CN116530686A - 鼠李糖乳杆菌gs014后生元组合物及其制备方法和缓解口腔溃疡的应用 - Google Patents

鼠李糖乳杆菌gs014后生元组合物及其制备方法和缓解口腔溃疡的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物及其制备方法和缓解口腔溃疡的应用，属于益生菌的技术领域。包括重量份的以下组分：后生元30‑40份，菊粉10‑40份，木糖醇5‑15份，低聚果糖5‑10份，维生素C 0.1‑0.3份；所述后生元由鼠李糖乳杆菌GS014的菌体及代谢产物组成；所述鼠李糖乳杆菌（lactobacillus rhamnosus）GS014，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.23646，保藏日期为2021年10月22日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明的鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物能够有效的抑制口腔溃疡致病菌金黄色葡萄糖球菌和血链球菌的生长，因此可以用于制备改善口腔菌群的产品如益生菌粉、牙膏、益生菌糖果、漱口水等的日常用品。

Description

鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物及其制备方法和缓解口腔 溃疡的应用
技术领域
本发明属于益生菌的技术领域，具体涉及一种鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物及其制备方法和缓解口腔溃疡的应用。
背景技术
口腔溃疡俗称“口疮”，是一种常见的发生于口腔黏膜的溃疡性损伤病症，常出现在口腔内唇、上颚以及舌颊等部位的黏膜上，呈圆形或精圆形的疼痛溃疡点。据统计，10%-25%的人群患有复发性口腔溃疡，好发年龄在10-30岁。口腔溃疡的发生是多种因素综合作用的结果，有害微生物（金黄色葡萄球菌和血链球菌等细菌）在口腔溃疡的发生、发展中可能起重要作用。口腔内部的菌群失调造成口腔黏膜细胞水肿变性，继而局限性坏死形成一个或多个，或大或小的溃疡面。口腔溃疡的发生可能是多种因素综合作用的结果，其包括口腔菌群失调、局部创伤、精神紧张、食物、药物、营养不良、激素水平改变及维生素或微量元素缺乏。
目前，轻型口腔溃疡一般以局部用药为主，而长期或反复发作的口腔溃疡需要同时进行局部治疗和全身治疗，长期用药会带来副作用，影响口腔内部菌群的平衡。口腔溃疡是一种多发性疾病，目前不能完全根治，所以应注重预防。
口腔微生态作为益生菌应用的新兴领域，越来越多的引发科学界和医学界的研究兴趣。后生元是益生菌经加工处理后的益生菌代谢物成分统称，包括菌体与代谢产物。日本研究证实，后生元的增强免疫能力优于原活菌，即使经由高温作用或肠胃消化液处理，仍保有高度生理活性，对人体具有多种健康助益。因此，在日常生活中如何有效利用后生元预防口腔溃疡的发生，成为现今一大热门问题。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物及其制备方法和缓解口腔溃疡的应用，以解决上述问题。鼠李糖乳杆菌GS014后生元是鼠李糖乳杆菌GS014发酵液经过热处理后产生的生物活性产物，经由高温作用或肠胃消化液处理，仍保有高度生理活性，可以有效抑制致病菌的定植，改变口腔微生态的环境，从而能够预防因口腔内部菌群的失衡导致的口腔溃疡。
本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物，包括重量份的以下组分：后生元30-40份，菊粉10-40份，木糖醇5-15份，低聚果糖5-10份，维生素C 0.1-0.3份。所述后生元由鼠李糖乳杆菌GS014的菌体及代谢产物组成；所述鼠李糖乳杆菌（lactobacillus rhamnosus）GS014，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 23646，保藏日期为2021年10月22日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
优选的，包括重量份的以下组分：后生元35份，菊粉25份，木糖醇10份，低聚果糖7.5份，维生素C 0.2份。
优选的，所述后生元的制备方法如下：
（1）菌种活化
无菌环境下，将保藏的鼠李糖乳杆菌GS014接种至己灭菌的MRS固体培养基上，于37℃厌氧恒温培养箱中培养72h。
（2）种子培养
从步骤（1）培养好的鼠李糖乳杆菌GS014在平板上用接种针挑取单菌落接种至已灭菌的MRS液体培养基中，于37℃静置恒温培养16h，得种子液。
（3）发酵培养
将培养好的种子液接种至已灭菌的改良MRS培养基中，37℃，50rpm，控制发酵罐的压力为0.01Mpa进行培养。培养过程中，根据发酵生长情况，适量间断性的补加60%葡萄糖溶液，自动控制流加氨水或氢氧化钠溶液控制发酵液pH值为6.5±0.5，发酵36h，得到高密度的鼠李糖乳杆菌GS014发酵液。
（4）菌体处理
将发酵液升温至70℃，维持15min，降温至30℃，然后用高压均质机进行破碎，40MPa，循环至菌体完全破碎，然后用反渗透膜进行浓缩至料液体积的三分之一，得到鼠李糖乳杆菌GS014后生元浓缩液；浓缩液经喷雾干燥得到鼠李糖乳杆菌GS014后生元。
优选的，所述步骤（3）中改良MRS培养基包括重量份的以下组分：葡萄糖10份，酵母蛋白胨10份，酵母浸粉5份，牛肉浸粉10份，磷酸二氢钾1.5份，七水硫酸镁1.5份，柠檬酸氢二铵1.5份，硫酸亚铁0.0015份，硫酸锌0.001份，硫酸锰0.001份，烟酰胺0.002份，VB70.002份，VB1 0.001份。
第二方面，本发明提供了一种含鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物的制备方法，具体如下：
（1）混合辅料
将菊粉、木糖醇、低聚果糖和维生素C投入水中，搅拌充分；然后加入鼠李糖乳杆菌GS014后生元，搅拌均匀。
（2）干燥
料液通过巴氏杀菌，调控进风温度，控制粉末的水分；调节雾化器的频率，控制粉末的粒度，经喷雾干燥得到鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物。
优选的，所述鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物水分<5%。
优选的，所述鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物粒度（D90）＜100目。
第三方面，本发明还提供了鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物在缓解和预防口腔溃疡的应用，即可以用于制备改善口腔菌群的产品。
所述的改善口腔菌群的产品为益生菌粉、牙膏、益生菌糖果、漱口水等日常用品。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物，其能够有效的抑制口腔溃疡致病菌金黄色葡萄糖球菌和血链球菌的生长，因此可以用于制备改善口腔菌群的产品如益生菌粉、牙膏、益生菌糖果、漱口水等的日常用品。为预防口腔溃疡的发生提供了一种新的防治思路。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中鼠李糖乳杆菌GS014的平板培养基生长情况图。
图2是本发明实施例2中鼠李糖乳杆菌GS014的革兰氏染色图。
图3是本发明实施例1中鼠李糖乳杆菌GS014的生长曲线图。
图4是本发明实施例6中鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物对人口腔上皮细胞HOEC细胞的黏附实验结果图。
图5是本发明实施例7中鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物对金黄葡萄球菌的抑菌图。
图6是本发明实施例7中鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物对血链球菌的抑菌图。
图中，1-实施例3制备的鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物对金黄葡萄球菌的抑菌圈；2-实施例4制备的鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物对金黄葡萄球菌的抑菌圈；3-实施例5制备的鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物对金黄葡萄球菌的抑菌圈；4-实施例3制备的鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物对血链球菌的抑菌圈；5-实施例4制备的鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物对血链球菌的抑菌圈；6-实施例5制备的鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物对血链球菌的抑菌圈。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
鼠李糖乳杆菌GS014的分离纯化
1、菌株的分离纯化
取1g内蒙古自治区锡林浩特健康牧民粪便，用无菌水梯度稀释107倍，取样品稀释液涂布于已灭菌的固体MRS培养基上，于37℃厌氧培养48h。根据菌落的形态、大小等特征挑取平板上面的单菌落，再在固体MRS培养基上进行划线，如此反复纯化，得到纯菌落。对分离并纯化的菌株进行革兰氏染色和接触酶试验，将革兰氏染色为阳性、接触酶试验为阴性的菌株初步确定为疑似益生菌，保藏备用。
2、鼠李糖乳杆菌GS014的鉴定
（1）菌落/菌体形态的观察
将挑选的疑似益生菌株接种至MRS固体培养基上，37℃静置培养24h，观察菌落的形态特征，结果如图1所示。
菌落形态：白色，边缘整齐，表面湿润，不透明。
对菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察形态，结果如图2所示。
革兰氏染色：杆状，阳性。
（2）菌株的生理和生化特性
依据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰式系统细菌学手册》，对疑似益生菌菌株进行生理生化试验，其生理学特性见下表1.1和1.2。
表1.1-菌株生理学特性
培养温度 37℃ 需氧性 厌氧
接触酶 - 氧化酶 -
表1.2-菌株生化特性
甘油 - 肌醇 - 菊糖 -
赤藓醇 - 甘露醇 - 松三糖 -
D-阿拉伯糖 - 山梨醇 - 棉子糖 +
L-阿拉伯糖 + α-甲基-D-甘露搪甙 - 淀粉 -
D-核糖 + α-甲基-D-葡萄糖甙 - 糖原 -
D-木糖 - N-乙酰-葡糖胺 - 木糖醇 -
L-木糖 - 苦杏仁甙 + 龙胆二糖 +
阿东醇 - 熊果甙 - D-松二糖 -
β-甲-D-木糖甙 - 七叶灵 + D-来苏糖 -
D-半乳糖 - 水杨苷 + D-塔格糖 -
D-葡萄糖 + 纤维二糖 - D-岩藻糖 -
D-果糖 - 麦芽糖 + L-岩藻糖 -
D-甘露糖 - 乳糖 + D-阿拉伯糖醇 -
L-山梨糖 - 蜜二糖 + L-阿拉伯糖醇 -
L-鼠李糖 - 蔗糖 + 葡萄糖酸盐 -
卫茅醇 - 海藻糖 - 2-酮基-葡萄糖酸盐 -
（3）菌株的分子生物学鉴定
将益生菌株交于中国工业微生物菌种保藏管理中心进行测序鉴定，16S rRNA基因序列已在专利《202211236601.3鼠李糖乳杆菌GS014及其在改善和调节肠道菌群中的应用》中记载。
根据菌株的菌落形态、形态学特性、生理生化特性、16S rRNA基因序列、tuf基因序列等实验数据综合分析，参考《伯杰式系统细菌学手册》，该菌株鉴定为鼠李糖乳酪杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌GS014。该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 23646，保藏日期为2021年10月22日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
（3）菌株的生理试验
将鼠李糖乳杆菌GS014菌种接种至无菌的MRS液体培养基中，摇匀，37℃静置恒温培养24h。培养过程中，每隔2h检测发酵液的pH值及菌浓（OD600值）。具体结果详见图3。
实施例2
鼠李糖乳杆菌GS014后生元的制备
（1）菌种活化
无菌环境下，将保藏的鼠李糖乳杆菌GS014接种至己灭菌的MRS固体培养基上，于37℃厌氧恒温培养箱中培养72h。
（2）种子培养
从（1）培养好的鼠李糖乳杆菌GS014在平板上用接种针挑取单菌落接种至已灭菌的MRS液体培养基中，于37℃静置恒温培养16h，得种子液。
（3）发酵培养
将培养好的种子液接种至已灭菌的改良MRS培养基中，37℃，50 rpm，控制发酵罐的压力为0.01Mpa进行培养。所述改良MRS培养基包括重量份的以下组分：葡萄糖10份，酵母蛋白胨10份，酵母浸粉5份，牛肉浸粉10份，磷酸二氢钾1.5份，七水硫酸镁1.5份，柠檬酸氢二铵1.5份，硫酸亚铁0.0015份，硫酸锌0.001份，硫酸锰0.001份，烟酰胺0.002份，VB70.002份，VB1 0.001份。培养过程中，根据发酵生长情况，适量间断性的补加60%葡萄糖溶液，自动控制流加氨水或氢氧化钠溶液控制发酵液pH值为6.5±0.5，发酵36h，得到高密度的鼠李糖乳杆菌GS014发酵液。
（4）菌体处理
将发酵液升温至70℃，维持15min，降温至30℃，然后用高压均质机进行破碎，40MPa，循环至菌体完全破碎，然后用反渗透膜进行浓缩至料液体积的三分之一，得到鼠李糖乳杆菌GS014后生元浓缩液；浓缩液经喷雾干燥得到鼠李糖乳杆菌GS014后生元。
实施例3
鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物的制备
（1）混合辅料
将菊粉25份，木糖醇10份，低聚果糖7.5份和维生素C 0.2份投入水1000份中，搅拌充分；然后加入鼠李糖乳杆菌GS014后生元35份，搅拌均匀。
（2）干燥
料液通过巴氏杀菌，调控进风温度，控制粉末的水分为4.8%；调节雾化器的频率，控制粉末的粒度为80目（D90），经喷雾干燥得到鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物。
实施例4
鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物的制备
（1）混合辅料
将菊粉10份，木糖醇5份，低聚果糖5份和维生素C 0.1份投入水1000份中，搅拌充分；然后加入鼠李糖乳杆菌GS014后生元30份，搅拌均匀。
（2）干燥
料液通过巴氏杀菌，调控进风温度，控制粉末的水分为4.5%；调节雾化器的频率，控制粉末的粒度为90目（D90），经喷雾干燥得到鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物。
实施例5
鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物的制备
（1）混合辅料
将菊粉40份，木糖醇15份，低聚果糖10份和维生素C 0.3份投入水1000份中，搅拌充分；然后加入鼠李糖乳杆菌GS014后生元40份，搅拌均匀。
（2）干燥
料液通过巴氏杀菌，调控进风温度，控制粉末的水分为4.9%；调节雾化器的频率，控制粉末的粒度为80目（D90），经喷雾干燥得到鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物。
实施例6
鼠李糖乳杆菌GS014后生元在人口腔上皮细胞HOEC细胞体外黏附的特性实验
致病菌的制备：
金黄色葡萄球菌按《GB 4789.10-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》进行培养。
血链球菌按《GB 4789.11-2014食品安全国家标准 食品微生物学检验 β型溶血性链球菌检验》进行培养。
两个菌株培养完成后，菌液冷藏保存备用。
人口腔上皮细胞HOEC细胞的培养：将HOEC细胞置于湿热灭活的新生牛血清和双抗的DMEM细胞培养液中，37℃ CO2培养箱中孵育，每天换液一次，1周传代一次。连续培养15-20天后，将细胞接种于6孔细胞培养板内，待细胞长至单层后进行实验。
致病菌和鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物混合液的制备：将实施例3制备的鼠李糖乳杆菌GS014后生元2g溶于20mL无菌PBS溶液中，充分溶解，5000rpm离心2min，用无菌PBS溶液洗菌2次，用20mL PBS溶液重悬，用0.22μm滤器除菌过滤，等量分装。分别取金黄色葡萄糖球菌和血链球菌培养液100μL至上述溶液中。
黏附实验：将6孔板内的细胞培养液吸出，用灭菌的PBS溶液漂洗2遍。每孔加入1mL的致病菌、实施例3制备的鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物混合液和1mL新鲜的DMEM细胞培养液，37℃ CO2培养箱内，孵育2h，然后用灭菌的PBS溶液漂洗细胞5次。漂洗后，甲醇固定，革兰氏染色，在油镜（×1000）计算20个随机视野下100个细胞上黏附的细菌数（黏附指数）。鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物抑制口腔溃疡致病菌在人口腔上皮细胞HOEC黏附的特性实验结果见图4。
从结果可见，口腔上皮细胞HOEC上面附着为杆菌，未见到球菌形状的形态菌株，说明鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物能够有效的抑制口腔溃疡致病菌在人口腔上皮细胞HOEC黏附。
实施例7
鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物对口腔有害菌的抑菌实验
以诱发口腔溃疡的主要有害微生物金黄色葡萄糖球菌、血链球菌为指示菌，检测鼠李糖乳杆菌GS014后生元对致病菌产生的抑菌圈大小，从而判断其抑菌能力。
采用牛津杯法测定鼠李糖乳杆菌GS014后生元对致病菌的抑制作用。
致病菌的制备：金黄色葡萄球菌按《GB 4789.10-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》进行培养，备用。
血链球菌按《GB 4789.11-2014食品安全国家标准 食品微生物学检验 β型溶血性链球菌检验》进行培养，备用。
牛津杯平皿的制备：取1ml金黄色葡萄球菌培养液与已灭菌的40℃-50℃的30mlLB固体培养基混合均匀倒入含有牛津杯的平皿中，待凝固备用；取1ml血链球菌于已灭菌的40-50℃哥伦比亚血琼脂培养基混合均匀含有牛津杯的平皿中，待凝固备用。
鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物混悬液的制备：在无菌环境下，将1g鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物置于10mL水中，充分溶解混匀，做成不同浓度的混悬液。
抑菌试验：在每个牛津杯中滴加200μL的混悬液，37℃静置恒温条件下培养72h，测量抑菌圈的直径。以未接混悬液的平皿作为空白对照。具体结果详见表2。
表2-鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物对口腔溃疡致病菌的的抑菌能力
金黄色葡萄球菌(mm) 血链球菌(mm)
实施例3 16.38±0.23 13.92±0.17
实施例4 17.02±0.58 14.47±0.32
实施例5 16.45±0.37 13.64±0.29
空白 0 0
由表2结果可见，本发明的鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物能够有效的抑制口腔溃疡致病菌金黄色葡萄糖球菌和血链球菌的生长，因此可以用于制备改善口腔菌群的产品如益生菌粉、牙膏、益生菌糖果、漱口水等的日常用品。
尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物，其特征在于，包括重量份的以下组分：后生元30-40份，菊粉10-40份，木糖醇5-15份，低聚果糖5-10份，维生素C 0.1-0.3份；所述后生元由鼠李糖乳杆菌GS014的菌体及代谢产物组成；所述鼠李糖乳杆菌（lactobacillusrhamnosus）GS014，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 23646，保藏日期为2021年10月22日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.如权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物，其特征在于，包括重量份的以下组分：后生元35份，菊粉25份，木糖醇10份，低聚果糖7.5份，维生素C 0.2份。
3.如权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物，其特征在于，所述后生元的制备方法如下：
（1）菌种活化
无菌环境下，将保藏的鼠李糖乳杆菌GS014接种至己灭菌的MRS固体培养基上，于37℃厌氧恒温培养箱中培养72h；
（2）种子培养
从步骤（1）培养好的鼠李糖乳杆菌GS014在平板上用接种针挑取单菌落接种至已灭菌的MRS液体培养基中，于37℃静置恒温培养16h，得种子液；
（3）发酵培养
将培养好的种子液接种至已灭菌的改良MRS培养基中，37℃，50rpm，控制发酵罐的压力为0.01Mpa进行培养；培养过程中，根据发酵生长情况，适量间断性的补加60%葡萄糖溶液，自动控制流加氨水或氢氧化钠溶液控制发酵液pH值为6.5±0.5，发酵36h，得到高密度的鼠李糖乳杆菌GS014发酵液；
（4）菌体处理
将发酵液升温至70℃，维持15min，降温至30℃，然后用高压均质机进行破碎，40MPa，循环至菌体完全破碎，然后用反渗透膜进行浓缩至料液体积的三分之一，得到鼠李糖乳杆菌GS014后生元浓缩液；浓缩液经喷雾干燥得到鼠李糖乳杆菌GS014后生元。
4.如权利要求3所述的鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物，其特征在于，所述步骤（3）中，改良MRS培养基包括重量份的以下组分：葡萄糖10份，酵母蛋白胨10份，酵母浸粉5份，牛肉浸粉10份，磷酸二氢钾1.5份，七水硫酸镁1.5份，柠檬酸氢二铵1.5份，硫酸亚铁0.0015份，硫酸锌0.001份，硫酸锰0.001份，烟酰胺0.002份，VB7 0.002份，VB1 0.001份。
5.一种制备如权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物的方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）混合辅料
将菊粉、木糖醇、低聚果糖和维生素C投入水中，搅拌充分；然后加入鼠李糖乳杆菌GS014后生元，搅拌均匀；
（2）干燥
料液通过巴氏杀菌，调控进风温度，控制粉末的水分；调节雾化器的频率，控制粉末的粒度，经喷雾干燥得到鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物水分<5%。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物粒度＜100目。
8.一种如权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌GS014后生元组合物在制备缓解和预防口腔溃疡产品中的应用。
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