CN113969253B - 一株具有便秘治疗效果的乳双歧杆菌jybr-390及其应用和产品 - Google Patents

一株具有便秘治疗效果的乳双歧杆菌jybr-390及其应用和产品 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株具有便秘治疗效果的乳双歧杆菌JYBR‑390及其应用和产品，所述乳双歧杆菌JYBR‑390已于2019年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.18093，分类命名为乳双歧杆菌Bifidobacterium lactis；所述乳双歧杆菌JYBR‑390用于制备治疗便秘的产品。本发明通过明确便秘作用机理，利用乳双歧杆菌JYBR‑390具有较强的肠道定植能力和抑制病原菌能力的特点，制备治疗便秘的产品，产品通便效果明显。

Description

一株具有便秘治疗效果的乳双歧杆菌JYBR-390及其应用和 产品
技术领域
本发明涉及益生菌技术领域，具体涉及一株具有便秘治疗效果的乳双歧杆菌JYBR-390及其应用和产品。
背景技术
便秘是指排便次数减少，同时排便困难、粪便干结的病症，便秘的病因通常与不良的生活习惯、肠道疾病、心理疾患等有关。目前，便秘的治疗手段主要包括肠道促动力药物治疗、通便药物治疗、中医中药治疗和饮食运动治疗等。
肠道促动力药物治疗：目前临床主要的肠道促动力药为5-HT4受体激动剂，其可刺激肠神经丛神经元，引起肠道蠕动、肠液分泌，缩短肠道传输时间，减少粪便内水分的回收，达到治疗目的。促动力药物对缓解便秘患者症状有明显的疗效，但也会导致可耐受的腹泻、头痛、恶心、呕吐等不良反应，严重时可能诱发心律失常、心肌缺血、急性肾血管坏死等问题。
通便药物治疗：通便药物治疗主要是通过减少大便在肠道内停滞的时间与增加肠道的蠕动解决便秘问题，常见通便药物包括容积性泻剂、渗透性泻剂、二糖与多糖类泻剂、大便软化剂、刺激性泻剂等，这些药物可通过增加肠道内的水分、改变肠道黏膜的局部吸收与分泌、改变肠道菌群与刺激肠黏膜的活动来达到排便的效果。但是通便药物除了增加排便的频率外，也会导致肠道局部微环境的改变而引发腹胀症状。刺激性泻剂，如大黄、酚酞和番泻叶等，虽然疗效显著，但会导致泻剂性肠病、结肠黑变病及电解质紊乱等。因此，通便药物治疗通常只能治标不治本。
中医中药治疗：主要手段有针灸或服用麻仁丸、润肠五仁方等中草药，针灸疗效甚微，中药成分比较复杂，不适合长期服用，对身体有一定的副作用。
饮食运动治疗：改善饮食习惯、增加膳食纤维的摄取量是常见的便秘治疗方法。保持积极的心态，并且进行适当的体育锻炼，养成定期排便的良好习惯对于缓解便秘问题也具有一定效果。然而，通过改善饮食和生活方式与缓解慢性便秘间无明确的定论，不能实现单方面痊愈。
基于此，有必要提供一种新的便秘治疗手段。
发明内容
针对肠道促动力药物治疗和通便药物治疗不良反应多、中医中药治疗疗效甚微或不适合长期服用以及饮食运动治疗问题不能实现单方面痊愈的技术问题，本发明提供一株具有便秘治疗效果的乳双歧杆菌JYBR-390及其应用和产品，本发明通过明确便秘作用机理，利用乳双歧杆菌JYBR-390具有较强的肠道定植能力和抑制病原菌能力的特点，制备治疗便秘的产品，产品通便效果明显。
第一方面，本发明提供一株具有便秘治疗效果的乳双歧杆菌JYBR-390，所述乳双歧杆菌JYBR-390已于2019年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.18093，分类命名为乳双歧杆菌Bifidobacterium lactis。
第二方面，本发明提供一种乳双歧杆菌JYBR-390在制备治疗便秘的产品上的应用。
进一步的，所述治疗便秘的产品为抑制肠道内病原菌生长的产品，所述病原菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌中的至少一种。
进一步的，所述治疗便秘的产品为提高肠道动力的产品，所述产品主要通过调节胃肠肽实现肠道动力的提高，所述胃肠肽包括兴奋性递质和/或抑制性递质，其中兴奋性递质可以为P物质（substance P，SP）、内皮素（endothelin，ET）、胃动素（motilin，MTL）、胃泌素（gastrin，GAS）中的至少一种，抑制性递质可以为血管活性肠肽（vasoactiveintestinal peptide，VIP）、生长抑素（somatostatin，SS）中的至少一种。
进一步的，所述治疗便秘的产品为提高粪便含水量的产品。
第三方面，本发明提供一种产品，所述产品中含有乳双歧杆菌JYBR-390。
进一步的，所述产品的制备方法包括如下步骤：
（1）将乳双歧杆菌JYBR-390在MRS平板培养基上活化，活化后接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下，厌氧培养48h，获得菌液；
（2）将菌液离心后收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15wt%的复原脱脂乳中，获得悬浊液；
（3）调整悬浊液的浓度为1.0-2.0×1010cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；
（4）将菌粉与低聚异麦芽糖混合，制成治疗便秘的产品。
进一步的，所述产品中乳双歧杆菌JYBR-390数量为1亿cfu/g、10亿cfu/g、100亿cfu/g或150亿cfu/g。
本发明的有益效果在于，
本发明提供的乳双歧杆菌JYBR-390及其产品可用于解决人类的便秘问题，避免使用药物手段治疗造成的负面影响，无副作用。乳双歧杆菌JYBR-390有较强的肠道定植和抑制肠道病原菌的能力，能够通过改善粪便含水量等作用促进排便，改善便秘，小鼠和临床实验验证了乳双歧杆菌JYBR-390的通便效果。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明具体实施方式中所使用的MRS平板培养基的原料为：蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温-80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、琼脂15g、蒸馏水1000mL；制备方法为：将上述原料混合，自然pH，搅拌后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min。
所使用的MRS液体培养基的原料为：蛋白胨10g、牛肉粉5g、三水醋酸钠5g、七水磷酸氢二钾2g、吐温80 1mL、四水硫酸锰0.05g、柠檬酸三铵2g、葡萄糖20g、七水硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL；制备方法为：将上述原料混合后，调pH为6.8，在121℃、0.1MPa下灭菌20min。
所使用的LB液体培养基的原料为：LB培养基粉25g、蒸馏水1000mL；制备方法为：将上述原料混合后，在121℃、0.1MPa下灭菌15min。
所使用的LB琼脂培养基的原料为：LB培养基粉25g、琼脂10g、蒸馏水1000mL；制备方法为：将上述原料混合后，在121℃、0.1MPa下灭菌15min。
所使用的PBS缓冲液的制备方法为：称取磷酸二氢钾0.27g、磷酸氢二钠1.42g、氯化钠8g和氯化钾0.2g，加入约800mL去离子水充分搅拌溶解，加浓盐酸调节溶液pH值至7.4，然后用去离子水定容至1L，于121℃灭菌20min。
所使用的DMEM完全培养液的组分为：78%DMEM培养液、20%胎牛血清、1%链霉素(100μg/mL)、1%青霉素（100U/mL）。
所使用的墨汁的制备方法为：取10g阿拉伯胶，加少量水煮沸，后加入活性碳粉5g中煮沸三次，放置室温后定容到100mL，4℃保存，用前摇匀。
实施例1 菌种的分离鉴定
一、菌株筛选及纯化
（1）取样：2014年8月，取新疆伊犁州牧民家里自然发酵的酸奶1mL，备用；
（2）制备样品：①取灭菌后的生理盐水（0.85%）置于无菌三角瓶中，然后将步骤（1）的样品加入其中，振荡，待用；
②对步骤①的溶液稀释制成不同浓度梯度的样品，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，标号分别为1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#，待用；
（3）培养：将1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#号溶液分别使用涂布器涂布在MRS平板培养基中，于37℃、厌氧条件下培养48h；
（4）挑选菌落：按照直径1-2mm，在培养基上菌落光滑凸圆，边缘完整，乳白色，有光泽，质地柔软的菌落特征挑选菌落；
（5）分离纯化：采用划线法将挑取的单菌落接种至MRS平板培养基上，于37℃、厌氧条件下培养48h，挑取单菌落，置于甘油管中-70℃保藏。
二、鉴定
对步骤（5）分离纯化后的单菌落进行鉴定，鉴定单位：生工生物工程（上海）股份有限公司，鉴定过程所使用的引物如下：
27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；
1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。
测得序列如SEQ ID NO.3所示，鉴定结果为Bifidobacterium（双歧杆菌属），Bifidobacterium animalis（动物双歧杆菌），Bifidobacterium animalis subsp. lactis（动物双歧杆菌乳亚种）。其分类单元为：Bacteria；Actinobacteria；Bifidobacteriales；Bifidobacteriaceae；Bifidobacterium。
实施例2 治疗便秘的产品的制备
（1）将保藏的乳双歧杆菌JYBR-390在MRS平板培养基上活化，活化后按1%的接种量接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下，厌氧培养48h，获得菌液；
（2）将菌液离心后收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15wt%的复原脱脂乳中，获得悬浊液；
（3）调整悬浊液的浓度为1.0×1010cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；
（4）将菌粉与低聚异麦芽糖混合，分别制成菌体数量为1亿、10亿、100亿、150亿cfu/g的菌剂。
在其他实施例中，制备治疗便秘的产品时，步骤（3）可将悬浊液调整为1.5×1010或2.0×1010cfu/mL等浓度，以获得菌悬液。
实施例3 乳双歧杆菌JYBR-390抑菌能力实验
便秘引起粪便在肠道中的积留，会造成机体肠道微生态的改变，表现在具有潜在致病的需氧菌或兼性厌氧菌显著增多，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌致病菌数量上升；而有益菌显著减少。因此，对JYBR-390对3种常见病原菌（大肠杆菌CICC10899、沙门氏菌WX29、枯草芽孢杆菌CICC10012，均购于中国工业微生物菌种保藏中心）的抑菌能力进行观察。
实验步骤为：（1）将乳双歧杆菌JYBR-390菌液以1%的接种量分别接种于10mL装有MRS液体培养基的EP管中，37℃培养箱恒温厌氧培养48h，l000r/min离心10min，收集上清液；
其中，乳双歧杆菌JYBR-390菌液的制备方法为：
将乳双歧杆菌JYBR-390在MRS平板培养基上活化，37℃培养箱恒温厌氧培养48h，挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃培养箱恒温厌氧培养48h。
（2）分别以大肠杆菌CICC10899、沙门氏菌WX29、枯草芽孢杆菌CICC10012为菌株筛选的指示菌，将指示菌菌液以1%的接种量接种于50mL的LB液体培养基中，37℃培养箱恒温培养24h；
其中，指示菌菌液的制备方法为：
将大肠杆菌CICC10899、沙门氏菌WX29、枯草芽孢杆菌CICC10012分别接种于LB液体培养基中，37℃培养箱恒温培养24h。
（3）将10mL灭菌的LB琼脂培养基倾注于直径90mm的培养皿中，保持水平待其凝固作为底层，加入1mL指示菌菌液，倾入20mL冷却至45℃的LB琼脂培养基，轻摇混匀后水平放置使其凝固。
其中，10mL的LB琼脂培养基不做培养菌体用，其作用为：①使皿底均匀，减小实验误差；②做缓冲层，防止菌液扩散过快或过慢以至扩散不均；③胶粘作用，防止菌液渗漏影响抑菌效果。抑菌实验实际菌层为20mL的LB琼脂培养基。
（4）用直径10mm的无菌打孔器在菌层打孔后，用无菌镊子将孔中央菌层夹出，使其形成直径10mm的圆形孔洞，向孔洞内加入步骤（1）上清液150μL，以MRS液体培养基为空白对照，37℃厌氧培养24h后观察有无抑菌圈形成，并测量其抑菌直径。
结果如下表1所示，乳双歧杆菌JYBR-390抑菌圈的直径能反应出其对大肠杆菌，沙门氏菌和枯草芽孢杆菌这3种常见病原菌的抑制能力，证明乳双歧杆菌JYBR-390乳酸菌能够定植在肠道中，产生多种抑菌物质，阻碍肠道内病原菌的生长，恢复肠道微生态，促进排便。
表1 乳双歧杆菌JYBR-390对3种病原菌的抑菌能力
组别 空白对照 大肠杆菌 CICC10899 沙门氏菌 WX29 枯草芽孢杆菌 CICC10012
抑菌圈直径（mm） 0 25 30 32
实施例4 抑菌有效成分分析
一、乳酸对抑菌能力的影响
用乳酸调节与实施例3步骤（1）上清液相同pH值的MRS液体培养基，作为乳酸排除组，以实施例3步骤（1）上清液作为对照组，分别加入接有指示菌的培养基孔内，测定抑菌活性，取3次平行抑菌圈直径的平均值。
结果如下表2所示，乳酸排除组的抑菌水平明显低于对照组，说明乳双歧杆菌发酵上清液中，除乳酸外还存在其他的代谢产物对大肠杆菌，沙门氏菌和枯草芽孢杆菌具有抑制作用。
表2 乳酸排除组与对照组的抑菌圈直径对比（mm）
组别 大肠杆菌 CICC10899 沙门氏菌 WX29 枯草芽孢杆菌 CICC10012
乳酸排除组 10 12 13
对照组 23 26 28
二、过氧化氢对抑菌能力的影响
以1mg/mL过氧化氢酶（pH值为7）处理实施例3步骤（1）上清液，37℃水浴1h后将上清液调至原pH值，作为过氧化氢排除组，并以实施例3步骤（1）上清液作为对照组，分别加入接有指示菌的培养基孔内，测定抑菌活性，取3次平行抑菌圈直径的平均值。
结果如下表3所示，过氧化氢排除组的抑菌水平与对照组抑菌差异不明显，可见过氧化氢并不是主要抑菌物质。
表3 过氧化氢排除组与对照组的抑菌圈直径对比（mm）
组别 大肠杆菌 CICC10899 沙门氏菌 WX29 枯草芽孢杆菌 CICC10012
过氧化氢排除组 22 23 17
对照组 23 26 28
三、pH值对抑菌能力的影响
用氢氧化钠溶液调节实施例3步骤（1）上清液pH值为6.0，作为pH调节组，以实施例3步骤（1）上清液作为对照组，分别加入接有指示菌的培养基孔内，测定抑菌活性，取3次平行抑菌圈直径的平均值。
结果如下表4所示，pH调节组的抑菌水平显著低于对照组抑菌水平，可见在较高pH值水平下，不利于乳酸菌代谢产物发挥抑菌作用。
表4 pH调节组与对照组的抑菌圈直径对比（mm）
组别 大肠杆菌 CICC10899 沙门氏菌 WX29 枯草芽孢杆菌 CICC10012
pH调节组 19 21 15
对照组 23 26 28
四、热处理对抑菌能力的影响
实施例3步骤（1）上清液经121℃水浴处理20min，作为热处理组，以实施例3步骤（1）上清液为对照，分别加入接有指示菌的培养基孔内，测定抑菌活性，取3次平行抑菌圈直径的平均值。
结果如下表5所示，经过热处理的上清液抑制病原菌的水平均低于对照组的抑菌水平。
表5 热处理组与对照组的抑菌圈直径对比（mm）
组别 大肠杆菌 CICC10899 沙门氏菌 WX29 枯草芽孢杆菌 CICC10012
热处理组 21 24 17
对照组 23 26 28
五、蛋白酶K对抑菌能力的影响
以1mg/mL蛋白酶K（pH值为7）处理实施例3步骤（1）上清液，37℃水浴1h后将上清液调至原pH值，作为蛋白酶K组，以实施例3步骤（1）上清液作为对照组，分别加入接有指示菌的培养基孔内，测定抑菌活性，取3次平行抑菌圈直径的平均值。
结果如下表6所示，经过蛋白酶K处理的上清液抑制病原菌的水平均低于对照组的抑菌水平。
表6 蛋白酶K组与对照组的抑菌圈直径对比（mm）
组别 大肠杆菌 CICC10899 沙门氏菌 WX29 枯草芽孢杆菌 CICC10012
蛋白酶K组 19 22 16
对照组 23 26 28
综合上述实验一至六对乳双歧杆菌抑菌有效成分的分析，发现乳双歧杆菌发酵产物中存在除乳酸外的其他抑菌物质。主要的抑菌物质需要在较低pH值协同作用下，才能发挥良好的抑菌效果。
实施例5 乳双歧杆菌JYBR-390对肠道小肠隐窝上皮细胞（HT-29细胞）的粘附率实验
益生菌的粘附能力对于其在胃肠道转运的驻留时间十分重要。益生菌粘附于肠粘膜的能力有益于调节肠道菌群的正常结构、增强自身的定殖能力、抑制病原体对肠道的侵袭和提高肠道免疫力。
实验步骤为：（1）将JYRB-190乳双歧杆菌，按照4%接种量，接种于200mL的MRS液体培养基中，37℃厌氧发酵48h，并用无菌生理盐水调节菌悬浮液至107cfu/mL。
（2）将HT-29细胞培养于DMEM完全培养液中，于37℃条件下在5%CO2的培养箱中培养，隔天更换一次培养液，待细胞增殖率达80%左右时，以含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化细胞，按1：3传代，取对数生长期细胞进行实验。
（3）将培养好的HT-29细胞1mL转接入6孔板中，于37℃条件下在5%CO2的培养箱中培养过夜；将培养至稳定期前期的乳双歧杆菌用PBS冲洗3次后重悬于DMEM培养基中，调整其浓度为1×107cfu/mL。将此菌悬液以同样的体积加入到HT-29细胞中，37℃培养3h。
（4）用PBS冲洗细胞3次，用甲醇固定30min后，再进行革兰氏染色，用显微镜观察20个视野下每个细胞上粘附的乳双歧杆菌的数目。
经统计，JYRB-190在HT-29细胞上的粘附率为84%，粘附个数为124个，表面乳双歧杆菌JYBR-390在细胞定植方面有较强的能力。
实施例6 乳双歧杆菌JYBR-390对便秘小鼠首粒排黑便时间、粪便含水量和血液胃肠肽指标的影响
选取60只无特定病原体的BALB/c雄性小鼠（20~22g，7-8周龄，购买自江苏苏普斯实验动物中心），经过1周适应期后，将小鼠按照每组10只随机分组，共分成6组，包括空白对照组（灌胃无菌生理盐水）、模型组（灌胃盐酸洛哌丁胺+无菌生理盐水）、不同剂量的干预组（在模型组的基础上灌胃剂量分别为1×1010cfu/mL、1×109cfu/mL、1×108cfu/mL的实施例3步骤（1）上清液，三个干预组依次以H组、M组、L组表示），阳性对照组灌胃酚酞悬液，各组灌胃体积均为0.25mL，共灌胃28天。
实验中，由于便秘模型的造模是由盐酸洛哌丁胺减缓肠道蠕动的时间达到的，而盐酸洛哌丁胺是作用于肠壁的阿片受体，药物作用持续时间为24h以上，需要天天造模。
实验期间，饲养环境严格控制在温度为25±2℃和湿度为50%±5%的12h光照、12h黑夜的环境中。实验期间，小鼠自由进食进水，小鼠饲料为购买于江苏省协同医药生物工程有限公司的实验鼠维持饲料。
一、小鼠首粒排黑便时间的测定
在小鼠灌胃的最后一天进行小鼠首粒排黑便时间的检测，检测方法如下：给所有组小鼠灌胃盐酸洛哌丁胺，一小时后，空白对照组和模型组用墨汁灌胃，H组、M组和L组以及阳性对照组灌胃含有各自灌胃内容物的墨汁，从灌胃墨汁开始，记录每只动物首粒排黑便时间。以模型组最后一只小鼠的首粒黑便时间为终止时间，超过模型组首粒黑便时间的处理组为无效，比较各个处理组与模型组之间的差异，分析各组在缓解便秘方面的差异。
结果如下表7所示，H组（灌胃高剂量乳双歧杆菌JYBR-390的干预组）明显比其他组首粒排黑便排便时间短，说明灌胃剂量为1×1010cfu/mL以上的乳双歧杆菌JYBR-390上清液具有提高肠道动力，促进排便。
表7 各组小鼠首粒排黑便时间（min）
组别 首粒排黑便时间
空白对照组 100
模型组 270
H组 205
M组 231
L组 257
阳性对照组 265
二、小鼠粪便含水量的测定
实验期间，每天早上8-11点收集粪便，方法为：将每组中的小鼠单独放置在铺有干净滤纸的IVC笼盒中，收集每只小鼠的粪便，将收集到的粪便装入无菌的1.5mL的EP管中，然后将EP管置于冰盒中保存，收集期间记录每只小鼠的排便粒数、粪便湿重，冷冻干燥收集到的粪便，记录粪便的干重，并计算粪便的含水量。
粪便冷冻干燥分为五个阶段，阶段一：以1℃/min的速率降温至-40℃，用时4h；阶段二：以0.5℃/min的速率升温至-30℃后稳定，总用时15h；阶段三：以0.5℃/min的速率升温至-10℃后稳定，总用时15h；阶段四：以1℃/min的速率升温至10℃后稳定，总用时4h；阶段五：以1℃/min的速率升温至20℃后稳定，总用时4h。
粪便的含水量计算公式为：粪便含水量（%）=（粪便湿重-粪便干重）/粪便湿重×100%。
结果如下表8所示，说明灌胃剂量为1×1010cfu/mL以上的乳双歧杆菌JYBR-390上清液对提高粪便含水量具有积极作用。特别是H组，28天时依然改善粪便含水量，而阳性对照组在28天时粪便含水量已经和空白对照组一样。
表8 各组小鼠粪便含水量
组别 粪便含水量（1-14天） 粪便含水量（15-28天）
空白对照组 58% 57%
模型组 40% 40%
H组 70% 68%
M组 65% 59%
L组 55% 53%
阳性对照组 61% 57%
三、小鼠血液胃肠肽含量的测定
与便秘相关的胃肠肽包括SP、ET、MTL、Gas和VIP、SS等，它们在正常、病理和生理情况下都涉及不同程度的变化。其中SP、ET、MTL、Gas为兴奋性递质，可以促进胃肠道的蠕动，VIP和SS为抑制性递质，可抑制小肠平滑肌的收缩，进而导致便秘。肠动力相关的胃肠肽，在调节胃肠道运动功能方面具有至关重要的作用。
具体而言，SP广泛分布于肠神经系统与整个胃肠道中，既可以激素的形式亦可作为神经递质参与胃肠运动的调控。ET有助于维持正常的心血管系统，避免便秘引发的不良后果。MTL是由22个氨基酸组成的多肽，分布于小肠的所有部分，其作用是促进和影响胃肠运动及胃肠道对水、电解质的运输。Gas是第一个阐明分子结构的胃肠激素，由开放型G细胞分泌，几乎对整个胃肠道均有作用，它可促进胃肠道的分泌功能；促进胃窦，胃体收缩，增加胃肠道的运动，同时促进幽门括约肌收缩，整体综合作用是使胃排空减慢。VIP是神经递质的一种，存在于中枢神经和肠神经系统中，在消化系统的主要作用是舒张肠道平滑肌，并使肠道平滑肌、肛门内括约肌松弛。SS主要由胰腺、胃、肠粘膜中的D细胞分泌，与平滑肌SS受体结合，抑制乙酰胆碱酯酶释放，或作为神经递质参与胃肠下行抑制性运动反射，抑制平滑肌收缩，SS可以抑制VIP释放。
实验结束后，脱颈椎处死小鼠。取小鼠血浆，于4℃、4000r/min离心10min，收集上层血清。用ELISA试剂盒测定小鼠血清中相关胃肠肽SP、ET、MTL、Gas、VIP、SS的含量，操作步骤按照试剂盒说明书进行。
结果如下表9所示，从激素水平说明乳双歧杆菌JYBR-390对增加小鼠肠道动力具有积极作用。
表9 各组小鼠血清胃肠肽含量（ng/L）
组别 SP ET MTL Gas VIP SS
空白对照组 209.27±18.25 22.81±3.87 226.83±23.00 54.41±9.12 64.06±10.81 6.61±0.81
模型组 165.16±16.60 20.79±1.47 217.52±24.79 52.71±13.61 69.57±8.95 6.69±0.71
H组 213.35±25.36 25.09±2.79 224.47±21.34 54.68±9.88 61.54±7.35 6.08±0.68
M组 203.46±18.72 21.58±3.08 222.76±25.67 53.79±9.61 63.94±6.85 6.48±0.76
L组 189.59±25.27 21.39±2.80 218.10±27.89 53.67±6.79 64.33±8.03 6.65±0.68
阳性对照组 179.87±21.09 19.39±2.27 208.56±34.51 52.84±10.05 63.34±7.05 6.38±0.78
实施例7 乳双歧杆菌JYBR-390对便秘人群通便效果的临床实验
慢性便秘判定标准参照中国慢性便秘诊治指南的诊断标准。慢性便秘的诊断主要基于症状，可借鉴罗马Ⅲ标准中功能性便秘诊断标准。诊断前出现至少6个月症状，且近3个月症状符合以下诊断标准。诊断标准：未使用泻药很少出现稀便；不符合肠易激综合征的诊断标准；必须符合以下2项或2项以上：至少25%的排便感到费力；②至少25%的排便为干球粪或硬粪；③至少25%的排便有不尽感；④至少25%的排便有肛门直肠梗阻感和（或）堵塞感；⑤至少25%的排便需手法辅助；⑥每周排便少于3次。
选取符合以上2项或2项以上的成人患者150名，随机分为对照一组、对照二组和实验组，每组50人。实验期间，每位患者仍然按照原来的生活饮食习惯不变，对照一组按照医嘱每日服用1粒利那洛肽胶囊（治疗慢病便秘的常用药）；对照二组按照医嘱每日清晨空腹服用10mL硫酸镁溶剂（通便常用泻剂）。实验组每天早饭后服用150亿cfu/g的JYBR-390产品2g，每天服用一次。
实验进行时间30天，观察疗效，疗效分为恢复、显效、有效、无效，参照《中华人民共和国医药行业标准一中医病证诊断疗效标准》中便秘的疗效标准进行判定，具体的：
（1）恢复：2天以内排便1次及以上，便质转润，排便通畅，伴随症状消失，短期无复发（疗效指数≥95%）；
（2）显效：2天以内排便，便质转润，排便欠畅，伴随症状缓解（疗效指数70%-95%之间）；
（3）有效：3天以内排便，便质先干后软，排便欠畅，伴随症状缓解（疗效指数30%-70%之间）；
（4）无效：便秘或其他症状无改善（疗效指数≤30%）。
结果如下表10所示，实验组服用乳双歧杆菌产品的效果明显好于对照一组和对照二组，证明乳双歧杆菌JYBR-390可以明显提高便秘的治愈率。
表10 各组疗效统计情况
组别 恢复（人） 显效（人） 有效（人） 无效（人） 总有效（%）
实验组 8 18 19 5 45
对照一组 6 13 16 15 35
对照二组 7 12 15 16 34
尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东中科嘉亿生物工程有限公司
<120> 一株具有便秘治疗效果的乳双歧杆菌JYBR-390及其应用和产品
<130> 2021
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 1392
<212> DNA
<213> 乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactis）
<400> 3
cgagtctcac cttagacggc tccccccaca agggtcgggc caccggcttc gggtgctacc 60
cactttcatg acttgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgcattca ccgcggcgtt 120
gctgatccgc gattactagc gactccgcct tcacgcagtc gagttgcaga ctgcgatccg 180
aactgagacc ggttttcagc gatccgcccc acgtcaccgt gtcgcaccgc gttgtaccgg 240
ccattgtagc atgcgtgaag ccctggacgt aaggggcatg atgatctgac gtcatcccca 300
ccttcctccg agttgacccc ggcggtccca catgagttcc cggcatcacc cgctggcaac 360
atgcggcgag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac 420
gacgaccatg caccacctgt gaaccggccc cgaagggaaa ccgtgtctcc acggcgatcc 480
ggcacatgtc aagcccaggt aaggttcttc gcgttgcatc gaattaatcc gcatgctccg 540
ccgcttgtgc gggcccccgt caatttcttt gagttttagc cttgcggccg tactccccag 600
gcgggatgct taacgcgttg gctccgacac gggacccgtg gaaagggccc cacatccagc 660
atccaccgtt tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgttcgctcc ccacgctttc 720
gctcctcagc gtcagtgacg gcccagagac ctgccttcgc cattggtgtt cttcccgata 780
tctacacatt ccaccgttac accgggaatt ccagtctccc ctaccgcact ccagcccgcc 840
cgtacccggc gcagatccac cgttaggcga tggactttca caccggacgc gacgaaccgc 900
ctacgagccc tttacgccca ataaatccgg ataacgctcg caccctacgt attaccgcgg 960
ctgctggcac gtagttagcc ggtgcttatt cgaacaatcc actcaacacg gccgaaaccg 1020
tgccttgccc ttgaacaaaa gcggtttaca acccgaaggc ctccatcccg cacgcggcgt 1080
cgctgcatca ggcttgcgcc cattgtgcaa tattccccac tgctgcctcc cgtaggagtc 1140
tgggccgtat ctcagtccca atgtggccgg tcaccctctc aggccggcta cccgtcaacg 1200
ccttggtggg ccatcacccc gccaacaagc tgataggacg cgaccccatc ccatgccgca 1260
aaagcatttc ccaccccacc atgcgatgga gcggagcatc cggtattacc acccgtttcc 1320
aggagctatt ccggtgcaca gggcaggttg gtcacgcatt actcacccgt tcgccactct 1380
caccccgaca gc 1392

Claims (8)

1.一株具有便秘治疗效果的乳双歧杆菌JYBR-390，其特征在于，所述乳双歧杆菌JYBR-390已于2019年7月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.18093，分类命名为乳双歧杆菌（Bifidobacterium lactis）。
2.一种如权利要求1所述的乳双歧杆菌JYBR-390在制备治疗便秘的产品中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述治疗便秘的产品为抑制肠道内病原菌生长的产品，所述病原菌包括大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌中的至少一种。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述治疗便秘的产品为提高肠道动力的产品。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述治疗便秘的产品为提高粪便含水量的产品。
6.一种产品，其特征在于，所述产品中含有如权利要求1所述的乳双歧杆菌JYBR-390。
7.如权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品的制备方法包括如下步骤：
（1）将乳双歧杆菌JYBR-390在MRS平板培养基上活化，活化后接种于MRS液体培养基中，在37℃条件下，厌氧培养48h，获得菌液；
（2）将菌液离心后收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15wt%的复原脱脂乳中，获得悬浊液；
（3）调整悬浊液的浓度为1.0-2.0×1010cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；
（4）将菌粉与低聚异麦芽糖混合，制成治疗便秘的产品。
8.如权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品中乳双歧杆菌JYBR-390数量为1亿cfu/g、10亿cfu/g、100亿cfu/g或150亿cfu/g。
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