CN117586927B - 改善骨折后排便困难的鼠李糖乳杆菌jylr-127及其菌剂、应用 - Google Patents

改善骨折后排便困难的鼠李糖乳杆菌jylr-127及其菌剂、应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种改善骨折后排便困难的鼠李糖乳杆菌JYLR‑127及其菌剂、应用。鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）JYLR‑127于2022年1月19日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24340。经试验验证，鼠李糖乳杆菌JYLR‑127菌剂对于骨折患者术后恢复期排便困难症状具有显著的缓解和改善作用，也有利于抑制感染和炎症反应，并一定程度上缓解骨折术后的出血倾向，调节肠道菌群、维持肠道稳态，为骨折术后排便困难患者的治疗提供了一种新的安全有效的思路和方法。

Description

改善骨折后排便困难的鼠李糖乳杆菌JYLR-127及其菌剂、 应用
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种改善骨折后排便困难的鼠李糖乳杆菌JYLR-127及其菌剂、应用。
背景技术
在骨科临床疾病中，骨折是常见的一种疾病，它是指患者受到间接或直接的暴力因而导致的骨的完整性或连接性被破坏。骨折患者由于疾病受到的应激反应、需要长期卧床等因素都会进一步导致患者出现一些并发症，排便困难是这些并发症中最常见的一种，其发生率极高，达到了90.47%。排便困难是骨折患者较长时间卧床休息、活动能力受到较大限制，导致胃肠蠕动减慢、胃肠功能失常引起的，在严重的情况下，可能伴有肛门疼痛、腹痛、腹胀、头晕、乏力、呕吐等症状，不仅仅会导致患者身体出现以上不适，还会使原有疾病恶化，从而降低患者生活质量。
临床上通常建议通过腹部按摩、腰背肌锻炼以及适当的药物治疗来改善骨折后的排便困难，促进恢复正常的肠道动力。对于排便困难严重者，多采用西药泻剂或考虑灌肠处理。西药泻剂包括容积性泻剂、渗透性泻剂等，但泻剂对于排便困难的患者适用性较为局限，且容易产生药物依赖性，长期服用会出现诸如腹泻、腹胀、维生素吸收障碍等各种类型的副作用，严重影响骨折患者的身体恢复。
发明内容
针对现有治疗骨折后排便困难的产品副作用较大、影响患者身体恢复的技术问题，本发明提供一种改善骨折后排便困难的鼠李糖乳杆菌JYLR-127及其应用。
第一方面，本发明提供一种改善骨折后排便困难的鼠李糖乳杆菌JYLR-127，鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）JYLR-127于2022年1月19日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.24340。
第二方面，本发明提供一种鼠李糖乳杆菌JYLR-127菌剂，包括上述鼠李糖乳杆菌JYLR-127的菌粉和辅料，鼠李糖乳杆菌JYLR-127菌剂的菌体数量为7.5×109~1.5×1010cfu/g。
进一步的，辅料为麦芽糊精。
进一步的，鼠李糖乳杆菌JYLR-127的菌粉的制备方法包括以下步骤：
（1）制备MRS液体培养基和MRS平板培养基；
（2）取保存的鼠李糖乳杆菌JYLR-127在MRS平板培养基上活化，将活化后的菌株按照质量百分比1%接种于MRS液体培养基中，培养获得菌液；
（3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于质量浓度为15%的复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度，获得菌悬液；将菌悬液冷冻干燥后，获得鼠李糖乳杆菌JYLR-127菌粉。
进一步的，步骤（1）中，MRS液体培养基的制备方法如下：称取蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g和蒸馏水1000mL，将上述原料混合后，调pH为6.8，搅拌菌液后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min。
进一步的，步骤（2）中，培养温度为37℃，培养时间为24h。
进一步的，步骤（3）中，调整悬浊液的浓度为1.0×1010~2.0×1010cfu/mL。
第三方面，本发明还提供一种上述鼠李糖乳杆菌JYLR-127在制备改善骨折后排便困难产品方面的应用。
进一步的，改善骨折后排便困难产品为抑制感染和炎症反应并缓解术后出血的产品。
进一步的，改善骨折后排便困难产品为维持肠道稳态和调节肠道菌群的产品。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的鼠李糖乳杆菌JYLR-127及其菌剂，经试验验证，对于骨折患者术后恢复期排便困难症状具有显著的缓解和改善作用，也有利于抑制感染和炎症反应，并一定程度上缓解骨折术后的出血倾向。鼠李糖乳杆菌JYLR-127可在一定程度上丰富骨折术后排便困难患者的肠道菌群组成和层次结构，增加厚壁菌门的丰度、减少拟杆菌门的丰度，通过增加有益菌属的相对丰度和减少致病菌属的相对丰度，特别是另枝菌属和普雷沃氏菌属的减少，帮助患者重建更健康的肠道菌群。而且该菌株属于食品级益生菌，安全性高，为骨折术后排便困难患者的治疗提供了一种新的安全有效的思路和方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例5的实验设计流程图。
图2是本发明实施例5中鼠李糖乳杆菌JYLR-127对骨折术后排便困难患者粪便与血液指标的影响结果图。
图3是本发明实施例5中鼠李糖乳杆菌JYLR-127对骨折术后排便困难患者的肠道菌群多样性的影响结果图。
图4是本发明实施例5中鼠李糖乳杆菌JYLR-127在门水平上对肠道菌群的影响结果图。
图5是本发明实施例5中鼠李糖乳杆菌JYLR-127在属水平上对肠道菌群的影响结果图。
图6是本发明实施例5中鼠李糖乳杆菌JYLR-127介导的肠道菌群改善与骨折术后感染与排便困难的相关性分析结果图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1 菌种的分离与鉴定
1、菌株筛选及纯化
（1）菌株来源：2021年11月采集重庆市合川区泡菜，置于无菌试管内，冷链运输回实验室备用。
（2）制备样品：
①取灭菌后的生理盐水（0.85%）至于无菌三角瓶中，然后将步骤（1）的泡菜1g加入其中，振荡，待用；
②对步骤①的溶液稀释制成不同浓度梯度的样品，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，标号分别为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#，待用。
（3）制备含0.5%CaCO3的MRS平板培养基：
蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、CaCO35g、琼脂15g、蒸馏水1000mL；将上述原料混合后，调pH为6.8，搅拌菌液后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，将灭菌后的培养基倒入平皿中，放凉后待用。
（4）培养菌株：将1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#号溶液分别使用涂布器涂布在MRS平板培养基中，于37℃、厌氧条件下培养48h；
（5）按照以下菌落特征挑选菌落：
直径1~2mm，菌落圆润、边缘整齐、微白色中间有凸起，溶钙圈较大。
（6）分离纯化
根据步骤（5）的菌落特征挑取单菌落，采用划线法接种至MRS平板培养基上，于37℃、厌氧条件下培养48h，挑取单菌落，置于甘油管中-70℃保藏。
2、鉴定
将分离纯化后得到的菌株JYLR-127送去鉴定，鉴定单位：生工生物工程（上海）股份有限公司，鉴定过程中，使用的引物如下：
引物序列：
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；
1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；
得到菌株JYLR-127的基因序列为：
ACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAAATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGTGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTTAGGGAGCGAGCCGTCTAAGGTGGGACAAATGATTAGGGTGAAGTCGTAA。
该菌株被鉴定为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus），其分类单元为：Bacteria；Firmicutes；Bacilli；Lactobacillales；Lactobacillaceae；Lactobacillus，因此命名为鼠李糖乳杆菌JYLR-127。
将鼠李糖乳杆菌JYLR-127送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，保藏信息如下；
菌株名称：鼠李糖乳杆菌JYLR-127，分类命名：鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus，保藏日期：2022年1月19日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏编号：CGMCC No.24340。
实施例2 制备鼠李糖乳杆菌JYLR-127菌剂
（1）制备MRS液体培养基
称取蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL，将上述原料混合后，调pH为6.8，搅拌菌液后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min，即可；
（2）取保存的鼠李糖乳杆菌JYLR-127在MRS平板培养基上活化，将活化后的菌株按照质量百分比1%接种于MRS液体培养基中，然后在37℃条件下培养24h，获得菌液；
（3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于质量浓度为15%的复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度为1.0×1010cfu/mL，获得菌悬液；将菌悬液冷冻干燥后，获得鼠李糖乳杆菌JYLR-127菌粉；
（4）将鼠李糖乳杆菌JYLR-127菌粉与麦芽糊精（购自保龄宝生物股份有限公司）混合，制成鼠李糖乳杆菌JYLR-127菌剂。
在本实施例中，制得的鼠李糖乳杆菌JYLR-127菌剂中菌体数量为7.5×109cfu/g。
实施例3 制备鼠李糖乳杆菌JYLR-127菌剂
与实施例2的不同之处在于，步骤（3）中，调整悬浊液的浓度为1.5×1010cfu/mL；最终制得的鼠李糖乳杆菌JYLR-127菌剂中菌体数量为1×1010cfu/g。
实施例4 制备鼠李糖乳杆菌JYLR-127菌剂
与实施例2的不同之处在于，步骤（3）中，调整悬浊液的浓度为2×1010cfu/mL；最终制得的鼠李糖乳杆菌JYLR-127菌剂中菌体数量为1.5×1010cfu/g。
实施例5 鼠李糖乳杆菌JYLR-127对骨折后排便困难的影响
1.材料与方法
1.1 研究对象
选择南昌大学第二附属医院收治的骨折后排便困难的患者，入组标准：①实验开始时，实验对象介于18~70岁之间；②确诊为骨折且排便困难的患者；③符合ROME IV便秘诊断标准；④同意在研究期间服用受试产品；⑤同意签署同意书。
排除标准：（1）受试期间服用过抗生素或抗真菌类药物（如需必要，则三小时后服用实验菌剂）；（2）受试前14天服用过益生菌制剂（菌片、菌粉、胶囊等）；（3）受试前30天服用过一些药物辅助排便；（4）腹部和/或肠道手术，阑尾切除术、胆囊切除术、痔疮的非手术治疗除外；（5）肠梗阻性疾病患者；（6）按ROME IV便秘诊断标准，诊断为IBS或功能性腹痛综合征；（7）研究人员不确定受试者是否愿意或者能够完成实验计划；（8）实验中安慰剂组；（9）受试者在研究中间参加其它的研究项目。
1.2 试验分组
采取随机、对照、非盲研究方法，分组方法具体如下：
临床诊断为骨折且排便困难患者60例，随机分成2组，包括益生菌治疗组（TRE组），30例；安慰剂组（CDN组），30例。
所有受试者均自愿参加本研究，均详细询问病史及全面体检。
1.3 试验药物
采用实施例2制备的鼠李糖乳杆菌JYLR-127菌剂（7.5×109cfu/g），分装为2g/袋。
1.4 研究步骤及相关检查
治疗之前，所有研究对象均行下列检查：
（1）血常规：血常规检查，判断细菌感染情况；
（2）粪便常规：留取新鲜的自然排出的粪便3~5g，必要时可肛拭子采集，放入干燥、情节、无吸水性的有盖容器内贴好标签送检，主要指标包括：胰弹性蛋白酶，葡萄糖醛酸酶，分泌性免疫球蛋白SigA；
（3）输血七项：输血七项检查，以确认无特殊疾病感染，如艾滋梅毒等；
（4）肠道菌群分析：采用16S rRNA高通量测序。
1.5 给药方法
TRE组：口服实施例2制备的鼠李糖乳杆菌JYLR-127菌剂，每天2次，每次1袋（2g/袋，1.5×1010cfu/袋），口服或冲饮（温水不得超过40℃），7天为一疗程，给药一个疗程。
CDN组：口服安慰剂（仅含麦芽糊精），每天2次，每次1袋（2g/袋），口服或冲饮（温水不得超过40摄氏度），7天为一疗程，给药一个疗程。
1.6 给药后随访
1.6.1 随访时间
第一次近期疗效随访：用药后7天。
第二次远期疗效随访：用药后14天。
1.6.2 随访内容
短期效果主要观察服药2周的有效率。有效定义为排便顺利，无明显未排空感，并且大便无硬结，平均每周排便次数≥3次；无效定义为大便硬结、排便不畅或便后有未排空感，或者每周排便次数＜3次。记录排便难易、大便性状、排便次数。患者退出或失访时记录服药时间，时间以天为单位。
1.6.3 每次随访检查：
（1）大便常规：留取新鲜的自然排出的粪便3~5g，必要时可肛拭子采集，放入干燥、情节、无吸水性的有盖容器内贴好标签送检。
（2）粪便菌群培养：以无菌棉签从患者粪便标本中取材送至实验室进行培养检查。
（3）所有研究对象均行肠道菌群分析（高通量测序）。
（4）血常规及其他：主要包括C反应蛋白浓度、白细胞、红细胞、血小板等指标。
2. 数据统计及结果分析讨论
采用SPSS 20.0统计软件对基本特征资料、症状改善、粪便测序结果等数据进行处理分析，其中计数资料采用卡方检验进行处理。若检验结果P<0.05，说明两组患者治疗效果之间存在差异，且差异具有统计学意义。
2.1 受试者基本特征
本研究共纳入60名符合预期的骨折术后排便困难患者，实验设计如图1所示，在使用药物干预前，随机选取30名受试者的粪便和血液样本作为干预前对照组（FAC组）。出于研究对象人数适当且意愿强烈、研究周期较短且流程可控等原因，本研究未出现失访病例，最终得到FAC、TRE及CDN组均为N=30。三组患者的年龄、体质指数等基线特征显示无统计学差异（见表1），性别和骨折分型（根据骨折部位）的比例也近似，说明样本数据基本呈正态分布，组间具有可比性。
表1 受试者的基本特征
注：统计数据以平均数±标准差（SD）表示。
2.2 粪便与血液指标
干预前的FAC组、干预后的TRE和CDN组的粪便和血液指标的统计结果如表2和图2所示。在排便层面，我们分别记录了三组患者的排便情况、粪便性状（Bristol评分）以及便秘症状（PAC-SYM评分）的平均情况和组间差异。正如预期，单因素方差分析结果表明上述指标在三组间均存在显著差异。与干预前的FAC组和安慰剂对照的CDN组相比，鼠李糖乳杆菌JYLR-127给药的TRE组排便频率显著提升（FAC vs CDN vs TRE =2.23±0.63 vs 2.03±0.67 vs 3.00±1.39，P<0.001），提示肠道蠕动功能的好转；Bristol量表评分更加接近中间值3.50（FAC vs CDN vs TRE=3.06±0.93 vs 3.11±0.84 vs 3.60±0.89，P<0.05，图2A），象征粪便性状的正常化。同时，TRE组PAC-SYM评分中的直肠症状、腹部症状以及粪便症状得分均有所降低（图2B），尤其是腹部症状的改善较之其他两组具有统计学差异（FAC vsCDN vs TRE=1.13±0.94 vs 1.17±0.95 vs 0.40±0.56，P<0.001），这些都预示着鼠李糖乳杆菌JYLR-127干预对于骨折患者术后恢复期排便困难症状的缓解和改善作用。
此外，我们通过测量三组间血常规以及血生化指标的变化情况来评估鼠李糖乳杆菌JYLR-127在降低骨折术后排便困难患者炎症反应中的潜在作用。C反应蛋白浓度、红细胞和白细胞计数在三组内未观察到显著性差异，尤其是后两者的水平几乎是持平的，仅有TRE与CDN组的C反应蛋白浓度存在统计学差异（FAC vs CDN vs TRE=17.91±29.61 vs 31.39±33.45 vs 16.85±13.86，P(TRE vs CDN)=0.04，图2C）。令人惊讶的是，三组数据在血小板计数上的差异具有统计学意义（FAC vs CDN vs TRE=188.50±70.22 vs 214.97±73.81vs 256.17±134.16，P=0.029），具体表现为TRE组血液PLT水平显著高于FAC和CDN组（图2D）。综上，我们可以推测骨折术后排便困难患者补充鼠李糖乳杆菌JYLR-127也有利于抑制感染和炎症反应，并一定程度上缓解骨折患者术后的出血倾向。
表2 各组粪便与血液指标的差异
注：统计数据以平均数±标准差(SD)表示；*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。
2.3 鼠李糖乳杆菌JYLR-127对肠道菌群多样性的影响
通过对FAC、TRE和CDN组患者的粪便样本进行16S rRNA测序可以进一步得到鼠李糖乳杆菌JYLR-127干预对骨折术后排便困难患者肠道菌群宏观及微观影响的多层次信息。β多样性又称为生境间多样性，反应的是三组样本间物种组成的相异性。采用PCoA模型进行降维处理以简化分析，得到TRE组的菌群组成较之干预前的FAC组和安慰剂对照的CDN组更加离散（图3A）。此外，在所有样本中共鉴定出3774个ASV，TRE组出现的ASV占比28.01%（1057/3774），多于FAC组的（739/3774）和CDN组的（884/3774）的ASV，突出了不同的干预可以塑造特定的菌群结构（图3B）。此外，我们也通过LEfSe分析以进一步探讨FAC、TRE和CDN组为骨折术后排便困难患者的肠道微生态整体特征以及给予鼠李糖乳杆菌JYLR-127后优势菌群的变化情况。图3C中，FAC组Prevotelaceae、Butyricimonas、Prevotella、Alistipes和Roseburia显著富集，经过鼠李糖乳杆菌JYLR-127处理的TRE组，优势菌种变化明显。综上，鼠李糖乳杆菌JYLR-127可在一定程度上丰富骨折术后排便困难患者的肠道菌群组成和层次结构，这对于维持肠道稳态和改善排便困难具有积极意义。
2.4 鼠李糖乳杆菌JYLR-127对肠道菌群在门水平上的影响
进一步地，我们描述并可视化了FAC、TRE和CDN三组的肠道菌群在门水平上的菌落组成和组间差异。在图4A中，拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度在三组中所占比例最大。与FAC组和CDN组相比，TRE组拟杆菌门数量减少（图4B）和厚壁菌门数量增加（图4C）较为明显，且厚壁菌门的减少与FAC组之间的差距具有统计学意义（P<0.05），而变形菌门和拟杆菌门的相对比例仅仅略有改变（图4D-E）。因此，鼠李糖乳杆菌JYLR-127对肠道菌群的调节在门水平上主要是通过增加厚壁菌门、减少拟杆菌门的丰度来实现的。
2.5 鼠李糖乳杆菌JYLR-127对肠道菌群在属水平上的影响
在属水平上，由图5A我们可以观察到三组以拟杆菌属（Bacteroides）、副拟杆菌属（Parabacteroides）、另枝菌属（Alistipes）和普雷沃氏菌属（Prevotella）占优势，TRE组肠道菌群种类分布更丰富、更均匀。与FAC组和CDN组相比，TRE组致病菌另枝菌属和条件致病菌普雷沃氏菌属的相对丰度均减少（图5B-C）。与FAC组相比，普雷沃氏菌属的减少有统计学意义（P<0.01），另枝菌属的差异也接近P值阈值（P=0.064）。此外，虽无统计学差异，我们也看到了TRE组中多种益生菌丰度的上升趋势，如粪杆菌属（Faecalibacterium）和粪球菌属（Coprococcus）等（图5D-E）。总的来说，鼠李糖乳杆菌JYLR-127能够通过增加有益菌属的相对丰度和减少致病菌属的相对丰度，特别是另枝菌属和普雷沃氏菌属的减少，为骨折术后排便困难患者重建更健康的肠道菌群。
2.6 鼠李糖乳杆菌JYLR-127对肠道菌群改善与骨折术后感染和便秘的相关性
为了明确鼠李糖乳杆菌JYLR-127给药在骨折术后排便困难患者肠道菌群改变和症状改善之间的关系，我们进行了Pearson相关性分析加以验证。如图6B、C和E、F，患者肠道菌群中拟杆菌门的丰度与PAC-SYM得分以及血常规C反应蛋白水平呈正相关，且这种相关是具有统计学意义的（r=0.46，P=0.011；r=0.60，P=0.0005）；而厚壁菌门的丰度恰与之相反（r=-0.3，P=0.031；r=-0.11，P=0.57）。以上结果提示了服用鼠李糖乳杆菌JYLR-127后患者肠道菌群中拟杆菌门的降低和厚壁菌门的上调与排便困难以及感染症状的改善之间的相关性。但图6A、D的结果显示鼠李糖乳杆菌JYLR-127给药后肠道中乳杆菌属的丰度变化与拟杆菌门、厚壁菌门之间并不具有显著相关性，鼠李糖乳杆菌JYLR-127的疗效可能是通过调节患者的整体肠道微生态实现的。
尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种改善骨折后排便困难的鼠李糖乳杆菌JYLR-127，其特征在于，鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）JYLR-127于2022年1月19日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.24340。
2.一种鼠李糖乳杆菌JYLR-127菌剂，其特征在于，包括如权利要求1所述鼠李糖乳杆菌JYLR-127的菌粉和辅料，鼠李糖乳杆菌JYLR-127菌剂的菌体数量为7.5×109~1.5×1010cfu/g。
3.如权利要求2所述的鼠李糖乳杆菌JYLR-127菌剂，其特征在于，辅料为麦芽糊精。
4.如权利要求2所述的鼠李糖乳杆菌JYLR-127菌剂，其特征在于，鼠李糖乳杆菌JYLR-127的菌粉的制备方法包括以下步骤：
（1）制备MRS液体培养基和MRS平板培养基；
（2）取保存的鼠李糖乳杆菌JYLR-127在MRS平板培养基上活化，将活化后的菌株按照质量百分比1%接种于MRS液体培养基中，培养获得菌液；
（3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于质量浓度为15%的复原脱脂乳中，获得悬浊液；调整悬浊液的浓度，获得菌悬液；将菌悬液冷冻干燥后，获得鼠李糖乳杆菌JYLR-127菌粉。
5.如权利要求4所述的鼠李糖乳杆菌JYLR-127菌剂，其特征在于，步骤（1）中，MRS液体培养基的制备方法如下：称取蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g和蒸馏水1000mL，将上述原料混合后，调pH为6.8，搅拌菌液后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min。
6.如权利要求4所述的鼠李糖乳杆菌JYLR-127菌剂，其特征在于，步骤（2）中，培养温度为37℃，培养时间为24h。
7.如权利要求4所述的鼠李糖乳杆菌JYLR-127菌剂，其特征在于，步骤（3）中，调整悬浊液的浓度为1.0×1010~2.0×1010cfu/mL。
8.一种如权利要求1所述鼠李糖乳杆菌JYLR-127在制备改善骨折后排便困难药物方面的应用，改善骨折后排便困难药物为抑制感染和炎症反应并缓解术后出血的药物。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，改善骨折后排便困难药物为维持肠道稳态和调节肠道菌群的药物。
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