KR20150143804A

KR20150143804A - 락토바실러스속 균

Info

Publication number: KR20150143804A
Application number: KR1020157032783A
Authority: KR
Inventors: 에이지 후쿠시마; 사나에 오카다
Original assignee: 산토리 홀딩스 가부시키가이샤
Priority date: 2013-04-17
Filing date: 2014-04-16
Publication date: 2015-12-23
Also published as: AU2014254812B2; HK1213010A1; CA2908031A1; ES2633495T3; EP2987853A1; CN105143438B; CN105143438A; JPWO2014171477A1; EP2987853B1; US20160115559A1; JP5866115B2; AU2014254812A1; MY174136A; WO2014171477A1; EP2987853A4; NZ712617A

Abstract

본 발명에서는, 장관 내에 도달 후, 소장 및/또는 대장 내, 바람직하게는 소장 내에서의 증식능을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) TUA4337L주(수탁번호 NITE BP-1479)를 제공한다. 본 발명의 유산균은, 장관 내에서의 증식능을 갖기 때문에, 체내에 섭취하면, 그 유산균이 장관 내에 도달하여 증식함으로써, 지속적으로 지방 흡수를 억제하거나 효과적으로 체중 증가를 억제하거나 할 수 있어, 다이어트 효과를 목적으로 적합하게 이용된다.

Description

락토바실러스속 균{BACTERIUM BELONGING TO GENUS LACTOBACILLUS}

본 발명은 락토바실러스에 속하는 균에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 신규 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)에 관한 것이다.

유산균이나 비피더스균에는, 정장 효과나 면역 부활 효과 등의 우수한 생리 활성을 갖는 것이 있고, 균종의 특성에 따라서 각종 용도로 이용되고 있다. 그 중에서도, 최근 이들 균을 섭취하는 것에 의한 다이어트 효과에 관해 연구가 진행되고 있고, 많은 보고가 거론되고 있다.

예컨대, 특허문헌 1에서는, 락토바실러스 람노서스 ATCC53103주가, 비만의 원인이 되는 지질(트리아실글리세롤)을 분해하여 체내로의 흡수를 억제하는 것을 보고하고 있다. 또한, 식물성 유산균의 일종인 L. 브레비스(L. brevis) KB290이 살아 있는 상태로 장내에 도달하여, 장내 생존율 및 장관 도달성이 우수한 것도 알려져 있다(단, 섭취균수보다 배설균수가 적음)(비특허문헌 1 참조). 또한, 비특허문헌 2는, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) L-92에 관해, 섭취균수의 93%가 분변으로부터 회수되고 있음으로써 그 균주의 장관 도달성이 우수하다고 하고 있고, 비특허문헌 3은, L. 가세리(L. gasseri) SBT2055의 장관 생존성을 조사하여, 1×10⁶∼5×10⁶ cfu/g를 포함하는 발효유 100 g을 투여한 바, 분변 중에서 최대 1×10⁵ cfu/g 정도 검출되었다고 보고하고 있다.

한편, 비피더스균에 관해서는, 비피도박테리움 애니말리스 아종 락티스(Bifidobacterium animalis ssp . lactis) GCL2505주가, 경구 섭취 후에 살아서 장에 도달하는 장관 도달성을 갖춤과 함께, 현저한 장관 내 증식성을 나타내는 것이 보고되어 있다(특허문헌 2 참조). 비특허문헌 4는, B.애니말리스 아종 락티스 DN-173 010을 성인에게 투여한 바, 섭취한 균수에 비해 분변 중에서 DN-173 010이 20% 정도 검출되었다고 보고하고 있다.

일본 특허 공개 제2011-206057호 공보 일본 특허 공개 제2011-172506호 공보

「유산균의 보건 기능과 응용」 2007년 8월 31일 CMC 출판 160-162 페이지 일본유산균학회지 2001년 12호 「인간 장관 내에서 생존성이 좋은 Lactobacillus acidophilus L-92주의 단리와 그 성질」 28-35 페이지 Microbiol. Immunol. 2006년 50호 「Monitoring and survival of Lactobacillus gasseri SBT2055 in the human intestinal tract.」 867-870 페이지 J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2008년 14호 「Survival of Bifidobacterium animalis DN-173 010 in the faecal microbiota after administration in lyophilized form or in fermented product - a randomized study in healthy adults.」 128-136 페이지

종래, 이와 같이 여러가지 프로바이오틱스균에 있어서 그 장관 도달성이 조사되고 있지만, 유산균에 관해서는 어느 것이든 섭취한 균수와 동등 또는 그 이하의 균수가 장관에 도달한 것이 보고되는 것에 그치거나, 혹은 장관에 도달한 균수가 측정되어 있지 않다.

또한, 지방의 흡수는 주로 소장에서 행해지기 때문에, 통상 대장에서 증식하는 비피더스균이 장관 내 증식성을 나타냈다 하더라도, 지방 흡수의 억제는 충분하지 않다. 또한, 유산균은 대장보다 상류에서 작용하는 것이 알려져 있지만, 장관 내에서 증식성을 나타내는 균종의 보고는 아직 없다.

본 발명의 과제는, 장관 내 증식성을 나타내는 유산균을 제공하는 것에 있다.

본 발명은, 장관 내에서의 증식능을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 펜토서스 TUA4337L주(수탁번호 NITE BP-1479)에 관한 것이다.

본 발명의 유산균은, 장관 내에서 증식한다고 하는 우수한 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 유산균을 섭취하면, 그 유산균이 장관 내에 도달하여 증식함으로써 지방 흡수 억제 효과가 지속되는 등 균체의 생리 활성이 증강되고, 나아가서는 높은 다이어트 효과를 얻을 수 있다고 하는 우수한 효과가 나타난다.

도 1은, 인공 장액에서의 스크리닝의 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는, 체중 증가의 추이를 나타내는 도면이다. 도면 중의 「*」표시는, 고지방식군에 대하여 유의차(p<0.05)가 있는 것을 나타낸다.
도 3은, 혈청 중의 트리글리세라이드량을 나타내는 도면이다. 도면 중의 「*」표시는, 고지방식군에 대하여 유의차(p<0.05)가 있는 것을 나타낸다.

본 발명의 유산균은, 락토바실러스 펜토서스 TUA4337L주이며, 장관 내에서의 증식능을 갖는 것을 특징으로 한다. 또, 본 명세서에 있어서, 「장관 내에서의 증식능을 갖는다」 또는 「장관 내에서 증식한다」란, 장관 내에 도달 후 소장 및/또는 대장 내, 바람직하게는 소장 내에서 증식하는 것이며, 증식능의 정도는, 인공 장액에 있어서 37℃로 6 hr 배양했을 때에, 식균시의 OD₆₆₀에 대하여 10배 이상의 수치를 나타내는 경우에 「증식능 있음 」이라고 평가할 수 있다.

본 발명자들은, 본 발명자들이 보유하는 약 480 종류의 유산균에 관해 인공 장액 중에서의 증식능을 조사하고, 그 중에서 선택한 락토바실러스 펜토서스에 속하는 균의 현탁액을 동물에게 투여한 바, 락토바실러스 펜토서스 TUA4337L주가, 투여균수에 비해서 배출된 균수가 유의미하게 많아지는 것을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.

락토바실러스 펜토서스 TUA4337L주는, 식별 표시 NRIC 0883, 수탁번호 NITE BP-1479로서, 국제 수탁일 2012년 12월 10일부로 독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물기탁센터(일본 치바현 키사라즈시 카즈사카마타리 2-5-8)에 기탁된 것이다. 이하, 락토바실러스 펜토서스 TUA4337L주를 TUA4337L주로 약기한다.

TUA4337L주의 균학적 성질을 표 1 및 표 2에 나타낸다. 표 2의 당 자화성은 세균 동정 키트 API 50CH(BIOMETRIEUX)를 이용하여 측정한 결과이다. 또, 표 2에서의 「+」는 자화되는 당인 것을, 「-」은 자화되지 않은 당인 것을 의미한다.

TUA4337L주는, 후술하는 실시예에서 상세히 설명하지만, 섭취된 균수에 대하여 배출되는 균수가 많아지는 특징, 즉 장관 내 증식성을 갖는다. 또한, 장관 내 증식성으로는, 예컨대, 인공 장액 중에서 37℃로 6시간 배양 후에는, 배양 개시시의 균수를 기준으로 하면, 바람직하게는 10배 이상, 보다 바람직하게는 15배 이상, 더욱 바람직하게는 20배 이상, 보다 더 바람직하게는 25배 이상의 균수를 나타낸다.

또한, TUA4337L주에서 추출한 DNA로부터 해독된 recA 유전자의 서열(서열번호 1)은, 락토바실러스 펜토서스 IG1주의 recA 유전자의 서열과 99%의 상동성을 갖는다. 또, 본 명세서에 있어서, 상동성은, 예컨대 Altschul 등(The Journal of Molecular Biology, 215, 403-410(1990))이 개발한 알고리즘을 사용한 검색 프로그램 BLAST를 이용함으로써, 스코어로 유사도를 나타낸다.

TUA4337L주를 배양하기 위한 배지로는, 특별히 제한되지 않고, 통상의 탄소원, 질소원, 무기염류, 유기 영양소 등을 포함하는 배지를 들 수 있다. 또한, 한천 배지나 액체 배지에서의 배양도 가능하다. 배양 온도는, 바람직하게는 10∼45℃, 보다 바람직하게는 15∼42℃, 더욱 바람직하게는 28∼38℃, 더욱 바람직하게는 35∼37℃이고, 증식 가능 pH는, 바람직하게는 pH 3.0∼12.5, 보다 바람직하게는 pH 3.5∼12.0이다.

본 발명의 균주로는, 유산균(생균 및 사균) 그 자체, 유산균 함유물, 유산균 처리물 등의 각종 형태를 들 수 있다. 생균은 그 유산균 배양액 등의 유산균 함유물로부터 얻을 수 있다. 사균은, 예컨대 생균에 대하여 가열, 자외선 조사, 포르말린 처리, 산처리 등을 행함으로써 얻을 수 있다. 얻어진 생균, 사균은 마쇄나 파쇄 등을 더 행함으로써 처리물로 할 수 있다. 또, 상기 각 형태에서의 유산균은, 장관 내에서 충분히 증식하는 효과를 발휘하는 관점에서 생균인 것이 바람직하지만, 사균이 혼재되어 있어도 좋다.

상기 유산균으로는, 예컨대 생균체, 습윤균, 건조균 등을 들 수 있다. 상기 유산균 함유물로는, 예컨대 유산균 현탁액, 유산균 배양물(균체, 배양 상청, 배지 성분을 포함), 유산균 배양액(균배양물로부터 고형분을 제거한 것)을 들 수 있다. 또한, 상기 유산균 처리물로는, 예컨대 마쇄물, 파쇄물, 액상물(추출액 등), 농축물, 페이스트화물, 건조물(분무 건조물, 동결 건조물, 진공 건조물, 드럼 건조물 등), 희석물 등을 들 수 있다.

[ 실시예 ]

이하, 실시예를 나타내어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 하기 실시예에 제한되는 것은 아니다.

실시예 1 <인공 장액에서의 증식능을 지표로 한 스크리닝>

본 발명자들이 보유하는 유산균 중, 주로 식물성 유산균인 약 480주(JCM주를 포함)에 관해 인공 장액에서의 증식능을 평가했다.

구체적으로는, 우선 각 유산균을 글리세롤 스톡으로부터 MRS 배지(Difco Laboratories)(10 mL)에 1 v/v%씩이 되도록 식균하여 35℃로 16∼17 hr 배양했다. 다음으로, 각 배양액의 OD₆₆₀(660 nm에서의 흡광도)을 분광 광도계 UV-1600(시마즈 제작소)을 이용하여 측정하고, 각 배양액의 OD₆₆₀이 10이 되도록 MRS 배지로 조제한 것 100 μL를 하기에 나타내는 조성의 인공 장액(10 mL)에 식균했다. 그 후, 천천히 진탕하면서 37℃로 6 hr 배양한 후 OD₆₆₀을 측정하여, 증식 배율(6 hr 후의 OD₆₆₀/식균시의 OD₆₆₀)을 구했다. 대표적인 스크리닝 결과를 표 3 및 도 1에 나타낸다.

<인공 장액(pH 6.45)>

MRS 배지 9 mL

10 w/v% 담즙(와코쥰야쿠공업 주식회사) 용액 1 mL

1 w/v% 판크레아틴(돼지(Porcine) 유래 : SIGMA) 100 μL

또, 담즙 용액 및 판크레아틴 용액은 0.22 ㎛의 필터(PVDF 멤브레인, Millipore사 제조)로 처리함으로써 무균으로 한 것을 이용했다.

그 결과, 락토바실러스 펜토서스 및 락토바실러스 플란타룸에서 증식 배율이 높은 경향이 있고, 그 중에서도 락토바실러스 펜토서스 TUA4337L주는 특히 증식 배율이 높고, 장관 내에서의 증식성이 우수한 것을 알 수 있다.

실시예 2 <생체 내(in vivo) 장관 증식능 평가>

고지방식을 자유 섭취시킨 마우스에게 이하와 같이 조제한 TUA4337L주를 투여하여, 배설되는 균수를 정량했다. 구체적으로는, 이하와 같이 조제한 투여 샘플을 이용하여, 유산균 약 10억 세포(1.0×10⁹ 세포)분(균체 현탁액 250 μL에 상당)을 C57BL/6J 마우스(10 주령, 수컷)에게 오전 10시경에 1회 투여했다(n=5).

<투여 샘플(생균 함유 샘플)의 조제>

〔1〕 TUA4337L주의 글리세롤 스톡으로부터 MRS 배지(30 mL)에 1 v/v% 식균

〔2〕 배양(35℃, 20 hr)

〔3〕 배양액을 원심(8000 rpm, 5 min)하여 상청 제거 후 PBS(-) 30 mL로 현탁

〔4〕 상기〔3〕의 현탁액을 원심(8000 rpm, 5 min)하여 상청 제거 후 PBS(-) 5 mL로 재현탁

〔5〕 현미경으로 균수 카운트

〔6〕 15 mL의 원심관에 200억 세포분의 용액을 분취하고, 원심(8000 rpm, 5 min)하여 상청 제거 후, 액상 사료(고지방식 60 kcal% FAT : Research Diet) 5 mL에 현탁하여 균체 현탁액을 조제(액상 사료는 PBS(-)로 조제)

그 후, 2일분의 전체 분변을 4회로 나눠 회수하고(시험 개시일의 오후, 다음 날 오전과 오후, 다음 다음 날의 오전), 이하의 방법으로 전체 분변당 균수를 정량하여, 각 마우스에서의 TUA4337L주의 장내 증가율(전체 분변당 균수/투여균수)을 산출했다. 결과를 표 4에 나타낸다.

<실시간 PCR에 의한 균수 측정법>

〔1〕 분변 100 mg(습중량)에 대하여 PBS(-) 1 mL를 첨가한 후, 스패튤라를 이용하여 해쇄

〔2〕 분변 100 mg분을 에펜튜브(등록상표)에 채취한 후, 원심(15000 rpm, 5 min)하여 상청 제거 후, PBS(-) 1 mL로 현탁(원심부터 현탁까지의 조작을 2회 반복)

〔3〕 상기〔2〕의 현탁액으로부터 상청 제거 후, 키트(QIAamp DNA Stool Mini Kit : 퀴아젠)를 이용하여 DNA를 추출

(세포 파쇄는, 유리 비드(150∼212 ㎛ : SIGMA) 300 mg, 페놀/클로로포름/이소아밀알코올(25:24:1) 300 μL 및 버퍼 ASL(키트 중의 시약) 900 μL를 첨가하고, MULTI-BEADS SHOCKER MB-200(YASUI KIKAI)로 3000 rpm, 1 min 원심 후, 빙상 1 min 정치의 조작을 3회 반복하는 것으로 행함)

〔4〕 하기에 나타내는 조건의 실시간 PCR에 의해 장관 내용물 중의 유산균을 정량

((실시간 PCR 조건))

(1) SYBR Premix Ex Taq ll(Takara Bio) 10 μL, 각 프라이머(10 μM) 0.8 μL, ROX 레퍼런스 염료(reference Dye) II 0.4 μL, 멸균수 6 μL, DNA 용액 2 μL를 혼합하여 PCR 반응액을 조제한다. 프라이머는 락토바실러스 펜토서스 및 락토바실러스 플란타룸의 16S rDNA를 특이적으로 검출하는 이하의 프라이머를 이용한다(락토바실러스 펜토서스와 락토바실러스 플란타룸의 16S rDNA의 서열은 100% 동일함).

primer 1 : 5'-GCAAGTCGAACGAACTCTGGTATT-3'(서열번호 2)

primer 2 : 5'-CGGACCATGCGGTCCAA-3'(서열번호 3)

(2) PCR은 7500 Real Time PCR System(Applied Biosystems)을 이용하여, 95℃ 30초 후, 95℃ 5초, 60℃ 34초를 1 사이클로 하여, 합계 60 사이클 반응을 행하고, 얻어진 형광 강도와 장관 내용물 합계량과 희석 배율로부터 장관 내용물 1 g 당 카피수를 구한다.

(3) 별도 1 세포당 16S rDNA의 카피수를 구하여 균수로 환산한다. 또, 유산균을 투여하지 않은 마우스에 있어서는, 상기 실시간 PCR에 의해 락토바실러스 펜토서스 및 락토바실러스 플란타룸 모두가 검출되지 않은 것을 확인한다.

그 결과, 락토바실러스 펜토서스 TUA4337L주의 배설물 중에서의 균수는, 섭취한 균수보다 많은 것을 알 수 있었다. 이러한 점에서, 락토바실러스 펜토서스 4337L주가 살아 있는 상태로 위장을 통과한 후, 장관 내에서 증식하여 배출되어 있는 것이 시사되었다.

실시예 3<체중 증가 억제 효과>

C57BL/6J 마우스(8 주령, 수컷)를, 통상식군, 고지방식군, 고지방식+생균군, 고지방식+사균군의 4군으로 나누어(각 n=10), 각각에 이하의 표 5에 나타내는 식이를 32일간 계속하고, 체중을 매일 측정하여 평균치를 산출했다. 평균치의 추이를 도 2에 나타낸다. 또, 군간 비교는 유의 수준 0.05에 의한 t 검정을 이용하여 행했다.

구체적으로는, 식이는 표 5의 각 군에 각각의 고형사료를 자유 섭취시켰다. 고지방식+생균군은, 실시예 2와 동일하게 하여 조제한 투여 샘플을, 고지방식+사균군은, 이하와 같이 하여 조제한 투여 샘플을, 각각 1일당 유산균 약 10억 세포분이 되는 양을 투여했다. 한편, 통상식군에는 유산균이 들어 있지 않은 PBS(-) 250 μL, 고지방식군에는 유산균이 들어 있지 않은 액상 사료 250 μL를 투여했다.

<투여 샘플(사균 함유 샘플)의 조제>

〔2〕 배양(35℃, 20 hr)

〔4〕〔3〕의 현탁액을 원심(8000 rpm, 5 min)하여 상청 제거 후 PBS(-) 5 mL로 재현탁

〔5〕 현미경으로 균수 카운트

〔6〕 15 mL의 원심관에 200억 세포분의 용액을 분취하고, 원심(8000 rpm, 5 min)하여 상청 제거 후, 인공 위액(125 mM NaCl, 7 mM KCl, pH 1.0) 5 mL를 첨가하여 교반후 60 min 방치

〔7〕〔6〕의 용액을 원심(8000 rpm, 5 min)하여 상청 제거 후, 액상 사료(60 kcal% FAT) 5 mL로 현탁하여 균체 현탁액을 조제

결과, 대조군(고지방식군)에 대하여, TUA4337L 생균 투여군에서 유의미한 체중 증가 억제 효과를 나타냈다. 또한 생균 투여는 사균 투여보다 더욱 효과적이었다. 락토바실러스 펜토서스 TUA4337L주가 장관에서 증식한 것에 의해 효과적으로 숙주에 영향을 미쳤다고 생각된다.

실시예 4 <지방 흡수 억제 효과>

실시예 3에서의 통상식군, 고지방식군, 고지방식+생균군의 군 구성으로(각 n=12), 각각에 실시예 3과 동일한 내용의 식이를 2주간 계속했다. 그 후, 하룻밤 절식시킨 후, 올리브 오일(nacalai tesque)을 투여하고(5 mL/kg), 또한 3시간 후에 해부하여 대정맥으로부터 혈청을 채취했다. 혈청 중의 트리글리세라이드(TG)를 트리글리세라이드 E-테스트와코(와코쥰야쿠공업 주식회사)를 이용하여 측정했다. 결과를 도 3에 나타낸다. 또, 군간 비교는, 유의 수준 0.05에 의한 t 검정에 의한 유의차 판정을 행했다.

결과, 통상식군에 대하여 고지방식군에서, 분명히 혈중 TG의 증가 경향이 보였다. 따라서, 고지방식을 계속 먹으면 지방을 흡수하기 쉬운 몸이 되는 것으로 생각된다. 또한, 대조군(고지방식군)에 대하여, TUA4337L 생균 투여군에서 혈중 TG의 증가 억제가 보였다. 따라서, 체중 증가 억제 효과의 하나의 메커니즘으로서 지방 흡수 억제가 고려되고, TUA4337L 생균 투여로부터 1일 후라 하더라도 효과적이었다는 점에서 지속적으로 효과를 발휘한다고 생각된다.

본 발명의 유산균은, 장관 내에서의 증식능을 갖기 때문에, 체내에 섭취하면, 그 유산균이 장관 내에 도달하여 증식함으로써, 지속적으로 지방 흡수를 억제하거나, 효과적으로 체중 증가를 억제하거나 할 수 있어, 다이어트 효과를 목적으로 적합하게 이용된다.

[서열목록 프리텍스트]

서열표의 서열번호 1은, 락토바실러스 펜토서스 TUA4337L의 recA의 염기 서열이다.

서열표의 서열번호 2는, 락토바실러스 펜토서스/플란타룸 특이적 프라이머의 염기 서열이다.

서열표의 서열번호 3은, 락토바실러스 펜토서스/플란타룸 특이적 프라이머의 염기 서열이다.

독립행정법인 제품평가기술기반기구 특허미생물기탁센터

NITEBP-1479

20121210

SEQUENCE LISTING <110> SUNTORY HOLDINGS LIMITED <120> Lactobacillus strain <130> 14-012-PCTJP <150> JP 2013-86575 <151> 2013-04-17 <160> 3 <170> PatentIn version Ver. 3.3 <210> 1 <211> 535 <212> DNA <213> Lactobacillus pentosus 4337L <220> <223> a gene encoding recA of Lactobacillus pentosus 4337L <400> 1 gcgattatgc ggatgggtga cgctgcccag acgaccattt caacaatttc cagcgggtca 60 ctagccttag atgacgcatt aggcgttggt ggttacccac gtggccgaat cgttgaaatt 120 tatggccctg aaagttccgg taaaacgacc gttgcactac acgcggtcgc tgaagttcaa 180 aagcaaggcg ggacggccgc ctatatcgat gctgaaaacg ccttggatcc ggtttacgcg 240 gaacatttag gtgtcaacat tgatgatttg ttactttcac aaccagatac tggtgaacaa 300 ggtcttgaaa tcgcggatgc tttagtttcc agtggcgcgg ttgatatctt agttgtcgat 360 tcagttgcgg cgttagtacc acgggccgaa attgaaggtg aaatgggtga cgcccacgtt 420 ggnttacaag cccggttaat gncacaagcg ttgcggaagt tatccgggac tttgaacaag 480 acaaagacca tcgcactatt tattaaccaa attcgtgaaa aagttggcgt gatgt 535 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for the Lactobacillus pentosus <400> 2 gcaagtcgaa cgaactctgg tatt 24 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for the Lactobacillus pentosus <400> 3 cggaccatgc ggtccaa 17

Claims

장관 내에서의 증식능을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) TUA4337L주(수탁번호 NITE BP-1479).