CN116004436A - 鼠李糖乳杆菌gs014及其在改善和调节肠道菌群中的应用 - Google Patents
鼠李糖乳杆菌gs014及其在改善和调节肠道菌群中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一株鼠李糖乳杆菌GS014及其在改善和调节肠道菌群中的应用，属于微生物技术领域。鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)GS014，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNO.23646，保藏日期为2021年10月22日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明所述的鼠李糖乳杆菌GS014用于制备抑制肠道中有害菌群产品。本发明的鼠李糖乳杆菌GS014，菌体活性高，耐酸、耐盐，能够有效抑制有害菌的生长，促进有益菌的增值，有效地维持肠道内的微生态菌落环境的平衡，从而实现肠道的正常功能。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株鼠李糖乳杆菌GS014及其在改善和调节肠道菌群中的应用。
背景技术
常言：“病从口入”，大部分病菌都是从嘴里吃进去的，并且细菌进入人体各处主要途径就是肠。不难想象，肠道的健康取决于肠道的活动性。这些病菌就会受到肠内有益菌群的抵抗，不能在短时间内侵入人体其他的循环，很快就随着大小便排出体外，自然不能致使人生病。一旦体内环境发生变化时，特别是长期使用抗生素，肠道内的益生菌群被抑制，未被抑制的有害菌则大量增殖，从而使得肠道内的菌群失衡，有害细菌与食物发酵产生气体会导致腹胀、恶心、呕吐；肠道运动畅，大便很容易积累在肠内，形成宿便，成为各种疾病的根源。
鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus，LGG)多存在于人和动物的肠道内，是厌氧耐酸、不产芽孢的一种革兰氏阳性益生菌。鼠李糖乳杆菌可发酵多种单糖(葡萄糖、阿拉伯糖、麦芽糖等)，大多数菌株能产生少量的可溶性氨，但不产生吲哚和硫化氢，它具有耐酸、耐胆汁盐、耐多种抗生素等生物学特点。LGG在耐胃酸和胆汁方面的性能非常突出，可以活体进入人体肠道，可以定殖在人体内长达两周之久，在人类肠道环境中定殖和繁殖后，依附于肠上皮细胞，能够成为肠道粘膜的一层生物屏障，从而达到提升肠道粘膜屏障能力。而且能对肠道内的微生态系群落结构和功能进行调节，并使之达到平衡状态，进而有效改善和调节人体胃肠道菌群群落，对人体健康非常有益。
发明内容
本发明的目的是提供一株鼠李糖乳杆菌GS014及其在改善和调节肠道菌群中的应用，能够有效地维持肠道内的微生态菌落环境的平衡，从而实现肠道的正常功能。
为了实现上述发明的目的，本发明通过如下技术手段进行实现：
本发明提供了一株鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)GS014，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.23646，保藏日期为2021年10月22日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述的鼠李糖乳杆菌GS014是通过微生物分离纯化技术从健康的牧民肠道获得的。
所述的鼠李糖乳杆菌GS014的16s rDNA序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种包含鼠李糖乳杆菌GS014的冻干粉。
制备包含上述鼠李糖乳杆菌GS014冻干粉的方法，其具体步骤如下：
(1)菌种活化
将鼠李糖乳杆菌GS014保藏菌株接种至已灭菌的固体MRS培养基上，于37℃厌氧恒温培养箱中培养12-36h。
(2)种子培养
将步骤(1)培养好的鼠李糖乳杆菌GS014挑选1-5个单菌落接种至已灭菌的液体MRS培养基中，于37℃静置恒温培养12-24h。
(3)发酵培养
将步骤(2)培养好的种子液按照1％-5％的接种量转接至已灭菌的改良MRS培养基中，于37℃，50-200rpm，厌氧培养12-36h，培养过程中控制发酵液中葡萄糖的浓度≤0.5g/L，通过流加氨水控制发酵液pH值为6.0-7.0，得到高密度的鼠李糖乳杆菌GS014发酵液。
(4)浓缩
发酵结束后，立即将发酵液降温至4-10℃，用20nm的微滤膜进行过滤，当浓缩至原体积的三分之一时，补加等量体积的4-10℃的纯化水。过滤过程观察滤出液为无色。收集菌体，获得鼠李糖乳杆菌GS014浓缩液。
(5)复配
根据步骤(4)浓缩液中鼠李糖乳杆菌GS014的含量，添加适量的冻干保护剂，充分混合均匀，使物料得以乳化。
(6)干燥
将步骤(5)物料均匀的涂布于不锈钢冻干盘中，进行真空冷冻干燥，获得冻干粉。
(7)粉碎、包装
用60-100目的粉碎机进行粉碎；根据产品规格需求进行包装。
优选的，所述的(3)中的改良MRS培养基配方为：酵母浸粉10g/L，酵母蛋白胨5g，葡萄糖10g/L，K2HPO42g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H200.5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二胺2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锰0.05g/L，VB120.005g/L，烟酰胺0.005g/L，生物素0.005g/L，盐酸硫铵0.005g/L，pH 6.5-6.8。
优选的，所述步骤(3)中的改良MRS培养基灭菌条件为：115-118℃，15-25min。
优选的，所述步骤(3)中，厌氧培养为：发酵罐中通入无菌的CO2，控制罐压为0.01-0.03Mpa。
优选的，所述步骤(3)中，控制发酵液葡萄糖浓度是通过间歇流加60％-70％葡萄糖溶液实现的。
优选的，所述步骤(4)中的20nm的微滤膜为：无机陶瓷膜。
优选的，所述步骤(5)中，冻干保护剂为：5％-10％海藻糖、10％-15％低聚木糖、10％-20％聚葡萄糖、5％-10％菊粉、0.5％-1％硅酸钙。
本发明所述的鼠李糖乳杆菌GS014用于制备抑制肠道中有害菌群产品。
优选的，所述有害菌群包括但不限于大肠埃希杆菌、痢疾杆菌、产气荚膜杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、厌氧性球菌或绿脓杆菌。
本发明所述的即食型益生菌粉固体饮料可以作为日常膳食食用。
本发明所述的鼠李糖乳杆菌GS014安全可靠，有望进一步开发用于调理肠道菌群的保健品或药品，应用前景十分可观。
本发明的有益效果为：
(1)本发明所述的鼠李糖乳杆菌GS014从健康的牧民肠道获得，安全性可靠。
(2)本发明所述的鼠李糖乳杆菌GS014的发酵培养，培养条件更加稳定，菌体个体以及各批次之间的差异大大降低，产品质量更有保证。
(3)本发明所述的菌体收集过程，可以大大提高菌体的活性，降低菌体的裂解；可以除去发酵液中的色素、蛋白等杂质，提高产品的质量。
(4)本发明制备的鼠李糖乳杆菌GS014冻干粉，菌体活性高，耐酸、耐盐，能够有效抑制有害菌的生长，促进有益菌的增值，有效地维持肠道内的微生态菌落环境的平衡，从而实现肠道的正常功能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明鼠李糖乳杆菌GS014的平板培养基生长情况图。
图2是本发明鼠李糖乳杆菌GS014的革兰氏染色图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
鼠李糖乳杆菌GS014的筛选
鼠李糖乳杆菌(Trichoderma harzianμm)GS014，已于2021年10月22日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.23646。该鼠李糖乳杆菌的具体筛选方法如下：
采集内蒙古自治区锡林浩特健康牧民的粪便，用无菌水梯度稀释107倍，取样品稀释液涂布于已灭菌的固体MRS培养基上，于37℃厌氧恒温培养48h。根据菌落的形态、大小等特征挑取平板上面的单菌落，再在固体MRS培养基上进行划线，如此反复纯化，得到纯菌落。在无菌操作下，挑取单菌落接种至液体MRS培养基中，于37℃厌氧恒温培养24h，加入已灭菌的甘油，分装至保藏管，-80℃冰箱保藏。
菌落形态鉴定
将鼠李糖乳杆菌GS014在已灭菌的固体MRS培养基上进行划线，于37℃厌氧恒温培养24h，观察GS014的菌落形态，结果如图1所示。
菌株鉴定
将鼠李糖乳杆菌GS014交给上海生工进行测序，鉴定菌株的种属，根据结果被命名为鼠李糖乳杆菌lactobacillus rhamnosus。
实施例2
鼠李糖乳杆菌GS014的高密度发酵
1.菌种活化
将鼠李糖乳杆菌GS014保藏菌株接种至已灭菌的固体MRS培养基上，于37℃厌氧恒温培养箱中培养24h。
2.种子培养
将(1)培养好的鼠李糖乳杆菌GS014挑选2个单菌落接种至已灭菌的液体MRS培养基中，于37℃静置恒温培养24h。
3.发酵培养
将(2)培养好的种子液按照2％的接种量转接至已灭菌的改良MRS培养基中，于37℃，100rpm，厌氧培养24h，培养过程中控制发酵液中葡萄糖的浓度≤0.5g/L，通过流加氨水控制发酵液pH值为6.5±0.1，得到高密度的鼠李糖乳杆菌GS014发酵液。
改良MRS培养基配方为：酵母浸粉10g/L，酵母蛋白胨5g，葡萄糖10g/L，K2HPO42g/L，KH2PO41g/L，MgSO47H2O 0.5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二胺2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锰0.05g/L，VB120.005g/L，烟酰胺0.005g/L，生物素0.005g/L，盐酸硫铵0.005g/L，pH 6.5±0.1。
改良MRS培养基灭菌条件为：115℃，20min。
厌氧培养为：发酵罐中通入无菌的CO2，控制罐压为0.01Mpa。
培养过程中控制发酵液葡萄糖浓度是通过间歇流加65％葡萄糖溶液实现的。
实施例3
鼠李糖乳杆菌GS014即食型益生菌粉固体饮料的制备
1.收集菌体
发酵结束后，立即将发酵液降温至10℃，用20nm的无机陶瓷膜进行过滤，当浓缩至原体积的三分之一时，补加等量体积的纯化水。过滤过程观察滤出液为无色。收集菌体，获得鼠李糖乳杆菌GS014浓缩液。
2.复配
根据浓缩液中鼠李糖乳杆菌GS014的含量，添加适量的冻干保护剂，充分混合均匀，使物料得以乳化。
冻干保护剂为：10％海藻糖、15％低聚木糖、15％聚葡萄糖、5％菊粉、0.5％硅酸钙。
3.干燥
将乳化后的物料均匀涂布于不锈钢冻干盘中，进行真空冷冻干燥，获得冻干粉。
4.粉碎、包装
用80目的粉碎机进行粉碎：根据产品规格需求进行包装。
实施例4
鼠李糖乳杆菌GS014的耐受性实验
1.胃液耐受性实验
人工胃液的制备：取1L的纯化水，用1mol的稀盐酸调节pH值为1.5。加入3g胃蛋白酶，充分溶解，然后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，备用。
取实施例5制备的鼠李糖乳杆菌GS014即食型益生菌粉固体饮料lg加入到上述人工胃液中，充分溶解，37℃恒温震荡消化4h，每隔2h取样，稀释，用固体MRS培养基划线检测活菌数量。
表1-鼠李糖乳杆菌GS014在pH1.5环境下的耐受性
从上表可以看出，鼠李糖乳杆菌GS014在胃液类似的环境中有很高的存活率，充分的表明该菌株具有很强的耐酸性。
2.胆盐耐受性实验
人工胆盐溶液的制备：各取1L的纯化水，加入0g、0.3g、0.5g的猪胆盐，充分溶解，然后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，备用。
人工胃液消化结束后，9000rpm，4℃离心2min，弃上清液，然后将菌体立即加入到上述人工胆盐溶液中，37℃恒温震荡消化4h，每隔2h取样，稀释，用固体MRS培养基划线检测活菌数量。
表2-鼠李糖乳杆菌GS014在胆盐环境下的耐受性
从上表中可以看出，鼠李糖乳杆菌GS014在胆盐溶液中有很好的耐受性，几乎不受盐浓度的影响，存活率极高，因此该菌株具有很强的耐盐性，能够在胃肠道内完全存活。
3.肠液耐受性实验
人工肠液的制备：准确称取13.6g KH2PO4加入1L纯化水充分溶解，用0.5Mm NaOH调节pH值为6.8。然后加入5g胰蛋白酶，充分溶解，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，备用。
取实施例5制备的鼠李糖乳杆菌GS014即食型益生菌粉固体饮料1g加入到上述人工肠液中，充分溶解，37℃恒温震荡消化3h，每隔1h取样，稀释107，用固体MRS培养基划线检测活菌数量。
表3-鼠李糖乳杆菌GS014在pH8.0环境下的耐受性
由上表可以看出，鼠李糖乳杆菌GS014在pH8.0人工肠液中消化3h，活菌数量缓慢降低，但是最终的存活率高达97.19％，说明能够完全适应肠道内环境，利于菌体的生长繁殖。
实施例5
鼠李糖乳杆菌GS014的抑菌性能
指示菌液的制备：在无菌环境下，将指示菌(大肠埃希杆菌、痢疾杆菌、产气荚膜杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、厌氧性球菌、绿脓杆菌、副干酪乳杆菌、乳双歧杆菌、嗜热链球菌、植物乳杆菌)接种至已灭菌的LB培养基中，37℃，静置培养24h。
鼠李糖乳杆菌GS014菌悬液制备：在无菌条件下，称取0.1g鼠李糖乳杆菌GS014即食型益生菌固体饮料加入到50ml无菌水中，充分溶解，即得鼠李糖乳杆菌GS014菌悬液。
双层平皿的制备：取已灭菌的MRS固体培养基均匀平铺于平皿内，静置水平台面，冷却。各取15mL 40-50℃的MRS固体培养基，加入1.5mL的指示菌菌悬液，混匀，倒入平板上，用玻璃棒均匀涂布在平板上，静置水平台面，冷却，作为菌层。在平板上均匀放置4个牛津杯。
抑菌试验：吸取0.2ml的鼠李糖乳杆菌GS014菌悬液滴加至各平板牛津杯中，37℃恒温培养24h，测量指示菌周围抑菌圈的大小。
表4-鼠李糖乳杆菌GS014的抑菌能力
由上表可以看出，鼠李糖乳杆菌GS014对肠道内的大部分有害菌有抑制作用，对其他的有益菌则没有抑制作用。
实施例6
鼠李糖乳杆菌GS014即食型益生菌固体饮料改善和调节肠道菌群的实验
10只正常的小白鼠，平分为两组，一组为实验组，在饲料里面加入适量的鼠李糖乳杆菌GS014即食型益生菌固体饮料，另组为对照组，正常的投喂饲料，连续投喂30d，每隔10d取样检测小鼠肠道内的微生物数量变化情况，选取其中比较有代表性的菌属进行检测。
表5-鼠李糖乳杆菌GS014对小白鼠肠道内菌群的调节作用
由上表可以看出，鼠李糖乳杆菌GS014即食型益生菌固体饮料对肠道内的有益菌数量有明显的提高，对有害菌有一定程度的抑制作用。鼠李糖乳杆菌GS014即食型益生菌固体饮料有改善和调节肠道菌群的作用。
尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。
Claims (10)
1.一株鼠李糖乳杆菌GS014，其特征在于，该鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)GS014，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNO.23646，保藏日期为2021年10月22日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种包含如权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌GS014的冻干粉。
3.一种制备如权利要求2所述的冻干粉的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)菌种活化
将鼠李糖乳杆菌GS014保藏菌株接种至已灭菌的固体MRS培养基上，于37℃厌氧恒温培养箱中培养12-36h；
(2)种子培养
将步骤(1)培养好的鼠李糖乳杆菌GS014挑选1-5个单菌落接种至已灭菌的液体MRS培养基中，于37℃静置恒温培养12-24h；
(3)发酵培养
将步骤(2)培养好的种子液按照1％-5％的接种量转接至已灭菌的改良MRS培养基中，于37℃，50-200rpm，厌氧培养12-36h，培养过程中控制发酵液中葡萄糖的浓度≤0.5g/L，通过流加氨水控制发酵液pH值为6.0-7.0，得到高密度的鼠李糖乳杆菌GS014发酵液；
(4)浓缩
发酵结束后，立即将发酵液降温至4-10℃，用20nm的微滤膜进行过滤，当浓缩至原体积的三分之一时，补加等量体积的4-10℃的纯化水；过滤过程观察滤出液为无色；收集菌体，获得鼠李糖乳杆菌GS014浓缩液；
(5)复配
根据步骤(4)浓缩液中鼠李糖乳杆菌GS014的含量，添加适量的冻干保护剂，充分混合均匀，使物料得以乳化；
(6)干燥
将步骤(5)物料均匀的涂布于不锈钢冻干盘中，进行真空冷冻干燥，获得冻干粉。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中的改良MRS培养基配方为：酵母浸粉10g/L，酵母蛋白胨5g，葡萄糖10g/L，K2HPO42g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H200.5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸二胺2g/L，硫酸亚铁0.05g/L，硫酸锰0.05g/L，VB120.005g/L，烟酰胺0.005g/L，生物素0.005g/L，盐酸硫铵0.005g/L，pH6.5-6.8。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，改良MRS培养基灭菌条件为：115-118℃，15-25min。
6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，厌氧培养为：发酵罐中通入无菌的CO2，控制罐压为0.01-0.03Mpa。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，控制发酵液葡萄糖浓度是通过间歇流加60％-70％葡萄糖溶液实现的。
8.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，冻干保护剂为：5％-10％海藻糖、10％-15％低聚木糖、10％-20％聚葡萄糖、5％-10％菊粉、0.5％-1％硅酸钙。
9.一种如权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌GS014在制备抑制肠道中有害菌群产品中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述有害菌群包括大肠埃希杆菌、痢疾杆菌、产气荚膜杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、厌氧性球菌或绿脓杆菌。
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2022
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