CN116836830A - 产细菌素的植物乳植杆菌及其应用 - Google Patents

产细菌素的植物乳植杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，特别涉及产细菌素的植物乳植杆菌及其应用。本发明提供了一种产细菌素的菌株AUP2203，通过形态学观察和16SrDNA基因序列分析，鉴定为植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)，其保藏编号为CGMCCNo.25920。植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)AUP2203具有抑菌、产细菌素、降亚硝酸盐、耐酸、耐胆盐、抗炎和抗氧化的功能，可用于新型防腐剂的开发与利用。

Description

产细菌素的植物乳植杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及产细菌素的植物乳植杆菌及其应用。
背景技术
随着经济与社会的发展，人民群众对食品安全的要求越来越高，特别是对食品生产过程中使用各种添加剂的安全性尤为关注。食品的腐败变质以及加工过程中食源性致病菌的控制是一个迫切需要解决的问题。苯甲酸及其钠盐、山梨酸及其钾盐、对羟基苯甲酸酯类等化学合成防腐剂，研究发现，这一类防腐剂对人体有一定的毒性作用，长期食用会对健康造成不利影响。因此，研究者把目光投向了天然防腐剂的开发，天然防腐剂较化学合成防腐剂安全性更高，迎合了食品防腐剂的发展趋势和食品加工的需要。
目前，乳酸链球菌细菌素(Nisin)是唯一被FAO/WHO认定为安全的允许应用在食品中的天然防腐剂，广泛应用于肉制品、果蔬制品及乳制品的防腐保鲜。细菌素是细菌在特定的代谢途径中，通过核糖体产生的蛋白质多肽或者蛋白类复合物，细菌素能杀死与产细菌素菌株关系相近的其他细菌，或抑制其生长繁殖，而对产细菌素菌株本身不发生拮抗作用。细菌素进入人体消化道后可以被消化道内各种蛋白酶消化掉，具有作用范围广、无毒性、强抗菌性、无残留等特点。
乳酸菌(lactic acidbacteria，LAB)是FDA认定的食品级安全微生物，在其发酵过程中会产生有机酸、过氧化氢、细菌素等抑菌物质，是目前细菌素的主要产生菌。因此，提供一株新型产细菌素的乳酸菌菌株，在开发新型防腐剂方面具有广大的应用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了产细菌素的植物乳植杆菌及其应用。本发明提供了一株有抑菌作用的AUP2203，其保藏编号为CGMCC No.25920。本发明通过实验发现所述AUP2203具有抑菌、产细菌素、将亚硝酸盐、耐酸、耐胆盐、抗炎和抗氧化的功能。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)AUP2203，其保藏编号为CGMCC No.25920。
在本发明的一些具体实施方案中，所述植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)AUP2203的使用形式包括活菌、灭活菌体、发酵液、外泌体或代谢产物中的一种或多种。
本发明还提供了一种组合物，包括所述植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)AUP2203，以及可接受的辅料和/或助剂。
本发明还提供了所述植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)AUP2203或所述组合物在制备如下任意项的产品中的应用：
(I)、抑菌；和/或
(II)、产细菌素；和/或
(III)、降亚硝酸盐；和/或
(IV)、耐酸；和/或
(V)、耐胆盐；和/或
(VI)、抗氧化；和/或
(VII)、抗炎；
所述产品包括药物，食品或化妆品中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述抑菌：
(I)、排除有机酸抑菌作用效果的影响；
(II)、排除过氧化氢抑菌作用效果的影响。
所述抑菌包括：抑制革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌；
所述革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌和藤黄微球菌中的一种或多种；
所述革兰氏阴性菌包括铜绿假单胞菌、大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌和变形杆菌中的一种或多种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述耐酸的pH值包括2.5。
在本发明的一些具体实施方案中，所述耐胆盐包括耐0.3％牛胆盐。
在本发明的一些具体实施方案中，菌株AUP2203能显著降低发酵液中亚硝酸钠的浓度，降解率为83.9％；在pH 2.5的酸性MRS培养基中，培养2h，存活率为57.96％，具有较好的耐酸能力；AUP2203在含0.3％牛胆盐的生理盐水中培养2h后，存活率达到133.68％，具有较好的耐受胆盐的能力。
在本发明的一些具体实施方案中，所述抗氧化包括清除DPPH自由基。
在本发明的一些具体实施方案中，所述抗炎包括抑制炎症因子的释放。
在本发明的一些具体实施方案中，所述抗炎包括细胞水平和动物水平上具有抗炎效果；所述细胞包括RAW264.7细胞；所述动物包括果蝇。在RAW264.7细胞中，可通过NF-κB信号通道抑制炎症因子的释放，降低NF-κB和/或IκB-α蛋白质磷酸化水平。
所述炎症因子包括IL-6、IL-1β或TNF-α中的一种或多种。
本发明还提供了一种发酵制品，经所述植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)AUP2203或所述组合物发酵制得。
本发明还提供了一种产品，其包括如下任意项，以及可接受的辅料：
(I)、所述植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)AUP2203；和/或
(II)、所述组合物；和/或
(III)、所述发酵制品；
所述产品包括药品，食品，化妆品或食品添加剂中的一种或多种。
实验证明，(1)AUP2203细菌素具有广谱的抑菌活性；
(2)菌株AUP2203能显著降低发酵液中亚硝酸钠的浓度，降解率为83.9％；
(3)AUP2203具有较好的耐酸能力；
(4)AUP2203具有较好的耐受胆盐的能力；
(5)AUP2203具有DPPH自由基清除能力，DPPH自由基清除能力达到45.28±1.99％；
(6)AUP2203能显著抑制IL-6、IL-1β和TNF-α炎症因子的释放。加菌实验组与模型组相比炎症因子含量均有所下降，且菌浓度在108CFU/mL以上抑制炎症因子分泌效果较好。表明AUP2203具有抗炎能力；
(7)AUP2203对大部分青霉素类和头孢类药物敏感，但对氨基糖苷类、大环内酯类和四环素类药物都耐受或者中介，表现出一定的耐药性；
(8)AUP2203无溶血性，符合食品安全的要求；
(9)AUP2203的氨基酸脱羧酶呈阴性，不携带氨基酸脱羧酶基因。
本发明提供的有益效果包括但不限于：
本研究采用双层琼脂扩散法从实验室植物源菌种库1000株乳酸菌中筛选产细菌素乳酸菌，1000株乳酸菌的原始发酵上清液都能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长；排除有机酸的抑菌作用后筛选出25株具有抑菌活性的菌株，同时排除有机酸和过氧化氢的抑菌作用后，AUP2203的发酵液对指示菌仍然有抑菌作用。通过形态学观察和16S rDNA基因序列分析，菌株AUP2203鉴定为植物乳植杆菌。
所述AUP2203具有抑菌、产细菌素、将亚硝酸盐、耐酸、耐胆盐、抗炎和抗氧化的功能。
生物保藏说明
生物材料：AUP2203，分类命名：植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)，于2022年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.25920。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示AUP2203原发酵液对指示菌的抑菌效果，其中，A示大肠杆菌，B示金黄色葡萄球菌；
图2示AUP2203原发酵液调pH 6.0后对指示菌的抑菌效果，其中，A示大肠杆菌，B示金黄色葡萄球菌；
图3示AUP2203原发酵液调pH 6.0并经过氧化氢酶处理后对指示菌的抑菌效果，其中，A示大肠杆菌，B金黄色葡萄球菌；
图4示菌株AUP2203菌落和菌体形态，其中，A示菌株AUP2203在MRS固体培养基上培养的菌落形态，B示菌株AUP2203经革兰氏染色后菌体形态；
图5示菌株AUP2203的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；
图6示菌株AUP2203的系统发育树；
图7(A)示AUP2203对RAW264.7细胞分泌炎症因子IL-6的调节作用；***：P<0.001，有极显著统计学差异；**：P<0.01，有显著统计学差异；*：P<0.05，有统计学差异；
图7(B)示AUP2203对RAW264.7细胞分泌炎症因子IL-1β的调节作用；***：P<0.001，有极显著统计学差异；**：P<0.01，有显著统计学差异；*：P<0.05，有统计学差异；
图7(C)示AUP2203对RAW264.7细胞分泌炎症因子TNF-α的调节作用；***：P<0.001，有极显著统计学差异；**：P<0.01，有显著统计学差异；*：P<0.05，有统计学差异；
图8示植物乳植杆菌AUP2203溶血性观察结果；
图9示16s rDNA基因测序结果；
图10示抗炎模型筛选结果；
图11示抗氧化模型筛选结果。
具体实施方式
本发明公开了产细菌素的植物乳植杆菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明方案中AUP2203与Z1-6为同一菌株，分类命名：植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)，于2022年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.25920。
本发明中的试验采用Excel、IBM SPSS Statistics 26、Origin 2019软件进行数据分析处理。
本研究采用双层琼脂扩散法从实验室植物源菌种库1000株乳酸菌中筛选产细菌素乳酸菌，1000株乳酸菌的原始发酵上清液都能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长；排除有机酸的抑菌作用后筛选出25株具有抑菌活性的菌株，同时排除有机酸和过氧化氢的抑菌作用后，AUP2203的发酵液对指示菌仍然有抑菌作用。通过形态学观察和16S rDNA基因序列分析，菌株AUP2203鉴定为植物乳植杆菌。
菌株AUP220316S rDNA基因序列如SEQ ID No.3和图9所示。
菌株AUP2203具有如下功能：
(1)AUP2203细菌素具有广谱的抑菌活性；
(2)菌株AUP2203能显著降低发酵液中亚硝酸钠的浓度，降解率为83.9％；
(3)AUP2203具有较好的耐酸能力；
(4)AUP2203具有较好的耐受胆盐的能力；
(5)AUP2203具有DPPH自由基清除能力，DPPH自由基清除能力达到45.28±1.99％；
(6)AUP2203能显著抑制IL-6、IL-1β和TNF-α炎症因子的释放。加菌实验组与模型组相比炎症因子含量均有所下降，且菌浓度在108CFU/mL以上抑制炎症因子分泌效果较好。表明AUP2203具有抗炎能力；
(7)AUP2203对大部分青霉素类和头孢类药物敏感，但对氨基糖苷类、大环内酯类和四环素类药物都耐受或者中介，表现出一定的耐药性；
(8)AUP2203无溶血性，符合食品安全的要求；
(9)AUP2203的氨基酸脱羧酶呈阴性，不携带氨基酸脱羧酶基因。
如无特殊说明，本发明提供的产细菌素的植物乳植杆菌及其应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1无细胞发酵上清液的制备
将菌株从菌种库取出，接种在每升含有：酪蛋白酶消化物10.0g，牛肉膏粉10.0g，酵母膏粉4.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，乙酸钠5.0g，七水硫酸镁0.2g，四水硫酸锰0.05g，磷酸氢二钾2.0g，葡萄糖20.0g，吐温-80 1.08g的MRS培养基中，37℃恒温培养24h，传代活化三次，4℃、10000r/min条件下离心15min，去除沉淀，收集上清液经0.22μm滤膜过滤，以除去残留菌体和杂质，制得无细胞发酵上清液(CFS)，将其4℃保存备用。
实施例2产细菌素乳酸菌的筛选
筛选有抑菌性能的乳酸菌
采用改良双层琼脂扩散法，即在无菌培养平皿上倒入15mL已灭菌的2％(v/v)素琼脂，待其充分冷却凝固后放入灭菌后的牛津杯数个，摆放均匀，将指示菌：大肠杆菌(CGMCC9181)和金黄色葡萄球菌(ATCC6538)稀释到最适浓度。将指示菌菌悬液与冷却到50℃左右的营养肉汤培养基混匀，使其指示菌最终浓度为106CFU/mL。将混有指示菌的培养基20mL加入到放有牛津杯的平板上，完全凝固之后用无菌镊子取出牛津杯，在形成的孔洞中加入200μL CFS，置于4℃冰箱扩散4h之后37℃静置培养12h，采用十字交叉法用游标卡尺测量抑菌圈直径，筛选有抑菌性能的乳酸菌。
有机酸抑菌作用效果的排除
中和发酵液中的有机酸，排除有机酸对指示菌的抑制作用，即使用1mol/L的NaOH将CFS的pH调至6.0，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，用琼脂扩散法进行抑菌试验，并设pH 6.0的乳酸作为对照，以排除发酵液中有机酸的抑菌作用。
过氧化氢抑菌作用效果的排除
将发酵液pH值调至6.0之后仍有抑菌效果的CFS用过氧化氢酶处理，使用PBS配制2mg/mL的过氧化氢酶溶液，将酶液与CFS按照1:1的比例混合均匀，37℃水浴2h，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，琼脂扩散法检测处理后发酵液的抑菌活性。
蛋白酶消化试验
将pH 6.0发酵液经过氧化氢酶处理后仍能保持较强抑菌效果的CFS的pH值分别调至胰蛋白酶、蛋白酶K和胃蛋白酶的最适pH(分别为7.4、7.4和2.0)。分别与各蛋白酶液等比例混合，使各酶的终浓度为1.0mg/mL，37℃恒温水浴2h，沸水中5min使各酶活性丧失，再将pH值调为6.0，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为指示菌，采用琼脂扩散法做抑菌试验，以未处理发酵液作对照。
结果与分析
从实验室植物源菌种库1000株菌中筛选产细菌素乳酸菌，采用双层琼脂扩散法发现菌株AUP2203消除有机酸抑菌作用后仍然对大肠杆菌和金黄葡萄球菌有抑菌效果，结果见表1。
表1消除有机酸抑菌作用之后菌株AUP2203对指示菌的抑菌效果
注：表中结果为进行三次平行取平均值±标准差，“-”表示无抑菌作用。
乳酸菌在发酵过程中会产生有机酸、过氧化氢、细菌素等物质，从而能抑制其他菌株的生长。据报道，有机酸通过中和其电化学电位并增加其渗透性作用于细胞质膜，从而产生抑菌作用并最终导致易感细菌死亡。由表1可知，对照组pH 6.0的乳酸溶液对指示菌的生长没有抑制作用，菌株AUP2203发酵液调pH 6.0后的CFS对指示菌的生长仍具有抑菌作用，表明在该菌株的CFS中除了具有抑菌作用的有机酸外，还存在其它抑菌物质。AUP2203的CFS调pH 6.0后对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌直径均超过17mm，AUP2203的CFS调pH 6.0后再经过氧化氢酶处理后仍然对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长具有较强的抑制作用(图3)，说明AUP2203的CFS中除了具有抑菌作用的有机酸和过氧化氢外，还存在其它抑菌物质。因此选取AUP2203进行后续试验。
AUP2203的CFS调pH 6.0并经氧化氢酶处理后，再分别经胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K处理，对金黄色葡萄球菌的抑菌直径见表2：
表2蛋白酶处理对发酵液抑菌作用的影响
由表2可知，AUP2203的CFS调pH 6.0和经过氧化氢酶处理后，再经胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K处理后，CFS抑菌活性部分丧失，初步认为AUP2203的CFS中的抑菌物质为蛋白类物质，即细菌素。
实施例3产细菌素菌株的鉴定
形态特征观察
将筛选到的菌株接种到MRS培养基，37℃恒温培养24h，并进行革兰氏染色。观察记录菌落和菌体形态。
16S rDNA基因序列分析
用细菌基因组DNA提取试剂盒(默克公司)对乳酸菌的基因组DNA进行提取，以其为模板进行PCR扩增16S rDNA基因序列，上游引物如SEQ IDNo.1所示，具体为5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇，下游引物如SEQ ID No.2所示，具体为5＇-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3＇。PCR扩增产物用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(Axygen)回收，并送至上海派森诺有限公司进行测序。将所测16S rDNA基因序列(如SEQ ID No.3所示)再提交到NCBI数据库，用BLAST工具进行序列的同源性分析，并通过MEGA6软件构建系统发育树。
结果与分析
AUP2203菌株在MRS固体培养基上培养的菌落形态如图4A所示，菌体经革兰氏染色后菌体形态如图4B所示。由图4A可知：AUP2203菌落中等大小，凸起，乳白色，边缘整齐，菌落呈圆形。由图4B可知：AUP2203革兰氏染色呈阳性，单个或成链排列，杆状，无芽孢。
菌株AUP2203的16S rDNA基因序列经PCR扩增后，PCR扩增产物凝胶电泳结果如图5，将其基因序列与GeneBank中数据进行比对分析，运用MEGA6软件建立系统发育树(见图6)。由图5可知，PCR扩增产物条带清晰明亮，16S rDNA基因序列长度为1500bp左右。将测序结果提交到GenBank与标准菌株比较，结果显示菌株AUP2203的16S rDNA基因序列长度为1466bp，与大多数已公布的植物乳植杆菌的同源性为99％以上，结合形态学特征与16SrDNA基因序列分析可知：菌株AUP2203为植物乳植杆菌。
实施例4细菌素粗提物抑菌谱的测定
实验方法
分别以大肠杆菌(CMCC9181)、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、单增李斯特菌(ATCC19115)、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌(CMCC(B)63301)、藤黄微球菌(CMCC(B)28001)、铜绿假单胞菌(ATCC15442)、沙门氏菌、志贺氏菌(CMCC(B)51105)、变形杆菌(CMCC(B)49027)为指示菌，采用双层琼脂扩散法检测细菌素的抑菌谱。
结果与讨论
将食品中常见的金黄色葡萄球菌等10种致病菌为指示菌，检测AUP2203细菌素的抑菌性能，结果见表3：
表3AUP2203细菌素对各种指示菌的抑菌活性
注：“++”，10mm<抑菌直经<15mm；“+++”，15mm<抑菌直径<20mm。
由表3可知，植物乳植杆菌AUP2203对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌和大肠杆菌的抑菌直径均大于15mm；对枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、藤黄微球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、志贺氏菌、变形杆菌等指示菌的抑菌直径都大于10mm，说明AUP2203细菌素具有广谱的抑菌活性。
实施例5AUP2203降亚硝酸盐功能研究
将菌种AUP2203接种到MRS液体培养基中传代活化3次，活化后的菌种按1％接种量接种到含亚硝酸盐(250mg/L)的液体培养基中，37℃培养72h，每隔24h测定其亚硝酸盐含量，菌株AUP2203能显著降低发酵液中亚硝酸钠的浓度，降解率为83.9％。
实施例6AUP2203耐酸耐胆盐能力研究
AUP2203耐酸性研究
菌株活化至稳定，以1％的接种量接入浓硫酸调节至pH 2.5的酸性MRS培养基中，分别在0h和2h进行稀释涂布，待长出后进行平板计数，按公式计算存活率(％)＝(2h活菌数/0h活菌数)×100，并按照国标GB 4789.2-2016方法分别进行活菌数计算。
AUP2203耐胆盐能力研究
菌株37℃培养12h后，离心去上清液，加入事先配制好的含0.3％牛胆盐的生理盐水制成菌悬液，在0h和2h分别进行稀释涂布，48h后平板计数，按方公式计算存活率(％)＝(2h活菌数/0h活菌数)×100，并按照国标GB4789.2-2016方法分别进行活菌数计算。
结果与讨论
AUP2203在pH 2.5的酸性MRS培养基中，分别培养0h和2h见表4。
表4AUP2203对pH 2.5MRS培养基耐受能力
从表4可以看出，AUP2203具有较好的耐酸性，在pH 2.5的酸性MRS培养基中，培养2h，存活率为57.96％，说明AUP2203具有较好的耐酸能力。
AUP2203在含0.3％牛胆盐的生理盐水分别培养0h和2h后平板计数计算存活率，结果见表5所示。
表5AUP2203对0.3％牛胆盐溶液耐受能力
从表5可以看出，AUP2203在含0.3％牛胆盐的生理盐水中培养2h后，存活率达到133.68％，说明AUP2203具有较好的耐受胆盐的能力。
实施例7AUP2203的DPPH自由基清除能力研究
制备菌悬液，采用比浊法调节浓度至1×108CFU/mL。配制0.2mmol/LDPPH-无水乙醇溶液，并进行无菌过滤。在避光环境中，按样品+DPPH(Aa)、样品+无水乙醇(Ab)、纯水+DPPH(Ac)分组加入48孔板中。避光反应40min后，收集液体，离心后取上清液，于517nm处测吸光度(表6)。DPPH自由基清除率如下公式计算，得出DPPH自由基清除能力达到45.28±1.99％。
表6517nm处吸光度
实施例8AUP2203抗炎细胞模型的建立
细胞培养：RAW264.7细胞以10％胎牛血清(FBS)+RPMI1640培养基在37℃5％CO2的条件中培养。消化时去培养基，加2mL PBS润洗后弃去，随后加入1mL胰酶，消化60s后吸去加入适量培养基，将细胞从壁面吹下制成悬液，移取悬液至新的容器中。注意事项：①待细胞稳定长满细胞瓶后，接入适宜孔板长至90％(6孔板一般18h，24孔板12h，48孔板8h，96孔板6h)，长太满药物可能无法进入；②小鼠巨噬细胞密度较小时易分化长触角此时测炎症因子数据不准确，故接孔时密度不宜过小；③由于胎牛血清含有许多化合物，如LPS和生长因子，它们影响巨噬细胞的生物学特性，接孔后需饥饿处理1～2h排除血清干扰，且试验中所配试剂皆应使用无血清；④培养基中禁添加抗生素以免对试验造成干扰；⑤为得充足上清液，一般不用96孔板进行试验；试验过程保持绝对无菌。
菌悬液制备：乳酸菌活化至第三代，于最大生长期时接入15mL离心管中离心(8000r/min10 min)去上清，用生理盐水清洗至无上清液残留。先加少许1640培养基(以色列BI公司)重悬菌泥，随后用分光光度计或血球计数板调节菌悬液至所需密度。
分组情况：设立空白组(only cell)、模型对照组(cell+LPS)、试验对照组1(cell+菌悬液1×1010CFU/mL(浓度1))、试验对照组2(cell+菌悬液1.0×108CFU/mL(浓度2))、试验对照组3(cell+菌悬液1.0×106CFU/mL(浓度3))、试验组1(cell+LPS+菌悬液1×1010CFU/mL(浓度1))、试验组2(cell+LPS+菌悬液1.0×108CFU/mL(浓度2))、试验组3(cell+LPS+菌悬液1.0×106CFU/mL(浓度3))；每组平行3次。
试验过程：细胞培养稳定后，将RAW 264.7细胞(1.0×105细胞/mL)接种在24孔板中，并用选择的含有或者不含脂多糖(2.5ng/mL)的菌悬液处理。在5％CO2加湿培养箱中于37℃孵育16小时后，收集上清液。上清液中促炎细胞因子白细胞介素IL-6、白细胞介素IL-1β、肿瘤坏死因子TNF-α的定量根据制造商的说明使用商业采购的ELISA试剂盒(厦门仑昌硕生物科技有限公司ED-20188、ED-20174、Mercodia，瑞典)进行测定。
结果如图7(A)、7(B)、7(C)所示：结果显示AUP2203能显著抑制IL-6、IL-1β和TNF-α炎症因子的释放。加菌实验组与模型组相比炎症因子含量均有所下降，且菌浓度在108CFU/mL以上抑制炎症因子分泌效果较好。表明AUP2203具有抗炎能力。
实施例9AUP2203抗炎/抗氧化果蝇模型的建立
试验准备：口服葡聚糖硫酸钠可通过破坏肠道内共生菌的分隔，直接损伤结肠上皮细胞，诱发炎症反应；在果蝇食用的蔗糖溶液中添加DSS使果蝇肠道受损。百草枯(PQ)毒性是通过产生自由基而起破坏作用的，所以用其建立抗氧化模型。用无菌水配置5％的蔗糖溶液备用，将适量DSS/PQ溶于5％蔗糖溶液中制成5％DSS蔗糖溶液或5％PQ蔗糖溶液。乳酸菌活化后挑单克隆在37℃培养箱静止培养13h后，离心取沉淀溶于5％蔗糖中，25℃培养黑腹果蝇，取用同批次5～7天大的雌果蝇进行实验。(死菌菌悬液制备方法：用无菌水配置5％的蔗糖溶液备用，将适量DSS/PQ溶于5％蔗糖溶液中制成5％DSS蔗糖溶液/5％PQ蔗糖溶液。乳酸菌活化后挑单菌落在37℃培养箱静止培养13h后，离心取沉淀溶于5％蔗糖中，菌悬液浓度为OD600nm＝1.0，将制备好的菌悬液在100℃下煮沸20min。活菌菌悬液制备方法：用无菌水配置5％的蔗糖溶液备用，将适量DSS溶于5％蔗糖溶液中制成5％DSS蔗糖溶液。乳酸菌活化后挑单菌落在37℃培养箱静止培养13h后，离心取沉淀溶于5％蔗糖中，菌悬液浓度为OD600nm＝1。)
试验步骤：第一次筛选将适龄雌果蝇每40只/管，设两个样品对照，观察样本间的稳定性。第二次筛选基于之前实验的稳定性各只有一管对照。该实验为期10天，前三天进行样品处理，对照组每24h只喂食400μL的5％蔗糖溶液，通过浸润在滤纸片上供果蝇取食，各15组实验组喂食相应的5％蔗糖菌悬液；每天记录果蝇的生存状况；第四天开始对照组每24h喂食400μL的5％DSS蔗糖溶液或5％PQ蔗糖溶液，实验组喂食浓度为5％DSS/PQ的5％蔗糖菌悬液溶液，喂食7天，每天计数果蝇的生存状况，本试验中所有菌悬液的浓度均为OD600nm＝1.0。
抗炎模型筛选结果分析：聚糖硫酸钠(DSS)是一种人工合成的硫酸盐多糖，是一种常见的用来诱导小鼠结肠癌模型的致炎剂。口服葡聚糖硫酸钠可通过破坏肠道内共生菌的分隔，直接损伤结肠上皮细胞，诱发炎症反应，葡聚糖硫酸钠模型已被广泛用于研究结肠炎的免疫机制。通过在果蝇食用的蔗糖溶液中添加DSS使果蝇肠道受损，不同分组食用不同菌液，与未食用菌液组进行对照，每日观察果蝇存活情况，第一次筛选时主要为确定乳酸菌适宜浓度，故结果并未展示，通过第一次筛选，认为，乳酸菌浓度在OD600nm＝1.0时对果蝇生存率基本无影响，并能保持一定功效。第二次筛选结果如图10所示。从图中可看出，经过9天后活的或者灭活AUP2203在一定程度上都有延长果蝇寿命的能力。
抗氧化模型筛选结果分析：各种有毒物质，如百草枯能够触发果蝇的氧化应激。百草枯(paraquat，PQ)，化学名称为1-1-二甲基-4-4-联吡啶二氯化物，是过去几十年农业中应用最为广泛的除草剂之一。故意或意外摄入PQ会造成多器官功能损伤，对生命产生非常严重的威胁，死亡率高达60％～70％。研究表明，PQ进入人体后可通过各种途径产生大量的活性氧(ROS)。过量的ROS会导致氧化应激，严重者会造成多脏器功能障碍。目前认为百草枯毒性是通过产生自由基而起破坏作用的。通过产生自由基，间接使体内巯基化合物、含量减少，影响机体的抗氧化作用，诱导脂质过氧化反应，直接损害主要细胞成分，并使毛细血管内皮损害，最终导致一系列病理变化。从图11可看出，从第四天开始，活或者灭活的AUP2203能有效延长果蝇寿命。
实施例10乳酸菌AUP2203安全性评价
乳酸菌AUP2203药敏性试验
采用纸片扩散法，菌株活化三代离心洗去上清液后，用生理盐水重悬。用分光光度计调节至密度为1×108CFU/mL左右(OD600nm＝0.5±0.05)，吸取1mL菌悬液于培养皿后，倒入15mL固体培养基(50℃)混匀，待培养基凝固后取药敏纸片贴于琼脂表面，每个培养皿贴3张间隔均匀适中的药物纸片，微需氧条件下37℃恒温培养。48h后测量并记录抑菌圈的直径，并根据药片说明书标准(表7)进行药物敏感性判定。
表7微生物药物敏感试验执行标准
实验结果如表8所示：
表8AUP2203对抗生素的耐药性
注：R：耐药；I：中介；S：敏感
结果分析：AUP2203对大部分青霉素类和头孢类药物敏感，但对氨基糖苷类、大环内酯类和四环素类药物都耐受或者中介，表现出一定的耐药性。
乳酸菌AUP2203溶血性试验
取血琼脂培养基，采用点种法，中心以金黄色葡萄球菌为对照，外围取试验乳酸菌点种3次。37℃培养48h，观察试验菌与对照菌溶血情况。
结果与分析：
一些菌株在血平板上培养时，菌落周围会形成明显的透明溶血环，根据使绵羊血细胞琼脂溶血的能力分类为：完全溶血(β溶血)、部分溶血(α溶血)和不溶血(γ溶血)，α-溶血的链球菌呈现半透明草绿色溶血环，β-溶血的链球菌呈现透明溶血环，大多数溶血性菌株是致病性的。供试菌株的溶血性试验结果见图8，可看出平板中心的指示菌(金黄色葡萄球菌)产生了明显的溶血环，而周围的三个供试菌株的菌落无溶血环，故菌株AUP2203无溶血性。一般认为乳酸菌属是安全的共生菌，缺乏溶血素，不会产生机会性毒力，符合食品安全的要求。
乳酸菌AUP2203氨基酸脱羧酶活性试验
试剂盒法：菌株活化三代，培养18h后，取0.05mL菌液添加至不同试剂瓶中，并加0.5mL灭菌液体石蜡封层。37℃培养18～24h后根据说明书观察变色情况。试剂盒为(赖/酪/组/精)氨酸脱羧酶与氨基酸脱羧酶对照试剂盒(广东环凯微生物科技有限公司)。
结果与分析：
食品中的生物胺大部分由微生物脱羧氨基酸形成，它的产生需要3个条件：足够的氨基酸、有氨基酸脱羧酶活性的微生物和利于微生物生长的低酸环境，常见产生物胺菌株有乳酸杆菌属、肠杆菌属、肠球菌属和乳杆菌属。适量的生物胺有利于人体的正常生理活动，一旦过量则会对人体产生不利影响，故产生物胺能力也是选择发酵乳酸菌和益生菌的标准之一。由于对人体健康威胁较大的组胺、酪胺、腐胺和尸胺的前体物质分别为组氨酸、酪氨酸、精氨酸与赖氨酸，因此本试验对供试菌株这四种氨基酸脱羧酶活性进行检测。结果如表9所示，AUP2203的氨基酸脱羧酶呈阴性，不携带氨基酸脱羧酶基因。
表9AUP2203氨基酸脱羧酶活性结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)AUP2203，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.25920。
2.如权利要求1所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)AUP2203，其特征在于，其使用形式包括活菌、灭活菌体、发酵液、外泌体或代谢产物中的一种或多种。
3.组合物，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)AUP2203，以及可接受的辅料和/或助剂。
4.如权利要求1或2所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)AUP2203或如权利要求3所述的组合物在制备如下任意项的产品中的应用：
(I)、抑菌；和/或
(II)、产细菌素；和/或
(III)、降亚硝酸盐；和/或
(IV)、耐酸；和/或
(V)、耐胆盐；和/或
(VI)、抗氧化；和/或
(VII)、抗炎；
所述产品包括药物，食品或化妆品中的一种或多种。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抑菌：
(I)、排除有机酸抑菌作用效果的影响；
(II)、排除过氧化氢抑菌作用效果的影响。
6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，
所述耐酸的pH值包括2.5；
所述耐胆盐包括耐0.3％牛胆盐。
7.如权利要求4至6任一项所述的应用，其特征在于，所述抗氧化包括清除DPPH自由基。
8.如权利要求4至7任一项所述的应用，其特征在于，所述抗炎包括抑制炎症因子的释放。
9.发酵制品，其特征在于，经如权利要求1或2所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)AUP2203或如权利要求3所述的组合物发酵制得。
10.产品，其特征在于，包括如下任意项，以及可接受的辅料：
(I)、如权利要求1或2所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)AUP2203；和/或
(II)、如权利要求3所述的组合物；和/或
(III)、如权利要求9所述的发酵制品；
所述产品包括药品，食品，化妆品或食品添加剂中的一种或多种。
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