CN113699063B - 一株降胆固醇副干酪乳杆菌及其应用 - Google Patents

一株降胆固醇副干酪乳杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株降胆固醇副干酪乳杆菌及其应用。该副干酪乳杆菌的名称为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)BY2，保藏号为CGMCC NO.22571，于2021年05月20日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明中的副干酪乳杆菌BY2对胃肠环境具有较好的耐受能力，通过胃肠道后仍具有较好的降胆固醇能力，且拥有较高的肠道黏附性和抗菌活性，有利于维持肠道正常微生物菌群平衡，因此，可将其用于降低血清胆固醇、改善肠道微生物菌群结构以及抑制致病菌的生长和繁殖方面。

Description

一株降胆固醇副干酪乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物工程领域，特别涉及一株降胆固醇副干酪乳杆菌及其应用。
背景技术
胆固醇(Cholesterol)，又称胆甾醇，广泛存在于动物体内，是人体正常组织细胞的主要成分，在正常的范围内(成年人:2.9～6.0mmol/L；儿童：3.1～5.2mmol/L)对人的健康和生理代谢发挥极其重要的影响，不仅仅是作为人的营养物质而存在，同时也参与到诸多方面的生理代谢当中。
大量数据表明，正常范围内的胆固醇是细胞膜和神经纤维组成的物质基础，是类固醇激素的合成原料，参与7-脱氢胆固醇的合成等。但是，胆固醇含量一旦超过正常范围就会在血管内皮中累积，逐渐聚集增多就会形成动脉粥样硬化斑块，斑块越大，血管管腔的狭窄与堵塞程度就会越严重，如果斑块突然破裂，就会使血管腔在很短时间内遭到堵塞，造成相应区域组织器官缺血坏死，导致心肌梗塞甚至脑梗死的发生。
许多流行病学调查及临床实验证实，高胆固醇血症是心血管类疾病的主要原因。临床研究表明，超过正常血清胆固醇水平(>5.2mmol)1mmol，患冠心病的几率增加35％，因冠心病致死的几率则上升45％。血清胆固醇含量每增加1％，患冠心病等心血管疾病的风险就提高约3％，相反，血清总胆固醇水平下降1％，患冠心病的几率就可减少2％～3％。
目前，降低人体当中血清胆固醇水平主要是通过抑制胆固醇的合成、抑制胆固醇的摄入和促进胆固醇分解等几个方面来进行，主要分为药物治疗和非药物治疗(饮食干预)两种方法。
药物治疗是指使用他汀类药物如莫那可林(monacolin)、洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)等，抑制3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶的活性，来降低内源性胆固醇的生成，从而降低血清当中的胆固醇水平。或通过使用临床药物伊泽替米贝、乳酸菌微生物制剂等，通过与转运蛋白Niemann-Pick C1 Like1(NPC1L1)结合而选择性地抑制小肠对胆盐的重吸收，从而增加胆汁酸的排出，促使更多的胆固醇向胆汁酸转化，从而降低血清胆固醇水平。这些药物虽然有一定的效果，但是副作用强，长期食用会造成血糖异常、肌病、认知障碍等，药物副作用强，而且价格高昂，长期以来收入一般的家庭难以负担得起。
非药物治疗主要是指饮食干预，是通过减少胆固醇高的食物的摄入，如猪肾、猪肝、虾皮、咸鸭蛋、鸭蛋黄、鸡蛋黄等，或通过物理方法如吸附法和蒸馏法等和生物方法如微生物菌体、酶法等来降低食品中胆固醇的含量，从而降低血清胆固醇的含量，避免摄入过多引发的一系列心脑血管疾病。通过饮食干预来降低血清当中的胆固醇水平虽然有一定的效果，但是长期以来难以坚持，因此，寻求一种非药物、安全、健康、有效的降胆固醇的方法势在必行。
乳酸菌的出现为人们降低血清胆固醇水平提供了一个新的方向。人体中含有大量的益生菌，其中乳酸菌的含量占50％以上，主要分布在胃、十二指肠、空肠、近端回肠中，大量研究表明，乳酸菌能够调节胃肠道正常菌群，提高食物消化率和生物效价，降低血清胆固醇，抑制肠道腐败菌生长，控制内毒素，提高机体免疫力，降解亚硝酸盐等等。
目前，中国专利数据库中，涉及关于具有降胆固醇功能的副干酪乳酸菌的申请件并不多，目前公开的仅有CN201410751969.2号《一种降胆固醇副干酪乳杆菌益生菌夹心饼干的制作方法》、CN201410722499.7号《一种降胆固醇副干酪乳杆菌益生菌巧克力的制作方法》和CN201510697710.9号《一种副干酪乳杆菌及其应用》。对于降胆固醇的副干酪乳酸菌的研究，也仅仅有CN201510697710.9号《一种副干酪乳杆菌及其应用》一份申请件关于降胆固醇副干酪乳杆菌的筛选，而且这些降胆固醇副干酪乳杆菌的文件中，关于降胆固醇副干酪乳杆菌的筛选无一采用硫酸铁铵法对乳酸菌进行大量快速筛选的同时，以耐受胃肠道环境能力，肠道黏附能力以及其抗菌活性作为指标来对高降胆固醇副干酪乳杆菌进行筛选，目前针对降胆固醇副干酪乳杆菌的文件仅仅是对单株菌株的益生能力进行了评价，忽略了系统评价其耐酸、耐胆盐、耐胃肠环境方面的能力，这就容易导致得到的菌株具有高降固醇能力，但是具有较差的耐胃肠环境的能力等益生功能，使之事实无法发挥其降胆固醇作用。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株降胆固醇副干酪乳杆菌。
本发明的另一目的在于提供所述降胆固醇副干酪乳杆菌的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一株降胆固醇副干酪乳杆菌，名称为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)BY2，保藏号为CGMCC NO.22571，于2021年05月20日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneral Microbiological Culture Collection Center，CMGCC)。
一种培养所述降胆固醇副干酪乳杆菌的方法，具体步骤为：将所述的降胆固醇副干酪乳杆菌接种于培养基中，于28℃～37℃条件下进行培养。
所述的培养基为MRS培养基。
所述的MRS培养基的pH值为3～6.2；pH值优选为6.2。
所述的培养的时间为24～48h；优选为48h。
所述的降胆固醇副干酪乳杆菌在制备降低血清胆固醇产品中的应用。
所述的产品包括微生物制剂、保健食品或药品。
所述的降胆固醇副干酪乳杆菌对胃肠环境具有较好的耐受能力，通过胃肠道后仍具有较好的降胆固醇能力。
所述的降胆固醇副干酪乳杆菌在制备改善肠道微生物菌群结构和/或抗菌产品中的应用。
所述的降胆固醇副干酪乳杆菌拥有较高的肠道黏附性和抗菌活性，有利于维持肠道正常微生物菌群平衡。
所述的抗菌产品为抑制致病菌的生长和/或繁殖的产品。
所述的致病菌为致病性大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)和沙门氏菌(Salmonella enterica)中的至少一种；更优选为致病性大肠杆菌(Escherichia coli)。
所述的致病性大肠杆菌(Escherichia coli)优选为大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC 25922。
所述的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)优选为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 51650。
所述的李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)优选为李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)CMCC 54002。
所述的沙门氏菌(Salmonella enterica)优选为鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellaenterica)GIM1.237。
所述的副干酪乳杆菌BY2的生物学特性为：副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)BY2在MRS液体培养基中培养72h，菌落的生长符合S型曲线，菌株在3h后开始进入对数生长期并大量产酸，随后快速生长至12～15h左右进入稳定期，pH值也趋于平缓，最后稳定在3.5左右。在MRS琼脂培养基上37℃培养48h后，菌株生长良好，菌落为乳白色圆形，菌落直径为0.5～1.0mm，菌落有凸起，边缘整齐；该菌株革兰氏染色呈阳性，显微镜下细胞形态多为短杆状，且倾向于成链，无鞭毛、不运动。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明中的副乳杆菌是先从发酵酸奶、泡菜、开菲尔等筛选出来的89株乳酸菌，通过硫酸铁铵法初步筛选出5株具有高降胆固醇能力的乳酸菌，然后经耐酸能力、耐胆盐能力、耐胃肠道环境能力、黏附肠道能力、抵抗致病菌能力等测试进一步筛选得到的副干酪乳杆菌BY2，该菌株具有高降固醇、耐胃肠道环境、高黏附性等益生特性，在降胆固醇益生菌产品的开发和利用具有广阔的应用前景，且本发明中的筛选方法能够为益生菌产品中益生菌的筛选提供一种新的理论基础和方法。
(2)本发明中的副干酪乳杆菌BY2在肠道黏附性和抗菌活性上比其他菌株有优势，在酸性环境、胆盐环境下仍具增殖能力，且在经模拟胃肠环境反应后仍能发挥较好的降胆固醇能力，为开发益生菌制剂提供坚实的基础，可用于开发降低血清胆固醇的功能性产品，如微生物制剂、保健食品或药品等，长期服用可以改善肠道微生物菌群结构，降低血清胆固醇水平，减少心血管疾病的发生。
(3)本发明中的副干酪乳杆菌BY2是一株经胃肠环境后仍具有高降胆固醇能力的副干酪乳杆菌，在不含胆盐条件下降低胆固醇效率达到49.26％，在pH 3.0的酸性条件存活率为72.404％，在0.02％胆盐条件下存活率为56.91％，且在该胆盐条件下，降胆固醇能力提高了7.625％；3.005×1010CFU/mL副乳杆菌BY2在模拟胃肠环境条件下反应后，存活率保持在107CFU/mL以上，且降胆固醇能力仍保持在35.81％，且其具有较高的肠道黏附能力，且对于肠道有害细菌具有抗菌活性。
附图说明
图1是胆固醇的标准曲线图。
图2是5株乳酸菌的降胆固醇能力对比结果图。
图3是5株乳酸菌的生长曲线图。
图4是5株乳酸菌的产酸能力对比结果图。
图5是5株乳酸菌的耐酸能力对比结果图。
图6是5株乳酸菌的耐胆盐能力对比结果图。
图7是5株乳酸菌分别在不含胆盐和含0.02％胆盐条件下的降胆固醇能力对比结果图。
图8是5株乳酸菌分别在不含胆盐和含0.02％胆盐条件下的降胆固醇效力对比结果图。
图9是5株乳酸菌在模拟胃肠环境条件下降胆固醇能力对比结果图。
图10是5株乳酸菌表面疏水性情况图。
图11是5株乳酸菌自凝集性情况图。
图12是5株乳酸菌交互凝集性情况图。
图13是5株乳酸菌的抗菌活性对比结果图；其中，A为5株乳酸菌的抗菌活性直观图；B为5株乳酸菌的抗菌活性统计结果。
图14是本发明菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)BY2的菌落形态图；其中，A为菌落形态；B为显微镜下的观察结果。
图15是本发明菌株副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)BY2的16s rDNA电泳鉴定图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和仪器均可通过市售获得。
实施例1：降胆固醇副干酪乳杆菌的初步筛选
1.1所需材料
乳酸菌固体培养基(MRS)：蛋白胨10g，牛肉膏5g，酵母粉4g，葡萄糖20g，吐温801mL，无水乙酸钠5g，柠檬酸铵2g，K2HPO4 2g，MgSO4 7H2O 0.2g，MnSO4 H2O 0.05g，碳酸钙20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 6.2，121℃，灭菌20min。
乳酸菌液体培养基(MRS)：蛋白胨10g，牛肉膏5g，酵母粉4g，葡萄糖20g，吐温801mL，无水乙酸钠5g，柠檬酸铵2g，K2HPO4 2g，MgSO4 7H2O 0.2g，MnSO4 H2O 0.05g，碳酸钙20g，蒸馏水1000mL，pH 6.2，121℃，灭菌20min。
MRS-CHOL培养基(胆固醇含量为100μg/mL)的制备：准确称取胆固醇0.1g放入小烧杯中并加入2mL吐温-80，搅拌均匀，加入到1L的MRS液体培养基中，121℃灭菌20min后形成溶液，备用。
PBS溶液：0.8％(w/v)NaCl，0.02％(w/v)KH2PO4，0.115％(w/v)Na2HPO4，调节pH为7.2。
100μg/mL胆固醇标准溶液：准确称取0.50g胆固醇溶于无水乙醇中并定容至50mL，用无菌的0.22μm孔径的滤膜过滤除菌。用移液管移取0.1mL该液，定容至10mL，然后装到无菌的小瓶中放置于4℃冰箱保存。
硫酸铁铵显色剂：称取0.443g硫酸高铁铵，加入到10mL 85％(w/v)磷酸中，制备储存液，可室温保存；取上述8mL储存液加入到92mL浓硫酸中，混匀即得到显色剂。
泡菜汁：购自广东新兴县某市场。
发酵酸奶：来源于佰生优酸奶发酵菌粉制备的酸奶；其制备方法如下：用开水将酸奶机内胆冲烫清洁后，倒入500～1000mL纯牛奶，从冰箱冷冻/冷藏层取出1小袋菌粉，常温放置约15min，加入到纯牛奶中，搅拌约5分钟混合均匀，放入酸奶机中恒温发酵6～10h，待观察到牛奶凝固即可。
开菲尔：君乐宝开菲尔酸奶。
市售酸奶：益力多、碧悠酸奶(原味)、华农酸奶(原味)和皇氏乳业爱特浓浓缩酸奶。
1.2菌株的分离与纯化
1.2.1菌株的分离
分别吸取泡菜汁、发酵酸奶、开菲尔、市售酸奶1mL到1.5mL离心管中，再从离心管中吸取100μL，注入另一盛有900μL PBS溶液中，震荡混匀。同法类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8CFU/mL的各种稀释度的菌悬液。选取合适梯度，吸取100μL稀释液在MRS固体培养基上进行涂布，做三个重复，37℃恒温培养24～48h。
1.2.2菌株的纯化
从各个平板中分别挑选不同大小、形状和颜色的10～15个单菌落，经过2次划线纯化，将得到单一菌株于MRS液体培养基37℃培养24～48h后，共获得89株菌，并根据来源的不同相应进行标号，分别取菌液与50％(v/v)甘油按1：1比例混合，-80℃保藏。
1.3降胆固醇副干酪乳杆菌的初步筛选
1.3.1胆固醇标准曲线的制作
100μg/mL胆固醇标准液：准确称取0.50g胆固醇溶于无水乙醇中并定容至50mL，用移液管移取0.1mL该液，定容至10mL，然后装到无菌的小瓶中放置于4℃冰箱保存。
取浓度为100μg/mL胆固醇标准液0，20μL，40μL，60μL，80μL，100μL分别加入10mL干净试管中，依次加入无水乙醇1mL，0.9mL，0.8mL，0.7mL，0.6mL，0.5mL，0.4mL，0.3mL，0.2mL，0.1mL，0mL，最后依次缓慢加入1mL配好的硫酸铁铵显色试剂，混匀，待管冷却至室温后，560nm波长下比色。以胆固醇浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，作标准曲线(GB 5009128-2016)，如图1所示。
1.3.2降胆固醇副干酪乳杆菌的初步筛选
将甘油保藏菌种分别以2％(v/v)的接种量接种于新鲜的MRS液体培养基中，放置于37℃，180r/min中培养，将过夜培养的种子液200μL接种到800μL的MRS-CHOL培养基中37℃培养24h，以200μL MRS液体接入到800μL的MRS-CHOL培养基作对照。
取0.2mL培养24h的菌液加入4.8mL的无水乙醇中，混匀，4℃3000r/min条件下离心10min，取上清。2mL硫酸铁铵显色剂缓慢加入到2mL上清中，混匀后在560nm测吸光值。按照公式计算胆固醇清除率，得出降胆固醇能力最好的5株乳酸菌(BY 12、BY 2、BY 20、BY 25和BY 10)，结果见表1。其中：
胆固醇清除率(％)＝[(A0-A1)×100]/A0；
A0：对照MRS-CHOL培养基的吸光值；
A1：实验组的吸光值。
表1. 5株乳酸菌的降胆固醇能力
Figure BDA0003203904370000061
Figure BDA0003203904370000071
结果如图2和表1所示，从发酵酸奶、泡菜、开菲尔等食品中筛选出来的菌株BY12、BY2、BY20、BY25以及BY10降胆固醇能力最好，其中BY12的降胆固醇能力最高，为49.26％，BY10最低，为39.26％。
实施例2：降胆固醇副干酪乳杆菌的进一步筛选
2.1生长曲线和产酸曲线
将5株优选菌株活化扩大培养后，分别以2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中，于37℃静置培养，每隔2h定时取样，测定培养液在600nm处的吸光值以及pH值，3次重复，然后绘制生长曲线和产酸曲线。
对于乳酸菌的生长曲线，结果如图3所示，5株乳酸菌的生长均符合S型曲线，因测定菌株生长的OD值，故未观察到衰亡期。各菌株在3h后开始进入对数生长期，随后快速生长至12～15h左右进入稳定期。不同的菌株生物量不同，BY12以及BY25稍高于BY2、BY20以及BY10。
对于乳酸菌的产酸能力，结果如图4所示，5株乳酸菌的产酸能力大致相同，均在3h后大量产酸，酸值快速下降至3.6左右，随后产酸曲线趋于平缓，最后稳定在3.5左右。
2.2耐酸能力测试
调节MRS液体培养基的pH来分析乳酸菌的耐酸能力。用0.1M的HCl溶液调节MRS液体培养基的pH分别为3.0、4.0、5.0、6.0，以自然pH的MRS液体培养基作为对照组，每个试验3次重复。
将这5株优选菌株菌悬液按2％(v/v)接种量分别接种于不同pH的MRS培养液中，置于37℃环境下培养，分别于0、2、4、6、8h后取样，以未接种菌株的MRS液体培养基为参比，测定不同培养基中OD600值，做3个平行样品并取其平均值，计算菌株的耐酸性。其中：
菌株的耐酸性存活率＝(实验组的OD600 nm/自然pH对照组的OD600 nm值)×100％。
表2.乳酸菌的耐酸性
Figure BDA0003203904370000072
Figure BDA0003203904370000081
在不同pH条件下乳酸菌的存活率如图5和表2所示，其中乳酸菌在不同pH条件下处理2h后乳酸菌的存活率如表2所示。5株乳酸菌的耐酸性存活率随着pH值的降低而不断降低，各菌株的耐酸性存在一定的差异，在pH值为3.0时，5株菌株均能生长，其中BY12表现出最好的耐酸性能。
2.3耐胆盐能力测试
通过分析乳酸菌早在含胆盐的培养基中的生长情况来判断其对胆盐的耐受能力。在MRS-THIO液体培养基(在MRS液体培养基中加入0.2％(w/v)巯基乙酸钠)中加入0.02％，0.04％，0.06％，0.08％，0.1％，0.2％，0.3％，0.4％，0.5％(w/v)的猪胆盐，调节pH为7.2，以不含胆盐的MRS液体培养基作对照。
将乳酸菌菌悬液按2％(v/v)的接种量分别加入到含不同胆盐浓度的MRS液体培养基中，每个试验3次重复，37℃培养24h后摇匀，测定不同菌株在不同浓度胆盐里生长的浑浊度(吸光度OD600)来分析其耐受水平。其中：胆盐耐受力(％)＝含胆盐培养基的OD值/不含胆盐培养基的OD值×100％。
在不同浓度胆盐条件下乳酸菌的存活率如图6所示，5株乳酸菌对胆盐的耐受能力相差不大，在胆盐浓度为0～0.1％范围内，随着胆盐浓度的增高，乳酸菌的耐胆盐能力迅速降低，当胆盐浓度升至0.1～0.2％时，乳酸菌耐胆盐能力几乎为0。其中，在胆盐浓度为0～0.1％范围内时，BY12、BY20的耐胆盐能力相对较好。
2.4在不含胆盐和含0.02％胆盐条件下降胆固醇能力
将甘油保藏菌种分别以2％(v/v)的接种量接种于新鲜的MRS液体培养基中，放置于37℃，180r/min中培养，将过夜培养的种子液200μL分别接种到800μL的MRS-CHOL培养基和800μL含0.02％(w/v)猪胆盐的MRS-CHOL中37℃培养24h，以200μL MRS液体分别接入到800μL的MRS-CHOL培养基和含0.02％(w/v)猪胆盐的MRS-CHOL作对照，每个试验3次重复。
取0.2mL培养24h的菌液加入4.8mL的无水乙醇中，混匀，4℃3000r/min条件下离心10min，取上清。2mL硫酸铁铵显色剂缓慢加入到2mL上清中，混匀后在560nm测吸光值，计算胆固醇清除率(降解率)：
胆固醇清除率(％)＝[(A0-A1)×100]/A0；
A0：对照组的吸光值；
A1：实验组的吸光值。
降胆固醇能力增加效力(％)＝B1-B0；
B0：不含胆盐组胆固醇清除率；
B1：含0.02％胆盐组胆固醇清除率。
表3在不含胆盐和含0.02％胆盐条件下降胆固醇能力
Figure BDA0003203904370000091
在不含胆盐和含胆盐条件下乳酸菌降胆固醇能力，如图7和表3所示，5株乳酸菌在不含胆盐的条件下，其降胆固醇能力与前面筛选时所测有所不同，这可能是由于乳酸菌的培养时间、反应接种量的不同所导致的。与不含胆盐条件下降胆固醇效果相比，在0.02％(w/v)胆盐条件下其降胆固醇效果增强，其中BY12降胆固醇效果最强，为56.82％，此次是BY2和BY25，分别为56.065％和53.035％，最后是BY20和BY10，分别为52.425％和41.115％。
在培养基中增加胆盐的含量，提高了乳酸菌的降胆固醇能力。各菌株降胆固醇能力增加效力如图8所示。其中BY2的增加效力最强。
2.5模拟胃肠环境下乳酸菌的存活率和降胆固醇能力
模拟胃液：NaCl 0.2g/100mL，胃蛋白酶(pepsin)0.35g/100mL，用1mol/L HCl调整pH为3.0，0.45μm Milippore PTFE滤膜过滤除菌备用。
模拟肠液：NaHCO3 1.1g/100mL，NaCl 0.2g/100mL，胰蛋白酶(trypsin)0.1g/100mL，猪胆盐0.02g/100mL，胆固醇10mg/100mL，调整pH值为8.0，0.45μm Milippore PTFE滤膜过滤除菌备用。
将乳酸菌分别以2％(v/v)的接种量接种于新鲜的MRS液体培养基中，放置于37℃，180r/min中培养，将过夜培养后的菌液放置于8000r/min、4℃离心10min，去掉上清液，加入等体积的PBS溶液洗涤沉淀两次，分别得到5株菌的菌悬液。
分别取0.5mL菌液加入到4.5mL的模拟胃液或PBS溶液中，震荡10s后放入37℃，180r/min厌氧培养，在处理2h取样，稀释到合适的梯度，涂布平板法计数，平行测定3次，按照公式计算乳酸菌的存活率。其中：
存活率(％)＝logCFUN1/logCFUN0×100％；
式中：N0:处理前的活菌菌落数；N1：用PBS溶液或模拟胃液处理过的活菌菌落数。
分别取0.5mL的上述3h人工胃液反应液加入到4.5mL的模拟肠液或PBS溶液中，震荡10s后放入37℃厌氧培养，在处理4h取样，稀释到合适的梯度，涂布平板法计数，平行测定3次，按照公式计算乳酸菌的存活率和降胆固醇能力。其中：
存活率(％)＝logCFUN1/logCFUN0×100％；
式中：N0:处理前的活菌菌落数；N1：用PBS溶液或模拟肠液处理过的活菌菌落数。
胆固醇清除率(％)＝[(A0-A1)×100]/A0；
式中：A0：对照模拟肠液的吸光值；A1：实验组的吸光值。
表4在模拟胃肠液中乳酸菌的存活率
Figure BDA0003203904370000101
在模拟胃肠液中乳酸菌的存活率见表4所示，5株乳酸菌在模拟胃液中反应后，5株乳酸菌对模拟胃液都具有一定的耐受性，BY12与0h相比下降了3个数量级，其余4种乳酸菌下降了2个数量级，5种乳酸菌对模拟肠液的耐受性较差，但活菌数仍维持在107CFU/mL。
表5在模拟胃肠液中乳酸菌降胆固醇能力
Figure BDA0003203904370000102
Figure BDA0003203904370000111
在模拟胃肠液中乳酸菌降胆固醇能力如表5和图9所示，5株乳酸菌模拟胃肠液中降胆固醇能力差异较大。其中BY2降胆固醇效果最强，为35.81％，此次是BY20和BY12，分别为35.33％和34.30％，最后是BY25和BY10，分别为32.06％和28.79％。
2.6肠道黏附性
将甘油保藏乳酸菌以2％(v/v)的接种量接种于MRS液体培养基中37℃，180r/min条件下培养24h，将细菌培养物以8000r/min，4℃，离心10min，收集菌体，用PBS溶液洗涤两次，再8000r/min离心10min，弃去上清液，再用PBS重悬菌体沉淀以获得菌悬液。将菌体以PBS溶液为空白对照，用PBS溶液调整菌液浓度，使其在分光光度计600nm波长下OD值为0.5±0.02。
2.6.1表面疏水性
通过试验菌株对碳氢化合物的亲和力反映菌株表面疏水性，即采用微生物粘着碳氢化合物法(Bacteria Adhesion To Hydrocarbons，BATH)测定乳酸菌细胞表面疏水性，具体步骤如下：
取2mL调整浓度后的菌液分别加入2mL二甲苯，对照组不加二甲苯，该两相体系通过涡旋彻底混合2min，室温条件下孵育1h来分离水和二甲苯相。小心吸取水相，以PBS为空白对照，测量OD600，每组平行3管，记录。
菌株表面疏水率(％)＝(对照组OD600-实验组OD600)/对照组OD600×100％。
结果如图10所示，5株乳酸菌的表面疏水性能不同，其中BY2的表面疏水性能最好，为53.39％；BY20和BY12次之，为52.50％和47.25％；BY10和BY25最低，为35.42％和34.10％。
2.6.2自凝集性
取2mL调整浓度后的菌液涡旋震荡10s，于37℃下静置2h。小心吸取1mL静置后的上清液，以PBS为空白对照，测量OD600，每组平行3管，记录。
自凝集率(％)＝1-(ODt/OD0)×100
式中，ODt表示t＝x h时的吸光度；OD0表示t＝0h时的吸光度。
结果如图11所示，5株乳酸菌的自凝集性差异较大，其中BY2的自凝集性最高，为31.67％；BY10和BY20次之，为30.41％和28.69％；BY25和BY12最低，为22.49％和13.29％。
2.6.3交互凝集性
将2mL乳酸菌和2mL病原菌菌悬液混合，放置37℃(勿摇动)4h后，取上清液，以PBS为空白对照，测量OD600，每组平行3管，记录。其中，病原菌为大肠杆菌(Escherichia coliATCC 25922，简称E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 51650，简称SA)、李斯特氏菌(Listeria monocytogenes CMCC 54002，简称LM)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica GIM 1.237，简称SE)，以上病原菌均购自广东省微生物培养中心(GDMCC)。
交互凝集率(％)＝[(ODpat+ODlab)-2×ODmix]×100/(ODpat+ODlab)；
式中，ODpat病原菌0h的OD值；ODlab：乳酸菌0h的OD值；ODmix：混匀液4h的OD值。
对5株降胆固醇能力最高的乳酸菌与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌和沙门氏菌四种致病菌的共凝聚能力进行测定。结果如图12所示，5株乳酸菌与大肠杆菌的共凝聚能力最强，均在20％以上，其中BY12最强，为28.17％；其次是李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌，其中BY2最强，分别为18.42％和10.10％；与沙门氏菌的共凝聚能力较差，其中共凝聚能力最强的为BY2，为9.17％，最差的为BY12，为7.04％。五株乳酸菌与四种致病菌的共凝聚率均高于致病菌的自凝聚率，这说明五种乳酸菌均具有促进这四种致病菌的聚集能力。
2.7抑菌活性
采用挖孔法测定菌株的抑菌能力。分别吸取100μL菌浓度为105～106CFU/mL致病菌大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 25922、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 51650、李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)CMCC 54002、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica)GIM 1.237涂布于LB固体培养基中，将LB培养基挖孔，使得孔的内径为6nm、外径8nm、高10nm。
将培养好的5株乳酸菌的菌悬液分别放置于8000r/min，4℃条件下离心10min，取上清液，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，置于-80℃备用。将已制备好的200μL无菌上清液分别加入孔中，以等体积的已灭菌的MRS液体培养基为对照，置于4℃下扩散12h，取出放入37℃条件下恒温培养24h后，拍照记录并测量其抑菌圈直径。
结果如图13所示，5株乳酸菌无细胞上清液对4种致病菌均有一定的抑制作用，不同乳酸菌对不同的致病菌的抑制作用不同，其中，BY20表现出对4种致病菌有较强的抑制作用，其次是BY2；BY25对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(SA)有较强的抑制作用，但是对李斯特氏菌(LM)和沙门氏菌(SE)的抑制作用显著低于BY20。
结合实施例1和实施例2中降胆固醇乳酸菌的初步筛选和进一步筛选结果得知，副干酪乳杆菌BY2(Lactobacillus paracasei BY2)具有较好的降胆固醇能力，而且经过模拟胃肠道实验后仍具有较高的降胆固醇能力，并且其具有较好的肠道黏附性和抗菌活性，对维持肠道正常微生物菌群平衡具有一定的作用，并且能够较好黏附在肠道上皮细胞中并发挥益生作用，最后选择副干酪乳杆菌BY2(Lactobacillus paracasei BY2)作为最优降胆固醇乳酸菌。
实施例3：降胆固醇能力最好乳酸菌的鉴定
3.1菌落特征
副干酪乳杆菌BY2在MRS固体培养基上37℃培养48h后，菌落形态如图14A所示：菌株生长良好，菌落为乳白色圆形，菌落直径为0.5～1.0mm，菌落有凸起，边缘整齐。
3.2显微镜下形态
副干酪乳杆菌BY2的革兰氏染色呈阳性，显微镜下细胞形态多为杆状，不生芽孢，且倾向于成链，无鞭毛、不运动(图14B)。
3.3 16s rDNA电泳鉴定
将副干酪乳杆菌BY2进行16s rDNA测序，并于NBCI中进行BLAST比对。副干酪乳杆菌BY2的16s rDNA电泳图如图15所示，基因序列如SEQ ID NO.1所示。
将乳酸菌BY2的序列对比结果和形态观察结果相结合，确定该菌株为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)BY2。该副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)BY2已经于2021年05月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneral Microbiological Culture Collection Center，CMGCC)，保藏号为CGMCCNO.22571。
本发明所提供的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)BY2，经试验证明具有较高的降胆固醇能力。该菌株满足作为益生菌的基本条件，对胃肠环境具有较好的耐受能力，能够保持一定存活率通过模拟胃肠道后仍具有较好的降胆固醇能力，而且拥有较强的肠道黏附性和抗菌活性，对维持肠道正常微生物菌群平衡具有一定的作用，并且能够较好黏附在肠道上皮细胞中并发挥作用，可用于开发成微生物制剂、保健食品或药品，长期服用可以改善肠道微生物菌群结构，降低血清胆固醇水平，减少心血管疾病的发生。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一株降胆固醇副干酪乳杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1487
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 16s rDNA
<400> 1
acgacagtgg ccgggcgtgc ctaatacatg cagtcgaacg agttctcgtt gatgatcggt 60
gcttgcaccg agattcaaca tggaacgagt ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc 120
tgcccttaag tgggggataa catttggaaa cagatgctaa taccgcatag atccaagaac 180
cgcatggttc ttggctgaaa gatggcgtaa gctatcgctt ttggatggac ccgcggcgta 240
ttagctagtt ggtgaggtaa tggctcacca aggcgatgat acgtagccga actgagaggt 300
tgatcggcca cattgggact gagacacggc ccaaactcct acgggaggca gcagtaggga 360
atcttccaca atggacgcaa gtctgatgga gcaacgccgc gtgagtgaag aaggctttcg 420
ggtcgtaaaa ctctgttgtt ggagaagaat ggtcggcaga gtaactgttg tcggcgtgac 480
ggtatccaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg 540
gcaagcgtta tccggattta ttgggcgtaa agcgagcgca ggcggttttt taagtctgat 600
gtgaaagccc tcggcttaac cgaggaagcg catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa 660
gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt 720
ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga cgctgaggct cgaaagcatg ggtagcgaac 780
aggattagat accctggtag tccatgccgt aaacgatgaa tgctaggtgt tggagggttt 840
ccgcccttca gtgccgcagc taacgcatta agcattccgc ctggggagta cgaccgcaag 900
gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 960
gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatctttt gatcacctga gagatcaggt 1020
ttccccttcg ggggcaaaat gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1080
tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttatgact agttgccagc atttagttgg 1140
gcactctagt aagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc 1200
atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga tggtacaacg agttgcgaga 1260
ccgcgaggtc aagctaatct cttaaagcca ttctcagttc ggactgtagg ctgcaactcg 1320
cctacacgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca cgccgcggtg aatacgttcc 1380
cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtttg taacacccga agccggtggc 1440
gtaacccttt tagggagcga gccgtcttaa ggtggaaccc aaatttt 1487

Claims (6)

1.一株降胆固醇副干酪乳杆菌，其特征在于：名称为副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）BY2，保藏号为CGMCC NO. 22571，于2021年05月20日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.一种培养权利要求1所述降胆固醇副干酪乳杆菌的方法，其特征在于，具体步骤为：将降胆固醇副干酪乳杆菌接种于培养基中，于28℃～37℃条件下进行培养。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述的培养基为MRS培养基；
所述的培养的时间为24～48 h。
4.权利要求1所述的降胆固醇副干酪乳杆菌在制备降低血清胆固醇产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的产品为微生物制剂。
6.权利要求1所述的降胆固醇副干酪乳杆菌在制备改善肠道微生物菌群结构和/或抗菌产品中的应用，其特征在于：
所述的抗菌产品为抑制致病菌的生长和/或繁殖的产品；
所述的致病菌为致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌和沙门氏菌中的至少一种；
所述的致病性大肠杆菌为大肠杆菌（Escherichia coli ）ATCC 25922；
所述的金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 51650；
所述的李斯特氏菌为李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）CMCC 54002；
所述的沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica）GIM 1.237。
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