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis ATCC13076)用无菌生理盐水洗涤，并稀释到浓度为106CFU/mL左右，按1:100加入50℃含0.8％琼脂的LB软固体培养基中，混合均匀后倒入含牛津杯的平皿中。
等含菌培养基凝固后取出牛津杯，向每孔中加入200μL无细胞发酵上清液，在4℃冰箱中扩散10h后，将平皿转移到37℃恒温培养箱。恒温培养24h后，选取使牛津杯周围出现明显抑菌圈的菌株，-80℃下保存于含25％甘油的LB培养基中，备用。
3、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116的鉴定
(1)形态学鉴定
观察MRS固体培养基上单菌落的生长特征，包括：菌落大小、形态、颜色、表面是否光滑、边缘是否粗糙、是否隆起等。对菌株进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察菌体形态和颜色。
(2)生理生化鉴定
采用API 50 CHL试剂条对菌株进行生理生化鉴定，实验步骤按说明书进行，使用apiweb进行结果分析。
(3)16S rDNA鉴定
将单菌落接种于MRS液体培养基中30℃培养24h，离心收集菌体，采用试剂盒提取菌株DNA作为16S rDNA扩增模板，实验步骤按说明书进行。利用细菌通用引物27F和1492R扩增细菌16S rDNA，PCR反应后进行测序并与blast数据库进行对比。根据菌株的形态学、生理生化和16S rDNA的结果，鉴定其为弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)，命名为SJTUF62116。
实施例2：弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116的益生功能评价
1、酸碱性适应能力评价
将菌株接种到pH为3.0、4.0、9.0和10.0的MRS液体培养基中，30℃静置培养培养7d，用相同pH的MRS液体培养基作为对照，观察并记录结果。结果显示，菌株在pH为3.0、4.0、9.0和10.0的环境下均能很好的生长，说明其具有较强的酸碱适应能力。
2、冷热性适应能力评价
将菌株接种到MRS液体培养基中，分别在5℃和10℃静置培养14d，在45℃和50℃静置培养7d，用MRS液体培养基作为对照，观察并记录结果。结果显示，菌株在5℃、10℃、45℃和50℃的温度下均能很好的生长，说明其具有较强的温度适应能力。
3、抑菌谱测定
选取大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)、肠炎沙门氏菌(SalmonellaEnteritidis ATCC13076)、副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus ATCC 33846)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC13565)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus ATCC9341)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae CGMCC 1.1869)、粘质沙雷菌(Serratiamarcescens ATCC 14040)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa IQCC 12625)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii ATCC 50205)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundiiATCC 8090)，共十种病原菌标准菌株为指示菌。
选取S.Enteritidis SJTUF 10852、S.Enteritidis SJTUF 10941、S.TyphimuriumSJTUF 11153、S.Choleraesuis SJTUF 11157、S.Indiana SJTUF 11218、S.Derby SJTUF11224，共6株耐药沙门氏菌分离菌株为指示菌。
将菌株接种到MRS液体培养基中，30℃静置培养24h。发酵液经离心和0.22μm滤膜过滤后获得乳酸菌发酵上清液。将浓度为1.5％的琼脂培养基冷却至50℃，按每平皿10mL倒入90mm无菌平皿中，等琼脂培养基凝固后轻轻放入无菌牛津杯。将过夜培养的指示菌用无菌生理盐水洗涤，并稀释到浓度为106CFU/mL左右，按1:100加入50℃含0.8％琼脂的LB培养基中，混合均匀后倒入含牛津杯的平皿中。等含菌培养基凝固后取出牛津杯，向每孔中加入200μL发酵上清液，在4℃冰箱中扩散10h后，将平皿转移到37℃恒温培养箱。恒温培养24h后，观察抑菌圈并用电子游标卡尺记录抑菌圈直径。结果显示，菌株的发酵上清液在选择的十种致病菌的固体培养基中均产生了抑菌圈，抑菌圈直径范围为15.90-24.97mm，表明该菌株具有广谱抑菌的能力，对革兰氏阳性菌和阴性菌均存在抑制作用。同时，该菌株的发酵上清液对选择的耐药沙门氏菌均有较好的抑制作用，说明该菌株的代谢产物可以有效抑制耐药沙门氏菌。
表1弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116发酵上清液的抑菌谱
Figure BDA0003078475420000071
注：a抑菌圈直径包含牛津杯外径(7.8mm)；
b抑菌圈直径数值为三次实验结果的平均值。
表2弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116发酵上清液对耐药沙门氏菌的抑制
Figure BDA0003078475420000072
注：a抑菌圈直径包含牛津杯外径(7.8mm)；
b抑菌圈直径数值为三次实验结果的平均值；
c CHL：氯霉素；GEN：庆大霉素；KAN：卡那霉素；AMP：氨苄西林；CIP：环丙沙星；SUL：磺胺异恶唑；STR：链霉素；SXT：复方新诺明；TET：四环素；TOB：妥布霉素；DOX：强力霉素。
4、抗氧化活性测定
采用DPPH自由基清除活性和ABTS自由基清除活性评价弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116的抗氧化活性。
(1)DPPH自由基清除活性
将弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116的发酵上清液用蒸馏水稀释成5％浓度，取1mL 5％发酵上清液和1mL新鲜配制的0.1mM DPPH溶液(无水乙醇溶解)充分混合，室温避光孵育30min。将混合液离心(8000r/min，10min)，取上清液，测定其在517nm处的吸光值。
DPPH自由基清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100％
式中：A1表示5％发酵上清液和DPPH溶液的吸光值；A2表示5％发酵上清液和乙醇溶液的吸光值；A0表示蒸馏水和DPPH溶液的吸光值。
(2)ABTS自由基清除活性
将ABTS溶液(7mM)与过硫酸钾溶液(2.45mM)等体积混合，室温避光孵育16h，以制备ABTS·测定液。用PBS(pH7.4)缓冲液稀释ABTS溶液至734nm处的吸光值为0.70±0.02，备用。
将弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116的发酵上清液用蒸馏水稀释成5％浓度，取0.4mL 5％发酵上清液与3mL上述ABTS·测定液在室温下振荡1min，测定其在734nm处的吸光值。同时，以相同浓度的Vc作为对照。通过下式计算5％发酵上清液的ABTS自由基清除率(％)：
ABTS自由基清除率(％)＝(1-A1/A0)×100％
式中：A1表示5％发酵上清液和ABTS·测定液的吸光值；A0表示蒸馏水和ABTS·测定液的吸光值。
结果显示，5％发酵上清液对DPPH自由基清除率为95.83％，对ABTS自由基清除率为95.12％，表明弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116的发酵上清液具有很好的抗氧化性。
5、耐受模拟人工胃肠道能力的评价
配置模拟胃液(A液)：将0.3g胃蛋白酶溶于100mL PBS(pH2.5)溶液中，0.22μm滤膜过滤，4℃储存备用。配置模拟肠道液(B液)：将0.1g胰蛋白酶和1.8g胆盐溶于100mL PBS(pH8.0)溶液中，0.22μm滤膜过滤，4℃储存备用。
将菌株接种于MRS液体培养基中，30℃培养24h。将发酵液离心，收集菌体，用PBS溶液洗涤两次，并调整浓度为109CFU/mL。取1mL重悬液加至9mL A液中，37℃培养3h，采用平板计数法记录混合液0h和3h的菌落总数。取1mL上述混合液加至9mL B液中，37℃培养8h，采用平板计数法记录混合液中4h和8h的菌落总数。同时，选择鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus GG，LGG)为对照菌株。细菌存活率(％)根据下述公式计算：
细菌存活率(％)＝(LogNt/LogN0)×100％。
式中，Nt为t时刻细菌的菌落总数；N0为细菌初始菌落总数。
弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116菌株耐受模拟胃肠道环境的实验结果如图1所示，在模拟胃液环境下3h的存活率为100％，说明该菌株基本不受模拟胃液的酸性环境影响，此条件下，LGG的存活率为98.86％。经过模拟胃液的环境后，在模拟肠液环境下4h和8h的存活率分别为92.25％和91.33％，此条件下，LGG的存活率为69.68％和65.91％，表明该菌株有较强耐受模拟胃肠道环境的能力，且显著优于LGG的耐受能力。
6、耐药谱测定
选取氯霉素、万古霉素、庆大霉素、多粘菌素B、利福平、氨苄西林、红霉素、环丙沙星、青霉素、四环素，共十种抗生素进行菌株的耐药性测定。将过夜培养的菌株用0.85％生理盐水调节浓度至麦氏浊度0.5，涂布于MRS固体培养基平板中，待培养基干燥后，将抗生素药片贴放在培养基表面，37℃培养24小时，记录抑菌大小。同时，选择大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)为质控菌株。结果显示，该菌株对氯霉素、利福平、氨苄西林、红霉素、四环素表现出敏感性，对万古霉素，庆大霉素，多粘菌素B，环丙沙星，青霉素表现出耐药性。
实施例3：弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116胞外多糖的提取和纯化
将活化两次的菌株按2％(v/v)接种于MRS液体培养基中，30℃静置培养24h。发酵液经沸水加热10min后冷却至室温。随后加入80％的三氯乙酸溶液至终浓度为4％(w/v)，室温下搅拌2h。离心(12 000g，15min，4℃)收集上清液，减压浓缩为原体积的三分之一。向浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇，于4℃静置12h后离心(12 000g，20min，4℃)收集沉淀。将沉淀溶于蒸馏水，减压浓缩后转移到截留分子量为14KDa的透析袋中透析2天，每隔4小时换一次蒸馏水。收集透析液冷冻干燥后，即得到弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF62116胞外多糖(cEPS)，产量为283mg/L。
用蒸馏水将胞外多糖配制成20mg/mL的溶液，经0.22μm滤膜过滤后上样于DEAE-纤维素-52色谱柱，依次用0M、0.1M、0.2M和0.5M的NaCl溶液梯度洗脱，洗脱速度为1mL/min。收集洗脱液(5mL/管)，用硫酸-苯酚法逐一检测每管的多糖含量，合并收集主要的单一峰组分，随后透析、浓缩、冻干。结果显示，多糖经过DEAE-纤维素-52色谱柱洗脱出3个组分，包括1个水洗脱下来的中性多糖组分，2个NaCl溶液洗脱下来的酸性多糖组分。收集蒸馏水洗脱下来的组分，即为弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116中性胞外多糖组分(EPS-1)。
实施例4：弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116胞外多糖中性组分的性质
1、化学组成测定
采用硫酸-苯酚法对多糖中的总糖含量进行测定。先后将1mL多糖样品(0.25mg/mL)、1.0mL 6％苯酚溶液和5.0mL浓硫酸加入到试管中，混合均匀后静置20min，测定其在490nm波长处的吸光值。同时，用不同浓度的葡萄糖溶液制作标准曲线。通过对照葡萄糖标准曲线，计算出胞外多糖中性组分(EPS-1)中总糖含量为96.03％。
采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒检测多糖的蛋白含量。根据试剂盒操作说明绘制BSA标准曲线，并计算出EPS-1中蛋白含量为0.01％。
2、分子量大小测定
采用高效凝胶尺寸排阻色谱-多角度激光散色仪-示差折光检测仪联用分析法测定胞外多糖的纯度及其相对分子质量。将EPS-1溶解于流动相中配制成5mg/mL的多糖样品，经0.22μm滤膜过滤后，取100μL上清液进样。同时，以不同分子量大小的Dextran为标准品。收集光散射数据并用Astra软件计算多糖相对分子质量。结果显示，EPS-1为分子量相对均一的多糖，其分子量大小为31.9kDa。
3、单糖组成分析
利用离子色谱法对多糖进行单糖组成分析。称取4mg EPS-1样品，加入2mL三氟乙酸(TFA，2mol/L)，120℃水解2h。将水解产物减压蒸干，加入3mL甲醇溶液再次减压蒸干，并重复上述蒸干操作至TFA完全除去。加入2mL超纯水溶解水解物后稀释至200mL后用于后续上样。单糖标准品：鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、氨基葡萄糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。结果显示，EPS-1主要由阿拉伯糖、氨基葡萄糖、葡萄糖和甘露糖组成，摩尔比为：0.09:0.22:1:1.10。
实施例5：弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116胞外多糖生物活性鉴定
1、抗氧化活性测定
采用DPPH自由基清除活性和ABTS自由基清除活性评价胞外多糖的抗氧化活性。
(1)DPPH自由基清除活性
将多糖用蒸馏水配制成不同浓度的溶液，取1mL多糖溶液和1mL新鲜配制的0.1mMDPPH溶液(无水乙醇溶解)充分混合，室温避光孵育30min。将混合液离心(8000r/min，10min)，取上清液，测定其在517nm处的吸光值。同时，以相同浓度的Vc作为对照。通过下式计算多糖的DPPH自由基清除率(％)：
DPPH自由基清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100％
式中：A1表示多糖样品和DPPH溶液的吸光值；A2表示多糖样品和乙醇溶液的吸光值；A0表示蒸馏水和DPPH溶液的吸光值。
(2)ABTS自由基清除活性
将ABTS溶液(7mM)与过硫酸钾溶液(2.45mM)等体积混合，室温避光孵育12-16h，以制备ABTS·测定液。用PBS(pH7.4)缓冲液稀释ABTS溶液至734nm处的吸光值为0.70±0.02，备用。
将多糖用蒸馏水配制成不同浓度的溶液，取0.4mL多糖溶液与3mL上述ABTS·测定液在室温下振荡1min，测定其在734nm处的吸光值。同时，以相同浓度的Vc作为对照。通过下式计算多糖的ABTS自由基清除率(％)：
ABTS自由基清除率(％)＝(1-A1/A0)×100％
式中：A1表示多糖样品和ABTS·测定液的吸光值；A0表示蒸馏水和ABTS·测定液的吸光值。
如图2显示，A部分表示胞外多糖(cEPS)和胞外多糖中性组分(EPS-1)的DPPH自由基清除能力与其浓度的关系，B部分表示cEPS和EPS-1的ABTS自由基清除能力与其浓度的关系。结果显示，cEPS和EPS-1的DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力均与其浓度成正比，说明多糖的抗氧化能力依赖于多糖浓度。在浓度为5mg/mL时，EPS-1的DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力分别为84.50％和92.53％。cEPS的DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力分别为48.48％和47.45％。这些结果表明，胞外多糖具有一定的抗氧化性，且纯化后的EPS-1具有更强的抗氧化能力。
2、抑菌活性测定
采用生长曲线法测定多糖的抑菌活性。选择大肠杆菌(Escherichia coli ATCC25922)、肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis ATCC13076)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC13565)为指示菌。将指示菌过夜培养，用生理盐水稀释至浓度为107CFU/mL，备用。将多糖用LB液体培养基配制成不同浓度的多糖溶液，将200μL多糖溶液和2μL指示菌液加入到生长曲线专用板中，以添加LB培养基和指示菌液的孔为阳性对照，以只添加LB培养基的孔为空白对照。将生长曲线仪专用板放入生长曲线仪中，37℃下连续测定24h，每30min记录一次OD600值。将培养24h后的菌液涂布于LB平板中，计算菌落数。
如图3显示4％浓度下的胞外多糖(cEPS)和胞外多糖中性组分(EPS-1)分别对大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 25922)、肠炎沙门氏菌(Salmonella EnteritidisATCC13076)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC13565)的生长曲线的影响。结果显示，4％浓度下的cEPS和EPS-1均能显著性(p<0.05)抑制指示菌的生长，说明多糖能影响细菌正常的生长分裂，且cEPS的抑菌作用显著性优于EPS-1。4％cEPS可以完全抑制三种指示菌的生长，且培养24h后，经涂布平板法计数，LB平板上没有菌落出现，说明4％cEPS有杀菌作用。4％胞外多糖中性组分(EPS-1)从指示菌生长的对数期中期开始显示出抑制作用。对于金黄色葡萄球菌而言，EPS-1在其生长的对数中期显示了抑制作用，但在对数后期丧失了抑制作用。出现这种情况的原因可能是多糖对细菌的生长一边抑制，一边提供营养。当多糖浓度高时，抑制占主导地位，随着细菌生长，多糖被消耗，低浓度的多糖促进细菌生长并占主导地位。对于大肠杆菌和沙门氏菌而言，4％浓度的EPS-1可以从细菌生长的对数中期开始持续抑制到稳定期。
以上结果表明，弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116的胞外多糖及其中性组分具有影响致病菌正常生长的能力，且4％的胞外多糖(cEPS)可以有效灭活金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种弯曲乳杆菌，其特征在于，所述弯曲乳杆菌是SJTUF 62116菌株，所述弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21575，保藏日期为2020年12月31日。
2.一种如权利要求1所述的弯曲乳杆菌胞外多糖中性组分，其特征在于，所述胞外多糖中性组分分子量为31.9kDa，单糖组成为：阿拉伯糖：氨基葡萄糖：葡萄糖：甘露糖，其摩尔比为0.09:0.22:1:1.10；所述胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116接种于MRS液体培养基中，恒温静置培养，得到发酵液；
步骤2、将步骤1得到的发酵液，经沸水浴后冷却至室温，加入三氯乙酸溶液，搅拌混合；离心收集上清液，减压浓缩，加无水乙醇混合后静置，离心收集沉淀；
步骤3、将步骤2得到的沉淀加入蒸馏水溶解后，透析，真空冷冻干燥，得到胞外多糖；
所述弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116接种量为1-3％；所述恒温静置培养温度为28-32℃，培养时间为22-26h；所述沸水浴时间为10min；所述三氯乙酸溶液浓度为80％(w/v)，加入至所述发酵液，所述发酵液中所述三氯乙酸溶液的终浓度为4％(w/v)；所述减压浓缩的倍数为上清液的三分之一；加入所述无水乙醇的体积为所述浓缩液的3倍；所述胞外多糖的所述透析条件为截留分子量为14kDa透析袋，蒸馏水透析2天；所述步骤3还包括：将得到的所述胞外多糖经DEAE-纤维素-52离子交换柱分离纯化后，收集蒸馏水洗脱的组分，透析，冷冻干燥，得到所述弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)SJTUF 62116的胞外多糖中性组分。
3.一种如权利要求1或2中任一项所述的弯曲乳杆菌的应用，其特征在于，弯曲乳杆菌及其发酵上清液在制备致病菌抑制剂中的应用；所述弯曲乳杆菌及其发酵上清液抑制的致病菌为大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、痢疾志贺氏菌、粘质沙雷菌、铜绿假单胞菌、阪崎肠杆菌和弗氏柠檬酸杆菌。
4.如权利要求1或2中任一项所述的弯曲乳杆菌的应用，其特征在于，弯曲乳杆菌及其发酵上清液在制备抗氧化制剂中的应用。
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