JP2011172506A

JP2011172506A - プロバイオティクス用のビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス菌株及びこれを用いたプロバイオティクス乳酸菌発酵食品又はその他のプロバイオティクス経口食品。

Info

Publication number: JP2011172506A
Application number: JP2010038615A
Authority: JP
Inventors: Akira Aoki; 亮青木; Akihiro Ishizuka; 晶啓石塚; Daisuke Yasuzawa; 大輔安澤; Yasuo Saito; 康雄齋藤; Tomohiko Nishijima; 智彦西嶋; Takashi Mawatari; 隆志馬渡
Original assignee: Glico Dairy Products Co Ltd
Current assignee: Glico Dairy Products Co Ltd
Priority date: 2010-02-24
Filing date: 2010-02-24
Publication date: 2011-09-08

Abstract

【課題】腸管到達後に腸管内で高倍率に増殖する新規なビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｎｉｍａｌｉｓｓｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）ＧＣＬ２５０５菌株を提供する。
【解決手段】ヒト由来のビフィズス菌であり、経口摂取により生きておなかに到達する腸内到達性を備えるとともに顕著な腸管内増殖性能を呈する。リアルタイムＰＣＲ法の定量によれば、腸管内の平均増殖相対量（倍率）は、ヨーグルトに添加した低投与量摂取のとき、摂取後１週間で約３０倍、高投与量摂取のとき、摂取後１週間で約１１倍の高倍率を呈する。プロバイオティクス菌として有用であり、各種の食品に添加適用することによって、ビフィズス菌について指摘される各種の保健効果を高度に発揮することが期待できる。
【選択図】図４

Description

本発明は、プロバイオティクス用の新規なビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス菌株（以下ビフィズス菌株と称することがある）に関し、また、該菌株を用いたプロバイオティクス乳酸菌発酵食品又はその他のプロバイオティクス経口食品に関する。

「適量を摂取したとき、宿主によい影響をあたえる生きた微生物」とされるプロバイオティクス菌として種々の乳酸菌やビフィズス菌が産業利用されており、プロバイオティクス菌の中でも、特にビフィズス菌については、免疫賦活作用、感染防御、下痢・便秘・炎症性腸疾患、ビタミンやカルシウムの吸収、コレステロールの分解と調整、大腸がん予防等、各種の保健効果があることが広く指摘されている。

プロバイオティクス菌が宿主に良い影響を与えるためには、量的に多くの菌がなるべく消化管、特に腸内に生きて到達すること、すなわち腸管到達性が、その保健効果の確保の上で重要視されるところ、乳酸菌に関して、下記非特許文献１は、ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓＬ−９２について、摂取菌数の９３％が糞便から回収されていることによって、該菌株の腸管到達性が優れているとしており、下記非特許文献２は、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉＳＢＴ２０５５の腸管生存性を調べ、１−５×１０⁶ｃｆｕ／ｇを含む発酵乳１００ｇを投与したところ、糞便中から最大で１０⁵ｃｆｕ／ｇ程度検出されたと報告している。また、下記非特許文献３は、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓＫＢ２９０の腸管到達性が優れていたと報告している（但し、摂取菌数より排泄菌数の方が少ない）。ビフィズス菌に関して、下記非特許文献４は、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓｓｓｐ．ｌａｃｔｉｓＤＮ−１７３０１０を成人に投与したところ、摂取した菌数に比べて糞便中からＤＮ−１７３０１０が２０％程度検出されたと報告している。このように種々のプロバイオティクス菌においてその腸管到達性が調べられているが、いずれもが摂取した菌数と同等かそれ以下の菌数が腸管に到達したことが報告されるに止まるか、もしくは腸管に到達した菌数を測定していないものとされている。

日本乳酸菌学会誌２００１年１２号「ヒト腸管内で生残性の良いＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓＬ−９２株の単離とその性質」２８−３５頁Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６年５０号「ＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇａｎｄｓｕｒｖｉｖａｌｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉＳＢＴ２０５５ｉｎｔｈｅｈｕｍａｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｔｒａｃｔ．」８６７−８７０頁ミルクサイエンス２００７年５５号「ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓＫＢ２９０(ラブレ菌)の特徴とその生理機能」１５１−１５６頁Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８年１４号「ＳｕｒｖｉｖａｌｏｆＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｎｉｍａｌｉｓＤＮ−１７３０１０ｉｎｔｈｅｆａｅｃａｌｍｉｃｒｏｂｉｏｔａａｆｔｅｒａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｉｎｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄｆｏｒｍｏｒｉｎｆｅｒｍｅｎｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔ − ａｒａｎｄｏｍｉｚｅｄｓｔｕｄｙｉｎｈｅａｌｔｈｙａｄｕｌｔｓ．」１２８−１３６頁

上記のようにプロバイオティクスの分野において、上記ＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓＬ−９２、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉＳＢＴ２０５５、Ｌ．ｂｒｅｖｉｓＫＢ２９０、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓｓｓｐ．ｌａｃｔｉｓＤＮ‐１７３０１０等の乳酸菌やビフィズス菌のプロバイオティクス菌について、その腸管到達性の優位性が認められるとするところ、プロバイオティクス菌の産業利用の面からは、より有効なプロバイオティクス菌、特に、その腸管到達性の優位性とともに又はこれに代えて腸管において増殖する腸管内増殖性を備えたプロバイオティクス菌を取得すれば、その宿主に対する保健効果を更に発揮することも可能になり、従って、このように腸管内増殖性を有する新規なプロバイオティクス菌を取得することが求められるとともにその積極的な産業利用が求められる。

本発明はかかる事情に鑑みてなされたもので、その解決課題とするところは、腸管到達後の腸管内増殖性に優れた新規なプロバイオティクス菌、特にビフィズス菌の菌株を提供するにあり、また、該菌株を用いたプロバイオティクス乳酸菌発酵食品又はその他のプロバイオティクス経口食品を提供するにある。

上記課題に沿って、出願人会社保有のビフィドバクテリウム属の各種菌株について腸管内増殖性が優れた菌株取得の観点から、鋭意研究を重ねた結果、ある種のビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｎｉｍａｌｉｓｓｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）菌株が、経口摂取の菌数を基準にすると、その数倍乃至それ以上の顕著な腸管内増殖性を有していることを見出し、従って該菌株をプロバイオティクス用とすることによって、上記免疫賦活作用、感染防御、下痢・便秘・炎症性腸疾患、ビタミンやカルシウムの吸収、コレステロールの分解と調整、大腸がん予防等の保健効果を期待し得ることから本発明をなすに至ったもので、即ち、請求項１に記載の発明を、腸管到達後における腸管内増殖性能を保有してなることを特徴とするプロバイオティクス用ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｎｉｍａｌｉｓｓｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）菌株としたものである。

請求項２に記載の発明は、該菌株は、その腸管内増殖性能を培養法又はリアルタイムＰＣＲ法の定量によって測定すると、その平均増殖相対量（倍率。以下同じ）は、少なくとも、摂取翌日に摂取量の約２倍乃至それ以上の高倍率を呈するものであることから、これを、上記菌株の培養法又はリアルタイムＰＣＲ法の定量による腸管内増殖性能が高倍率であり且つその平均増殖相対量が、摂取翌日に摂取量の約２倍又はそれ以上の高倍率を呈してなることを特徴とする請求項１に記載の菌株としたものである。

請求項３に記載の発明は、該菌株を、ＧＣＬ２５０５と命名した（出願人会社命名。特許生物寄託センター受領番号ＦＥＲＭＡＰ−２１９１８）ことから、これを、上記菌株が、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｎｉｍａｌｉｓｓｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）ＧＣＬ２５０５（ＦＥＲＭＡＰ−２１９１８）菌株であることを特徴とする請求項１又は２に記載の菌株としたものである。

請求項４に記載の発明は、上記高倍率の腸管内増殖性から、該菌株を、産業利用することによって、上記免疫賦活作用、感染防御、下痢・便秘・炎症性腸疾患、ビタミンやカルシウムの吸収、コレステロールの分解と調整、大腸がん予防等の有効な保健効果を期待し得るヨーグルトその他の乳酸菌発酵食品を提供するように、これを、請求項１乃至３のいずれかに記載の菌株を含有して経口摂取用としてなることを特徴とするプロバイオティクス乳酸菌発酵食品としたものである。

請求項５に記載の発明は、この種乳酸菌発酵食品、例えばヨーグルト１００ｇに一般に好適に用い得る生菌数（コロニー数）の如くに標準的な低投与量とするように摂取する約２０億ＣＦＵとしたとき、その摂取による培養法又はリアルタイムＰＣＲ法の定量による平均増殖相対量は、摂取翌日（摂取１日後）に約２０倍又はそれ以上、例えば３０倍程度という如くに高倍率を呈するものであることから、これを、上記菌株を約２０億ＣＦＵ含有したものを摂取することによって、培養法又はリアルタイムＰＣＲ法の定量による該菌株の腸管内増殖性能の平均増殖相対量が、摂取翌日に摂取量の約２０倍又はそれ以上の高倍率を呈することを特徴とする請求項４に記載のプロバイオティクス乳酸菌発酵食品としたものである。

請求項６に記載の発明は、同じくこの種乳酸菌発酵食品における生菌数（コロニー数）の約２００億乃至３００億ＣＦＵという如くに多量な高投与量とするように摂取し、又は、例えば１０００億ＣＦＵという如くに極めて多量な超高投与量とするように摂取したとき、その摂取による培養法又はリアルタイムＰＣＲ法の定量による平均増殖相対量（倍率）は、少なくとも、摂取翌日（摂取１日後）に約２倍又はそれ以上、例えば１１倍程度という如くに高倍率を呈するものであることから、これを、上記菌株を約２００億乃至３００億ＣＦＵ又はそれ以上含有したものを摂取することによって、該菌株の培養法又はリアルタイムＰＣＲ法の定量による腸管内増殖性能の平均増殖相対量が、摂取翌日に摂取量の約２倍又はそれ以上の高倍率を呈することを特徴とする請求項４に記載のプロバイオティクス乳酸菌発酵食品としたものである。

請求項７に記載の発明は、該菌株を、適宜の投与量とするように含有した各種の飲料、食品、食品素材、食品添加物、医薬品、サプリメント等の乳酸菌発酵食品以外の食品に産業利用することによって上記免疫賦活作用、感染防御、下痢・便秘・炎症性腸疾患、ビタミンやカルシウムの吸収、コレステロールの分解と調整、大腸がん予防等の有効な保健効果を期待し得る各種経口摂取用の経口食品を提供するように、これを、請求項１乃至３のいずれかに記載の菌株を含有して乳酸菌発酵食品以外の経口摂取用としてなることを特徴とするプロバイオティクス経口食品としたものである。

本発明はこれらをそれぞれ発明の要旨として、上記課題解決の手段としたものである。

本発明は以上のとおりに構成したから、請求項１に記載の発明は、腸管到達後の腸管内増殖性に優れて、上記免疫賦活作用、感染防御、下痢・便秘・炎症性腸疾患、ビタミンやカルシウムの吸収、コレステロールの分解と調整、大腸がん予防等の保健効果を期待し得る、新規なビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｎｉｍａｌｉｓｓｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）菌株を提供することができる。

請求項２に記載の発明は、該菌株は、その腸管内増殖性能を培養法又はリアルタイムＰＣＲ法の定量によって測定することによって、その平均増殖相対量を、少なくとも、摂取翌日に摂取量の約２倍乃至それ以上の高倍率を呈するものとすることができる。

請求項３に記載の発明は、該菌株を、ＧＣＬ２５０５（特許生物寄託センター受領番号ＦＥＲＭＡＰ−２１９１８）菌株によるものとすることができる。

請求項４に記載の発明は、上記高倍率の腸管内増殖性から、該菌株を、産業利用することによって、上記免疫賦活作用、感染防御、下痢・便秘・炎症性腸疾患、ビタミンやカルシウムの吸収、コレステロールの分解と調整、大腸がん予防等の有効な保健効果を期待し得るヨーグルトその他のプロバイオティクス乳酸菌発酵食品を提供することができる。

請求項５に記載の発明は、この種乳酸菌発酵食品、例えばヨーグルト１００ｇに一般に好適に用い得る生菌数（コロニー数）の如くに標準的な低投与量とするように摂取する約２０億ＣＦＵとしたとき、その摂取による培養法又はリアルタイムＰＣＲ法の定量による平均増殖相対量は、摂取翌日（摂取１日後）に約２０倍又はそれ以上、例えば３０倍程度という如くに高倍率を呈するものとすることができる。

請求項６に記載の発明は、同じくこの種乳酸菌発酵食品における生菌数（コロニー数）の約２００億乃至３００億ＣＦＵという如くに多量な高投与量とするように摂取し、又は、例えば１０００億ＣＦＵという如くに極めて多量な超高投与量とするように摂取したとき、その摂取による培養法又はリアルタイムＰＣＲ法の定量による平均増殖相対量（倍率）は、少なくとも、摂取翌日（摂取１日後）に約２倍又はそれ以上、例えば１１倍程度という如くに高倍率を呈するものとすることができる。

請求項７に記載の発明は、該菌株を、各種の飲料、食品、食品素材、食品添加物、医薬品、サプリメント等の乳酸菌発酵食品以外の食品に産業利用することによって上記免疫賦活作用、感染防御、下痢・便秘・炎症性腸疾患、ビタミンやカルシウムの吸収、コレステロールの分解と調整、大腸がん予防等の有効な保健効果を期待し得る各種経口摂取用のプロバイオティクス経口食品を提供することができる。

試験スケジュールを示す図である。リアルタイムＰＣＲ法による高投与量摂取群の摂取後１週間のＧＣＬ２５０５菌数の折線グラフである。リアルタイムＰＣＲ法による低投与量摂取群の摂取後１週間のＧＣＬ２５０５菌数の折線グラフである。リアルタイムＰＣＲ法による高投与量摂取群の摂取後１週間のＧＣＬ２５０５累計菌数の棒グラフである。リアルタイムＰＣＲ法による低投与量摂取群の摂取後１週間のＧＣＬ２５０５累計菌数の棒グラフである。

本発明にあって、上記腸管到達後における腸管内増殖性能を保有するビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｎｉｍａｌｉｓｓｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）菌株、そのＧＣＬ２５０５（特許生物寄託センター受領番号ＦＥＲＭＡＰ−２１９１８）菌株は、ヒト由来のビフィズス菌であり、糞便を希釈し培養によってビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスの菌数を測定する培養法によって、また、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスからＤＮＡを抽出し、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス特異的プライマーを用いたリアルタイムＰＣＲによって同じく菌数を検出することによって得ることができる。

ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス、特にそのＧＣＬ２５０５菌株について、光学顕微鏡による形態観察、カタラーゼ反応、オキシダーゼ反応、ブドウ糖からの酸／ガス産生、ブドウ糖の酸化／発酵（Ｏ／Ｆ）の試験結果による菌株の性状を表１に、ＡＰＩ２０Ａ（フランス国リオンのｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ社製）による追加試験結果による菌株の同じく性状を、表２及び表３に示す。

該ビフィズス菌の腸管内増殖性能は、下記実施例の記載に基づいて、試験食を調整し、これを、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスの検出されないことをＰＣＲ法によって確認した被験者に摂取させ、摂取当日及びその後の各日に糞便を回収し、上記培養法又はリアルタイムＰＣＲ法によって、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスの菌数を測定乃至検出して、これを、試験食の菌数に対する平均増殖相対量を求めることによって、これを確認することができる。

該ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス、特にそのＧＣＬ２５０５の腸内増殖性能は、極めて優れており、例えば、下記実施例の結果によると、試験食による、高投与量の、例えば２．２７×１０¹⁰ｃｆｕ摂取群では、摂取１日後において、被験者１０名の平均増殖相対量は、培養法による検証で２倍以上、特に６．４倍、リアルタイムＰＣＲ法では同じく２倍以上、特に８．９倍に増加していることが確認された。また、２．９２×１０¹⁰ｃｆｕを摂取した場合、平均増殖相対量は、リアルタイムＰＣＲ法で同じく２倍以上、特に９．６倍という結果であり、従って、上記高投与量においてその摂取１日後の平均増殖相対量は、摂取量の約２倍又はそれ以上の高倍率であった。

糞便中の菌数は摂取１日後に最大となった後減少し、７日後にはほとんど検出されなかった。摂取後１週間で排泄された菌数の合計と摂取菌数とを比較したところ、図４に示すように、被験者１０名の平均増殖相対量は、上記２．２７×１０¹⁰ｃｆｕ摂取群では１１．７倍、図５に示すように、例えば、低投与量の２．２１×１０⁹ｃｆｕ摂取群では３１．８倍というそれぞれ顕著に高倍率を示すものであった。因みに、被験者１０名のうち、図４では、２倍程度の被験者が見られるから、最低でも平均増殖相対量は約２倍又はそれ以上であるということができるが、該平均増殖相対量は、概ね５倍乃至それ以上であるということができる。また、図５では、同様に摂取１日後に確認不能（排便なし）の被験者があるが、平均増殖相対量は、同じく最低でも約２倍又はそれ以上ということができるが、同様に該平均相対量は、概ね２０倍乃至それ以上であるということができる。

従って、該ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス、そのＧＣＬ２５０５は、経口摂取により生きておなかに到達する腸内到達性を備えるとともに顕著な腸管内増殖性能を呈するものであり、このとき、その腸内増殖性能による平均の増殖相対量は、少なくとも摂取翌日に摂取量の約５倍又はそれ以上、上記低投与量の場合において、少なくとも摂取翌日に摂取量の約２０倍又はそれ以上、上記高投与量の場合において、少なくとも摂取翌日に摂取量の約５倍又はそれ以上の高倍率を呈するものということができる。背景技術に示されるプロバイオティクス菌に腸内到達性の優位性は認められるとしても、本発明の上記ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス、そのＧＣＬ２５０５は、少なくとも摂取翌日において高倍率による顕著な腸管内増殖性能を有するプロバイオティクスに好適なものであることが判明した。

該ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス菌株、そのＧＣＬ２５０５菌株が腸管内増殖性能を呈するメカニズムは明らかではないが、上記顕著な腸管内増殖性から、該菌株を添加適用することによって、ヨーグルト、ドリンクヨーグルトの他、チーズ、ぬか漬け等を含めた各種の乳酸菌発酵食品やこれ以外の各種経口食品として産業利用を行うことができ、これによってビフィズス菌が有するとされる、上記免疫賦活作用、感染防御、下痢・便秘・炎症性腸疾患、ビタミンやカルシウムの吸収、コレステロールの分解と調整、大腸がん予防等、各種の保健効果を期待できる各種の食品を提供することができる。

即ち、上記ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス菌株、そのＧＣＬ２５０５菌株を含有して経口摂取用としたプロバイオティクス乳酸菌発酵食品、このとき、上記菌株を約２０億ＣＦＵ含有したものを摂取することによって、培養法又はリアルタイムＰＣＲ法の定量による該菌株の腸管内増殖性能の平均増殖相対量が、摂取翌日に摂取量の約２０倍又はそれ以上、好ましくは約３０倍又はそれ以上を呈する高倍率を呈するものとすること、上記菌株を約２００億乃至３００億ＣＦＵ又はそれ以含有したものを摂取することによって、該菌株の培養法又はリアルタイムＰＣＲ法の定量による腸管内増殖性能の平均増殖相対量が、摂取翌日に摂取量の約２倍又はそれ以上、好ましくは５倍乃至１０倍又はそれ以上の高倍率を呈するものとすることが可能であり、更には、上記菌株を含有して乳酸菌発酵食品以外の経口摂取用とした、例えば、各種の飲料、食品、食品素材、食品添加物、医薬品、サプリメント等のプロバイオティクス経口食品とすることや、該菌株を、例えば約１０００億ＣＦＵといった超高投与量のものとしたドリンクやサプリメントという如くに、少量の摂取によって保健効果の発揮を期待し得るものとすることも可能である。

ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス菌株、特にそのＧＣＬ２５０５（ＦＥＲＭＡＰ−２１９１８）菌株を、１０％脱脂粉乳培地を用い３７℃で１７時間培養し、目標菌数となるように牛乳に懸濁し試験食とした。ＢＬ寒天培地を用い試験食中の生菌数を測定したところ、高投与量摂取群では２．２７×１０⁸ｃｆｕ／ｇ、低投与量摂取群では２．２１×１０⁷ｃｆｕ／ｇであった（摂取した菌数の合計はそれぞれ２．２７×１０¹⁰ｃｆｕ、２．２１×１０⁹ｃｆｕ）。

２６〜４０才の健常な成人男性１９人を被験者とし、試験開始4日前に糞便の一部を回収し、糞便中にビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスの菌が検出されず陰性であることをＰＣＲにより確認した。試験終了までビフィズス菌を含む食品および医薬品の摂取は禁止し、図１の試験スケジュールに従って、被験者をランダムに２群にわけ、片方を高投与量摂取群(ｎ＝１０、３０．７±５．１才、平均±標準偏差)、もう一方を低投与量摂取群(ｎ＝９、３０．２±５．８才)とし、試験開始日(０日目)に糞便を回収した後、昼食後に試験食１００ｇを摂取させた。摂取１、２、３、４、７日後の糞便を全量回収し、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスＧＣＬ２５０５菌株の菌数測定に用いた（但し、摂取２日後以降の夜間に排泄された糞便は採取していない）。

高投与量摂取群の被験者の糞便提出状況と糞便重量を表４に、低投与量摂取群の被験者の糞便提出状況と糞便重量を表５にそれぞれ示す。なお、表４及び表５を含めて、表４乃至１３及び図２乃至図５において、高用量群、低用量群とは、それぞれ高投与量摂取群、低投与摂取群を示す意味に用いる。

該糞便について、培養法によるビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスＧＣＬ２５０５菌株の検出を行った。即ち、試験食摂取１日後の糞便サンプルを生理食塩水で希釈し、ＢＬ寒天培地およびＢＬＰＬｉ培地（ＢＬ寒天培地にプロピオン酸ナトリウム１２ｇ／Ｌおよび塩化リチウム４ｇ／Ｌを加えたもの）でＣＯ²置換を行った後、アネロパックケンキ(三菱ガス化学)を併用し３７℃で７２時間嫌気培養を行った。

出現したコロニーを、ガラスビーズ(０．１ｍｍ)０．３ｇとＢｅａｄＳｏｌｕｔｉｏｎ(ＭＯＢＩＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ)０．３ｍｌが入った２ｍｌスクリューキャップチューブに懸濁し、ＦａｓｔＰｒｅｐＦＰ１２０ (ＳＡＶＡＮＴ)を用いて破砕した(破砕条件; 作動スピード５．０ｍ／ｓｅｃ、１０秒間)。菌体抽出物からＭａｇｎｅＳｉｌＲＥＤとＲＮＡＬｙｓｉｓＳｏｌｕｔｉｏｎ（ともにＰｒｏｍｅｇａ）を用いて、Ｂｉｏｍｅｋ３０００（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）によりＤＮＡ抽出を行った。

ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスＧＣＬ２５０５菌株の検出は、Ｍａｌｉｎｅｎらの方法(ＭａｌｉｎｅｎＥｅｔａｌ．(２００３) Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｒｅａｌ−ｔｉｍｅＰＣＲｗｉｔｈＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩｏｒ５９−ｎｕｃｌｅａｓｅａｓｓａｙｓａｎｄｄｏｔ−ｂｌｏｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｗｉｔｈｒＤＮＡ−ｔａｒｇｅｔｅｄｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｒｏｂｅｓｉｎｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｅｌｅｃｔｅｄｆａｅｃａｌｂａｃｔｅｒｉａ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１４９，２６９−２７７)のビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスの特異的プライマー(ｆｏｒｗａｒｄ;５’−ＣＣＣＴＴＴＣＣＡＣＧＧＧＴＣＣＣ −３’, ｒｅｖｅｒｓｅ;５’−ＡＡＧＧＧＡＡＡＣＣＧＴＧＴＣＴＣＣＡＣ −３’)によるＰＣＲにより行った。但し、ＰＣＲ反応液は、２.５μｌＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥＸｔａｑＩＩ(ＴａｋａｒａＢｉｏ)、０．２５μｌｅａｃｈＰｒｉｍｅｒ(１０ｐｍｏｌ／μｌ)、２μｌ鋳型ＤＮＡとした。また、ＰＣＲ反応は、ＣＦＸ９６Ｒｅａｌ−ＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍ(ＢｉｏＲａｄ)を用いて、９５℃３０秒の後、９５℃３０秒、６０℃３０秒を３０サイクル繰り返し蛍光強度を測定した。増幅終了後、６５℃から９５℃へ温度を上昇させ、この間０．５℃の間隔で蛍光シグナルを検出して融解曲線を作成した。増幅の有無と融解曲線のＴｍ値からビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスＧＣＬ２５０５菌株の同定を行い、糞便重量と希釈倍率からその菌数を算出した。

培養法による高投与量摂取群でのビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスＧＣＬ２５０５菌数及び増加倍率を表６に、低投与量摂取群での同じく菌数及び増加率を表７に示す。

高投与量摂取群では９人中９人の被験者の糞便から摂取量以上の菌数が検出され、その平均増殖相対量は６．４倍であった。また、糞便重量あたりの菌数は９．４×１０⁸ｃｆｕ／ｇであった。低投与量摂取群では９人中７人の被験者で菌数の顕著な増加が確認され、その平均増殖相対量は１９．０倍、糞便重量あたりの菌数は３．０×１０⁸ｃｆｕ／ｇであった。

また、上記糞便について、リアルタイムＰＣＲ法によるビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスＧＣＬ２５０５菌株の検出を行った。即ち、試験食摂取１、２、３、４、７日後の糞便を全量採取し、重量測定後、Ｍａｔｓｕｋｉらの方法（松木隆広(２００６)糞便サンプルからのＤＮＡの抽出法腸内細菌学雑誌２０、２５９−２６２）に従って糞便中の全ＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡを鋳型にリアルタイムＰＣＲを行い、糞便中のビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスＧＣＬ２５０５菌株の菌数を定量した。ＰＣＲ反応には前述のビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスＧＣＬ２５０５菌株の特異的プライマーを用いた。ＰＣＲ反応液は、Ｐｒｅｍｉx ＥＸｔａｑＩＩ(ＴａｋａｒａＢｉｏ)、２μｌｅａｃｈＰｒｉｍｅｒ(１０ｐｍｏｌ／μｌ)、４μｌ鋳型ＤＮＡ、４μｌ滅菌水とした。また、ＰＣＲ反応は、ＣＦＸ９６Ｒｅａｌ−ＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍ(ＢｉｏＲａｄ)を用いて、９５℃３０秒の後、９５℃５秒、６０℃３０秒を３５サイクル繰り返し蛍光強度を測定した。増幅終了後、６５℃から９５℃へ温度を上昇させ、この間０.５℃の間隔で蛍光シグナルを検出して融解曲線を作成した。ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスＧＣＬ２５０５菌株の検量線は、１０⁸から１０³ｃｆｕ／ｇに段階希釈したＧＣＬ２５０５培養液を、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス陰性ボランティアの糞便に懸濁しＤＮＡ抽出したものを用いた。

被験者は陰性であることから、被験者の腸内には、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスは常在していないと判断され、従って、発酵乳摂取後に糞便から分離され、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスＧＣＬ２５０５菌株の特異的プライマーを用いたＰＣＲで増幅があった場合には、ＧＣＬ２５０５であると判断した。

リアルタイムＰＣＲ法による高投与量摂取群での便重量あたりのビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスＧＣＬ２５０５菌数を表８に、糞便総量中のビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスＧＣＬ２５０５菌数を表９に、高投与量摂取群でのビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスＧＣＬ２５０５菌数の増加倍率を表１０に、また、低投与量摂取群での同じく便重量あたりのビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスＧＣＬ２５０５菌数を表１１に、糞便総量中のビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスＧＣＬ２５０５菌数を表１２に、高投与量摂取群でのビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスＧＣＬ２５０５菌数の増加倍率を表１３にそれぞれ示す。

これらリアルタイムＰＣＲ法の結果に基づく、摂取後１週間の糞便中に排泄された高低投与量摂取群と低投与量摂取群のビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスＧＣＬ２５０５菌数の折線グラフによる推移を図２及び図３に、その高投与量摂取群と低投与量摂取群の累積菌数の棒グラフを図４及び図５にそれぞれ示す。

検量線は、１０⁸−１０³ｃｆｕ／ｇｆｅｃｅｓまでの間で直線性があり、ＰＣＲの増幅効率は１０２％であった。検出限界は１０²ｃｆｕ／ｇｆｅｃｅｓであった。高投与量摂取群では９人中９人で増加が確認され、摂取１週間で排泄されたビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスＧＣＬ２５０５菌数は、摂取菌数に比べて平均で１１．７倍(最大で２９．７倍、最少で３倍)であり、糞便重量あたりの菌数は摂取1日後に最大となり平均で１．４×１０⁹ｃｆｕ／ｇとなった。１日目で最大となった被験者が多かったが、被験者Iにおいては2日目に菌数が最大となった。その後減少し、７日目には１名を除き検出限界以下であった。低投与量摂取群でおいても９人中９人において増加が確認され、平均で３１．８倍(最大で６７．６倍、最小で２．０倍、２日目以降糞便提出がなかった被験者Ｊは集計から除外した)であった。糞便重量あたり菌数は摂取１日後に最大となる被験者が多く、平均で３．８×１０⁸ｃｆｕ／ｇであり、摂取７日後には９人中３人で検出限界以下となった。

被験者を２７才〜３８才の健常な成人男性８人(３４±３．６才、平均±標準偏差)とし、試験食のビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスＧＣＬ２５０５菌数を２．９２×１０¹⁰ｃｆｕ／１００ｇとし、ＰＣＲ反応液は、２５μｌＳＹＢＲＰｒｅｍｉｘＥＸｔａｑＩＩ(ＴａｋａｒａＢｉｏ)、４μｌｅａｃｈＰｒｉｍｅｒ(１０ｐｍｏｌ／μｌ)、４μｌ鋳型ＤＮＡ、１μｌＲＯＸＲｅｆｅｒｅｎｃｅＤｙｅ、１６μｌ滅菌水とした以外、上記実施例１と同様にリアルタイムＰＣＲ法による菌数の検出を行った。

試験食摂取前の糞便から、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスが検出された被験者が1名おり、試験をスケジュールどおり終えたものは８人中７人であり、試験食の菌数は２．９２×１０⁸ｃｆｕ／ｇ（摂取菌数の合計は２．９２×１０¹⁰ｃｆｕ）であった。

糞便提出状況と重量を表１４に、リアルタイムＰＣＲによる便重量あたりのビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスＧＣＬ２５０５菌数を表１５に、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティスＧＣＬ２５０５菌数の増加倍率を表１６にそれぞれ示す。

この場合も、全員に菌数の増加が認められ、その糞便重量あたりの菌数は、１．３×１０⁹ｃｆｕ／ｇであり、平均増殖相対量は１３．４倍（最大で３２．６倍、最小で１．３倍）であった。

Claims

腸管到達後における腸管内増殖性能を保有してなることを特徴とするプロバイオティクス用ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｎｉｍａｌｉｓｓｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）菌株。
上記菌株の培養法又はリアルタイムＰＣＲ法の定量による腸管内増殖性能が高倍率であり且つその平均増殖相対量が、摂取翌日に摂取量の約２倍又はそれ以上の高倍率を呈してなることを特徴とする請求項１に記載の菌株。
上記菌株が、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシーズ・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｎｉｍａｌｉｓｓｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）ＧＣＬ２５０５（ＦＥＲＭＡＰ−２１９１８）菌株であることを特徴とする請求項１又は２に記載の菌株。
請求項１乃至３のいずれかに記載の菌株を含有して経口摂取用としてなることを特徴とするプロバイオティクス乳酸菌発酵食品。
上記菌株を約２０億ＣＦＵ含有したものを摂取することによって、培養法又はリアルタイムＰＣＲ法の定量による該菌株の腸管内増殖性能の平均増殖相対量が、摂取翌日に摂取量の約２０倍又はそれ以上の高倍率を呈することを特徴とする請求項４に記載のプロバイオティクス乳酸菌発酵食品。
上記菌株を約２００億乃至３００億ＣＦＵ又はそれ以上含有したものを摂取することによって、該菌株の培養法又はリアルタイムＰＣＲ法の定量による腸管内増殖性能の平均増殖相対量が、摂取翌日に摂取量の約２倍又はそれ以上の高倍率を呈することを特徴とする請求項４に記載のプロバイオティクス乳酸菌発酵食品。
請求項１乃至３のいずれかに記載の菌株を含有して乳酸菌発酵食品以外の経口摂取用としてなることを特徴とするプロバイオティクス経口食品。