CN111621461A - 一种提高凝结芽孢杆菌bc99活性和耐受性的方法及其应用 - Google Patents

一种提高凝结芽孢杆菌bc99活性和耐受性的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高凝结芽孢杆菌BC99活性和耐受性的方法及其应用，通过将胞外多糖作为凝结芽孢杆菌的生长碳源，有效提高了其生物活性和耐受性。

Description

一种提高凝结芽孢杆菌BC99活性和耐受性的方法及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种提高凝结芽孢杆菌BC99活性和耐受性的方法及其应用。
背景技术
胞外多糖是细菌在生长以及代谢的过程中产生并且分泌到细胞壁的外部的一类化合物，其目的是帮助微生物适应环境。胞外多糖易溶于水，在有机溶剂中溶解度较小，酸性条件下稳定。胞外多糖具有抗氧化、抗突变、抗炎、抗过敏等生理功能，还可提高对肠道表面的非特异性粘附，调节免疫系统提高机体抗肿瘤作用。
凝结芽孢杆菌，可用于治疗肠道菌群失调引起的疾病，在现有技术中多集中于其高密度发酵、干菌粉制备及抗逆性等方面，但是对提高其活性和耐受性的研究还较少。凝结芽孢杆菌BC99虽然抗逆性较强，但有研究表明在酸性条件下其热耐受性下降，生长被抑制，且凝结芽孢杆菌BC99在肠道上皮细胞粘附性较弱，不易在肠道定植。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种提高凝结芽孢杆菌BC99活性和耐受性的方法及其应用，可有效提高凝结芽孢杆菌BC99的活性及其耐受性。
本发明采用的技术方案如下：
本发明提供一种提高凝结芽孢杆菌BC99活性和耐受性的方法，采用胞外多糖作为凝结芽孢杆菌的生长碳源。
上述方案的进一步方案为，所述胞外多糖由长双歧杆菌BL21发酵制备。
上述方案的进一步方案为，所述胞外多糖的浓度为2g/L-10g/L。
上述方案的优选方案为，所述胞外多糖的浓度为4g/L。
另一方面，本发明还提供一种改良MRS培养基，所述改良MRS培养基含有胞外多糖。
上述方案的优选方案为，所述培养基含有胞外多糖的浓度为2g/L-10g/L。
上述方案的优选方案为，所述培养基含有胞外多糖的浓度为4g/L。
再一方面，本发明还提供一种固态菌剂，所述固态菌剂的制备方法如下：利用改良MRS培养基培养凝结芽孢杆菌BC99，培养至培养液OD600值为0.6 后，再培养6h，混匀，通过冷冻干燥工艺将培养液进行冷冻干燥制备固态菌剂，冷冻干燥条件为预冻至-50℃，保持5h，一次干燥温度设置为-30℃，干燥30h，二次干燥设置25℃，干燥20h，即得固态菌剂。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有如下优点和有益效果：
本发明提供的提高凝结芽孢杆菌BC99活性和耐受性的方法及其应用，通过将胞外多糖作为凝结芽孢杆菌的生长碳源，有效提高了其生物活性和耐受性。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书中的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、装置、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其他步骤或单元。
以下实施例中使用的凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)BC99保藏编号为CGMCC No.19487，保藏日期为2020年3月18日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号。
以下实施例中MRS培养基的制备调节如下：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、柠檬酸氢二铵2g、葡萄糖20g、吐温80 1ml、乙酸钠5g、磷酸氢二钾 2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000ml，121℃灭菌20min，调节pH 6.2-6.6。
以下实施例中使用到的材料和方法，如无特别说明，均为本技术领域的常规材料和常规方法。
实施例1
胞外多糖的制备
以下实施例中使用到的胞外多糖的制备方法如下：将长双歧杆菌BL21接种到液体培养基中，设定温度为37℃，培养时间40-48h，得到发酵液，将发酵液加入离心管内，10000r/min转速下于4℃离心15min，除去离心管底部的菌体；取上清液，加入三氯乙酸至其质量分数为总质量的10％，反应12h后，10000r/min 转速下于4℃离心45min除去上清液中的蛋白质；取上清液，加入3倍上清液体积的95％乙醇溶液，于4℃条件下浸提12h，然后再10000r/min转速下4℃离心 45min，弃去上清液，收集沉淀；将沉淀分别用丙酮、乙醚和无水乙醇洗涤一次后离心，得到清洗后的最终沉淀，将最终沉淀用去离子水溶解定容，得到胞外多糖溶液；经冷冻干燥工艺成固体粉末，制得胞外多糖粉末。
实施例2
胞外多糖作为凝结芽孢杆菌BC99生长碳源对菌株活力的促进作用
利用实施例1制备胞外多糖方法制备不同浓度的胞外多糖溶液，将其替代 MRS培养基中的碳源，将已发酵达到OD600值为0.6的凝结芽孢杆菌BC99菌液按照2％(体积比)接种到改良的MRS液体培养基中(胞外多糖浓度为0g/L、 2g/L、4g/L、8g/L、10g/L)，42℃，180-250r/min，培养12h后取样进行稀释、平板涂布，将平板放置于37℃生物培养箱静置培养18-24h后，计算菌落数量。
表1不同浓度胞外多糖对凝结芽孢杆菌BC99活性的影响
Figure RE-GDA0002599095870000041
在胞外多糖浓度为4g/L时，培养时间为8h时，菌落数量最多，与凝结芽孢杆菌BC99经常规液体发酵相比，菌体数量增加15％。
实施例3
不同浓度胞外多糖提高凝结芽孢杆菌低温贮藏下菌株活力的影响
利用实施例1制备胞外多糖方法制备不同浓度的胞外多糖溶液，将其替代 MRS培养基中的碳源，将已发酵达到OD600值为0.6的凝结芽孢杆菌BC99菌液按照2％(体积比)接种到改良的MRS液体培养基中(胞外多糖浓度为0g/L、 2g/L、4g/L、8g/L、10g/L)。在42℃温度下和180-250r/min转速下培养6h后，混匀，静置于4℃条件下进行保藏。每隔3天取样至显微镜下观察活菌数，并计数和计算存活率。
结果显示，在低温贮藏条件下，胞外多糖浓度为4g/L时，凝结芽孢杆菌BC99 的菌体存活率最高，为95.17％；与未添加胞外多糖的实验组相比，凝结芽孢杆菌BC99的菌体存活率提高了20.5％。
实施例4
不同浓度胞外多糖对凝结芽孢杆菌BC99在固态菌剂制备中的作用
利用实施例1制备胞外多糖方法制备不同浓度的胞外多糖溶液，将其替代 MRS培养基中的碳源，将已发酵达到OD600值为0.6的凝结芽孢杆菌BC99菌液按照2％(体积比)接种到改良的MRS液体培养基中(胞外多糖浓度为0g/L、 2g/L、4g/L、8g/L、10g/L)。在42℃温度下和180-250r/min转速下培养6h后，混匀，通过冷冻干燥工艺制备固体菌剂，冷冻干燥条件为预冻至-50℃，保持5h，一次干燥温度设置为-30℃，干燥30h，二次干燥温度设置为25℃，干燥20h。称取制备的固体菌剂1g进行涂布平板测定活菌数，计算存活率。
在胞外多糖浓度为4g/L时，效果最好，凝结芽孢杆菌BC99固体菌剂的存活率为99.1％；与未添加胞外多糖的实验组相比，凝结芽孢杆菌BC99估计菌剂的存活率提高了10.5％。
实施例5
胞外多糖对凝结芽孢杆菌BC99在耐受模拟人工胃液中的作用
模拟人工胃液的制备方法如下：按照质量浓度计算，NaCl 0.5％，胃蛋白酶0.3％，用1M HCl调节pH为2.0，0.22μm微孔滤膜过滤灭菌，4℃保存，备用。
利用实施例1制备胞外多糖的方法制备胞外多糖，将胞外多糖添加至模拟人工胃液中，使模拟人工胃液中胞外多糖的浓度为4g/L，作为实验组；同时加葡萄糖的模拟人工胃液作为对照组，控制葡萄糖浓度为4g/L；将实施例4中制备好的胞外多糖浓度为4g/L的凝结芽孢杆菌BC99固体菌剂加入对照组和实验组模拟人工胃液中，添加比例为1mL模拟人工胃液添加0.1mg凝结芽孢杆菌 BC99固体菌剂。将对照组和实验组在37℃培养4h，从0时开始，每隔1h取样进行稀释、平板涂布，将平板放置于37℃生物培养箱静置培养18-24h后，计算菌落数量和存活率。
存活率＝a/b×100％
a为各个处理时间时的菌落数量；b为处理时间为0h的活菌数。
表2胞外多糖对凝结芽孢杆菌BC99在耐受模拟人工胃液中的作用
Figure RE-GDA0002599095870000051
与添加葡萄糖的对照组相比，加入胞外多糖的实验组效果良好。在处理4h 时，凝结芽孢杆菌BC99存活率高达90.99％；与对照组中相比，凝结芽孢杆菌 BC99的存活率提高了40.99％。
实施例6
胞外多糖对凝结芽孢杆菌BC99在耐受人工肠液中的作用
人工肠液配置方法如下：按照质量浓度计算，NaCl 0.5％，胰蛋白酶0.3％，用NaOH调节pH为9.5，0.22μm微孔滤膜过滤灭菌，4℃保存，备用。
利用实施例1制备胞外多糖的方法制备胞外多糖，将胞外多糖添加至人工肠液中，使人工肠液中胞外多糖的浓度为4g/L，作为实验组；同时加葡萄糖的人工肠液作为对照组，控制葡萄糖浓度为4g/L；将实施例4中制备好的胞外多糖浓度为4g/L的凝结芽孢杆菌BC99固体菌剂加入实验组和对照组人工肠液中，添加比例为1mL人工肠液添加0.1mg凝结芽孢杆菌BC99固体菌剂。将对照组和实验组在37℃培养4h，从0时开始，每隔1h取样进行稀释、平板涂布，将平板放置于37℃生物培养箱静置培养18-24h后，计算菌落数量和存活率。
存活率＝a/b×100％
a为各个处理时间时的菌落数量；b为处理时间为0h的活菌数。
表3胞外多糖对凝结芽孢杆菌BC99在耐受人工肠液中的作用
Figure RE-GDA0002599095870000061
与添加葡萄糖的对照组相比，加入胞外多糖的实验组效果良好。在处理4h 时，凝结芽孢杆菌BC99存活率高达69.9％；与对照组中相比，凝结芽孢杆菌 BC99的存活率提高了24.9％。
实施例7
胞外多糖对凝结芽孢杆菌BC99在耐受模拟胃肠液中的作用
将实施例4中制备好的胞外多糖浓度为4g/L的凝结芽孢杆菌BC99固体菌剂加入含有4g/L胞外多糖的模拟人工胃液中，处理4h，将菌液离心，去上清，再加入等体积的含有4g/L胞外多糖的人工肠液中处理，作为实验组；将实施例 4中制备好的胞外多糖浓度为4g/L的凝结芽孢杆菌BC99固体菌剂加入含葡萄糖浓度为4g/L的人工肠液中，作为对照组；实验组和对照组中，凝结芽孢杆菌 BC99添加比例为1mL人工肠液添加0.1mg凝结芽孢杆菌BC99固体菌剂。将对照组和实验组在37℃培养4h，从0时开始，每隔1h取样进行稀释、平板涂布，将平板放置于37℃生物培养箱静置培养18-24h后，计算菌落数量和存活率。
存活率＝a/b×100％
a为各个处理时间时的菌落数量；b为处理时间为0h的活菌数。
表4胞外多糖对凝结芽孢杆菌BC99在耐受模拟胃肠液中的作用
Figure RE-GDA0002599095870000071
与添加葡萄糖的对照组相比，加入胞外多糖的实验组效果良好。在处理4h 时，凝结芽孢杆菌BC99存活率高达58.8％；与对照组中相比，凝结芽孢杆菌 BC99的存活率提高了27.8％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种提高凝结芽孢杆菌BC99活性和耐受性的方法，其特征在于，采用胞外多糖作为凝结芽孢杆菌的生长碳源。
2.根据权利要求1所述的提高凝结芽孢杆菌BC99活性和耐受性的方法，其特征在于，所述胞外多糖由长双歧杆菌BL21发酵制备。
3.根据权利要求1所述的提高凝结芽孢杆菌BC99活性和耐受性的方法，其特征在于，所述胞外多糖的浓度为2g/L-10g/L。
4.根据权利要求3所述的提高凝结芽孢杆菌BC99活性和耐受性的方法，其特征在于，所述胞外多糖的浓度为4g/L。
5.一种利用权利要求1-3任一所述的方法制备的改良MRS培养基，其特征在于，所述培养基含有胞外多糖。
6.根据权利要求5所述的改良MRS培养基，其特征在于，所述培养基含有胞外多糖的浓度为2g/L-10g/L。
7.根据权利要求6所述的改良MRS培养基，其特征在于，所述培养基含有胞外多糖的浓度为4g/L。
8.一种利用权利要求5-7任一所述的改良MRS培养基制备的固态菌剂，其特征在于，所述固态菌剂的制备方法如下：利用改良MRS培养基培养凝结芽孢杆菌BC99，培养至培养液OD600值为0.6后，再培养6h后混匀，通过冷冻干燥制备固态菌剂，冷冻干燥条件为预冻至-50℃，保持5h，一次干燥温度设置为-30℃，干燥30h，二次干燥设置25℃，干燥20h，即得固态菌剂。
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