CN105143438A - 乳杆菌属菌 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种戊糖乳杆菌TUA4337L株(保藏号NITE？BP-1479)，其特征在于，到达肠管内后，具有在小肠和/或大肠内、优选在小肠内的增殖能力。本发明的乳酸菌，由于具有在肠管内的增殖能力，所以当摄入体内时，该乳酸菌到达肠管内并增殖，由此可持续地抑制脂肪吸收及有效地抑制体重增加，从而以减肥效果为目的而被适用。

Description

乳杆菌属菌
技术领域
本发明涉及乳杆菌属菌。更详细而言，涉及一种新型戊糖乳杆菌(Lactobacilluspentosus)。
背景技术
乳酸菌和双歧杆菌中存在具有调整肠胃效果及免疫赋活效果等优异生理活性的物质，根据菌种的特性被用于各种用途。其中，近年来关于通过将这些菌种摄入体内来发挥其减肥效果的研究日益进步，可列举诸多报告。
例如，专利文献1报道如下：鼠李糖乳杆菌ATCC53103株分解成为肥胖原因的脂质(三酰基甘油)，进而抑制其在体内的吸收。并且，作为植物性乳酸菌之一的L.brevisKB290活菌到达肠道内后，肠内存活率及肠管到达性优异(但排泄菌数比摄取菌数少)已为人所知(参照非专利文献1)。另外，非专利文献2关于LactobacillusacidophilusL-92报道如下：根据摄取菌数的93％从粪便回收，可得出该菌株的肠管到达性优异；非专利文献3研究了L.gasseriSBT2055的肠管存活性，并报道当给药100g含1×106～5×106cfu/g的发酵乳时，最多可从粪便中检测出1×105cfu/g左右的L.gasseriSBT2055。
另一方面，关于双歧杆菌报道如下：动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)GCL2505株，具备经口摄取后活菌到达肠道的肠管到达性，同时显示显著的肠管内增殖性(参照专利文献2)。非专利文献4报道如下：针对成人进行B.animalisssp.lactisDN-173010给药时，从粪便中检测出与摄取菌数20％左右的DN-173010。
现有技术文献
专利文献
专利文献1日本国特开2011-206057号公报
专利文献2日本国特开2011-172506号公报
非专利文献
非专利文献1《乳酸菌的保健功能与应用》(日文原名《乳酸菌の保健機能と応用》)2007年8月31日CMC出版160-162页
非专利文献2日本乳酸菌学会杂志(日文原名：日本乳酸菌学会誌)2001年12号“在人肠管内持留性优异的LactobacillusacidophilusL-92株的分离及其性质”(日文原名：ヒト腸管内で生残性の良いLactobacillusacidophilusL-92株の単離とその性質)28-35页
非专利文献3Microbiol.Immunol.2006年50号“MonitoringandsurvivalofLactobacillusgasseriSBT2055inthehumanintestinaltract.”867-870页
非专利文献4J.Mol.Microbiol.Biotechnol.2008年14号“SurvivalofBifidobacteriumanimalisDN-173010inthefaecalmicrobiotaafteradministrationinlyophilizedformorinfermentedproduct-arandomizedstudyinhealthyadults.”128-136页
发明内容
以往，像这样在各种益生菌中研究了其肠管到达性，但关于乳酸菌，或者都停留在报道为与摄取的菌数相等或在其以下的菌数到达了肠管，或者未测定到达肠管的菌数。
另外，由于脂肪的吸收主要是在小肠内进行，所以通常在大肠内增殖的双歧杆菌即使显示了肠管内增殖性，其对脂肪吸收的抑制也不充分。并且，虽然已知乳酸菌在大肠的更上端发挥作用，但在肠管内显示增殖性的菌种尚未见报道。
本发明的课题在于提供一种显示肠管内增殖性的乳酸菌。
本发明涉及保藏号为NITEBP-1479的戊糖乳杆菌TUA4337L株，其特征在于，具有在肠管内的增殖能力。
本发明的乳酸菌取得了在肠管内增殖这样的优异效果。此外，当摄取本发明的乳酸菌时，该乳酸菌通过到达肠管内并增殖，来持续脂肪吸收抑制效果等，菌体的生理活性得到增强，进而，取得了可获得高减肥效果这样的优异效果。
附图说明
图1是表示人工肠液中的筛选结果的图。
图2是表示体重增加进程的图。图中的“*”标记表示相对于高脂肪食物组具有显著性差异(p<0.05)。
图3是表示血清中的甘油三酯量的图。图中的“*”标记表示相对于高脂肪食物组具有显著性差异(p<0.05)。
具体实施方式
本发明的乳酸菌为戊糖乳杆菌TUA4337L株，其特征在于，具有在肠管内的增殖能力。此外，在本说明书中“具有在肠管内的增殖能力”或“在肠管内增殖”，是指到达肠管内后，在小肠和/或大肠内、优选在小肠内进行增殖，增殖能力的程度在如下情况下可评价为“有增殖能力”：即在人工肠液中于37℃下培养6hr时，相对于接种时的OD660显示10倍以上的数值。
本发明者针对本发明者所保有的约480种乳酸菌，进行了在人工肠液中的增殖能力研究，将从中选择的属于戊糖乳杆菌的菌悬液针对动物进行给药时，发现戊糖乳杆菌TUA4337L株的排出菌数与给药菌数相比显著增多，至此完成了本发明。
戊糖乳杆菌TUA4337L株，以识别表示NRIC0883、保藏号NITEBP-1479，于国际保藏日2012年12月10日保藏于独立行政法人制品评价技术基盘机构(NITE)专利微生物保藏中心(日本国千叶县木更津市Kazusa镰足2-5-8)。以下将戊糖乳杆菌TUA4337L株简记为TUA4337L株。
TUA4337L株的菌学性质示于表1及表2。表2的糖的可同化性是用细菌鉴定试剂盒API50CH(BIOMETRIEUX)进行测定的结果。此外，表2中的“+”是指可同化的糖，“-”是指不可同化的糖。
[表1]
菌的形态 杆菌
革兰氏染色性 阳性
运动性 无
孢子 无
芽孢 无
过氧化氢酶反应 无
15℃下的繁殖 ○
40℃下的繁殖 ○
好氧繁殖 ○
厌氧繁殖 ○
繁殖pH 3.0～12.5
[表2]
TUA4337L株将在后述实施例中进行详述，其具有排出菌数相对于摄取菌数增多的特征，即具有肠管内增殖性。另外，作为肠管内增殖性，例如在人工肠液中于37℃下培养6小时后，以培养开始时的菌数为基准时，显示优选10倍以上、更优选15倍以上、进一步优选20倍以上、更进一步优选25倍以上的菌数。
另外，由提取自TUA4337L株的DNA编码的recA基因序列(序列号1)与LactobacilluspentosusIG1株的recA基因序列有99％的同一性。此外，在本说明书中，同一性例如通过使用检索程序BLAST，以得分表示相似度，检索程序BLAST使用的是Altschul等(TheJournalofMolecularBiology，215，403-410(1990))开发的算法。
作为用于培养TUA4337L株的培养基，没有特别限制，可列举通常的含有碳源、氮源、无机盐类、有机营养素等的培养基。另外，也可用琼脂培养基、液体培养基培养。培养温度优选为10～45℃、更优选为15～42℃、进一步优选为28～38℃、进一步优选为35～37℃，可增殖的pH优选为pH3.0～12.5、更优选为pH3.5～12.0。
作为本发明的菌株，可列举乳酸菌(活菌及死菌)本身、乳酸菌含有物、乳酸菌处理物等各种形式。活菌可从该乳酸菌培养液等的乳酸菌含有物中获得。死菌例如可通过对活菌进行加热、紫外线照射、福尔马林处理、酸处理等获得。得到的活菌、死菌可通过进一步磨碎、破碎而成为处理物。另外，从充分发挥在肠管内的增殖效果的观点出发，虽然上述各形式中的乳酸菌优选活菌，但也可混合有死菌。
作为前述乳酸菌，例如，可列举活菌体、湿菌、干菌等。作为前述乳酸菌含有物，例如，可列举乳酸菌悬浮液、乳酸菌培养物(包括菌体、培养上清、培养基成分)、乳酸菌培养液(从菌体培养物中除去固体成分的物质)。另外，作为前述乳酸菌处理物，例如，可列举磨碎物、破碎物、液状物(提取液等)、浓缩物、浆化物、干燥物(喷雾干燥物、冷冻干燥物、真空干燥物、离心干燥物等)、稀释物等。
实施例
以下示出实施例具体说明本发明，但本发明并不受下述实施例的限制。
实施例1<将人工肠液中的增殖能力作为指标的筛选>
本发明者针对保有的乳酸菌中主要为植物性乳酸菌的约480株(包括JCM株)，进行在人工肠液中的增殖能力评价。
具体而言，首先，将各乳酸菌的甘油保存菌分别以1v/v％接种于MRS培养基(DifcoLaboratories)(10mL)中，在35℃下培养16～17hr。接着，用分光光度计UV-1600(岛津制作所)测定各培养液的OD660(660nm处的吸光度)，将100μL用MRS培养基以各培养液的OD660为10制备的培养液接种于下述所示组成的人工肠液(10mL)中。其后，在37℃下缓慢震荡培养6hr，然后测定OD660，并求出增殖倍率(6hr后的OD660/接种时的OD660)。代表性的筛选结果示于表3及图1。
<人工肠液(pH6.45)>
MRS培养基9mL
10w/v％胆汁(和光纯药工业株式会社)溶液1mL
1w/v％胰酶(fromPorcine：SIGMA)100μL
此外，胆汁溶液及胰酶溶液，使用经过0.22μm的滤纸(PVDFmembrane、Millipore公司制)处理的无菌胆汁溶液及胰酶溶液。
[表3]
由结果可知，戊糖乳杆菌及植物乳杆菌有增殖倍率增高的趋势，其中戊糖乳杆菌TUA4337L株增殖倍率尤其高，在肠管内的增殖性优异。
实施例2<体内肠管增殖能力评价>
将如下制备的TUA4337L株，针对自由摄取高脂肪食物的小鼠进行给药，并定量排泄菌数。具体而言，使用如下制备的给药样品，在上午10点左右将约10亿cells(1.0×109cells)份(相当于菌悬液250μL)的乳酸菌针对C57BL/6J小鼠(10周龄，雄性)给药1次(n＝5)。
<给药样品(含活菌的样品)的制备>
〔1〕TUA4337L株的甘油保存菌以1v/v％接种于MRS培养基(30mL)
〔2〕培养(35℃、20hr)
〔3〕将培养液离心(8000rpm、5min)并除去上清后，用30mLPBS(-)悬浮
〔4〕将〔3〕的悬浮液离心(8000rpm、5min)并除去上清后，用5mLPBS(-)再悬浮
〔5〕用显微镜计数菌数
〔6〕在15mL离心管中分取200亿cells份的溶液，离心(8000rpm、5min)并除去上清后，悬浮于5mL液状饲料(高脂肪食物60kcal％FAT：ResearchDiet)中，从而制备菌悬液(液状饲料用PBS(-)制备)
其后，将2天的全糞便分4次进行回收(试验开始日的下午、次日上午和下午、次次日的上午)，用以下方法定量各份全糞便的菌数，计算各小鼠中的TUA4337L株的肠内增加率(各份全糞便的菌数/给药菌数)。结果示于表4。
<通过实时PCR的菌数测定法>
〔1〕相对于100mg(湿重)糞便添加1mLPBS(-)后，用刮刀破碎
〔2〕用Eppendorf管(注册商标)采取100mg份糞便后，离心(15000rpm、5min)并除去上清，再用1mLPBS(-)悬浮(重复从离心到悬浮的操作2次)
〔3〕从〔2〕的悬浮液中除去上清后，用试剂盒(QIAampDNAStoolMiniKit：QIAGEN)提取DNA
(通过重复以下操作3次进行细胞破碎：添加300mgGlassbeads(150～212μm：SIGMA)、300μLphenol/chloroform/isoamylalcohol(25：24：1)以及900μLbufferASL(试剂盒中的试剂)，用MULTI-BEADSSHOCKERMB-200(YASUIKIKAI)进行3000rpm、1min离心后，在冰上静置1min)
〔4〕由下述所示条件的实时PCR定量肠管内容物中的乳酸菌
(实时PCR条件)
(1)将10μLSYBRPremixExTaqll(TakaraBio)、0.8μLeachprimer(10μM)、0.4μLROXreferenceDyeII、6μL灭菌水、2μLDNA溶液混合，从而制备PCR反应液。引物采用特异性检测戊糖乳杆菌及植物乳杆菌的16SrDNA的以下引物(戊糖乳杆菌和植物乳杆菌的16SrDNA序列为100％同一)。
primer1：5’-GCAAGTCGAACGAACTCTGGTATT-3’(序列号2)
primer2：5’-CGGACCATGCGGTCCAA-3’(序列号3)
(2)PCR使用7500RealTimePCRSystem(AppliedBiosystems)，95℃、30秒后，以95℃、5秒，60℃、34秒作为1个循环，进行共计60个循环反应，从获得的荧光强度、肠管内容物的总量和稀释倍率中，求得每1g肠管内容物的拷贝数。
(3)另外求得每1个cell的16SrDNA的拷贝数，并换算成菌数。此外，确认了未进行乳酸菌给药的小鼠中，通过前述实时PCR均未检测到戊糖乳杆菌及植物乳杆菌。
[表4]
由结果可知，戊糖乳杆菌TUA4337L株在排泄物中的菌数比摄取的菌数多。由以上可示意戊糖乳杆菌4337L株以活菌状态经过胃后，在肠管内增殖并被排出。
实施例3<体重增加抑制效果>
将C57BL/6J小鼠(8周龄，雄性)分为以下4组：通常食物组、高脂肪食物组、高脂肪食物+活菌组、高脂肪食物+死菌组(各n＝10)，持续32天分别喂食以下表5所示食物，每天测定体重并计算平均值。平均值的推移如图2所示。此外，组间比较采用显著水平0.05的t检验来进行。
具体而言，由表5中的各组自由摄取各自的固体食物。高脂肪食物+活菌组为与实施例2同样进行制备的给药样品、高脂肪食物+死菌组为如下进行制备的给药样品，分别进行乳酸菌每天约10亿cells份的量的给药。另一方面，通常食物组中为250μL不加乳酸菌的PBS(-)、高脂肪食物组中为250μL不加乳酸菌的液状饲料，进行给药。
[表5]
*10kcal％FAT(ResearchDiet)
60kcal％FAT(ResearchDiet)
<给药样品(含有死菌的样品)的制备>
〔1〕TUA4337L株的甘油保存菌以1v/v％接种于MRS培养基(30mL)
〔2〕培养(35℃、20hr)
〔3〕将培养液离心(8000rpm、5min)并除去上清后，用30mLPBS(-)悬浮
〔4〕将〔3〕的悬浮液离心(8000rpm、5min)并除去上清后，用5mLPBS(-)再悬浮
〔5〕用显微镜计数菌数
〔6〕用15mL的离心管分取200亿cells份的溶液，离心(8000rpm、5min)并除去上清后，添加5mL人工胃液(125mMNaCl、7mMKCl、pH1.0)搅拌后静置60min
〔7〕将〔6〕的溶液离心(8000rpm、5min)并除去上清后，用5mL液状饲料(60kcal％FAT)悬浮，从而制备菌悬液
结果，相对于对照(高脂肪食物组)，显示了TUA4337L活菌给药组的显著的体重增加抑制效果。并且活菌给药比死菌给药更有效。认为戊糖乳杆菌TUA4337L株通过在肠管内增殖，有效地对宿主产生了影响。
实施例4<脂肪吸收抑制效果>
以实施例3中的通常食物组、高脂肪食物组、高脂肪食物+活菌组的组结构(各n＝12)，持续2周分别喂食与实施例3相同内容的食物。其后，禁食过夜后，进行橄榄油(nacalaitesque)给药(5mL/kg)，并且在3小时后解剖，从大静脉采集血清。用甘油三酯E-testWako(和光纯药工业株式会社)测定血清中的甘油三酯(TG)。结果示于图3。此外，组间比较由显著水平0.05通过t检验进行显著差异判定。
结果，相对于通常食物组，高脂肪食物组的血中TG的显著增加趋势得到了确认。因此会认为如果持续食用高脂肪食物，则会成为易于吸收脂肪的体质。此外相对于对照(高脂肪食物组)，TUA4337L活菌给药组的血中TG的增加抑制得到了确认。因此，可推测脂肪吸收抑制是体重增加抑制效果的机理之一，并且由TUA4337L活菌给药开始1天后就已经有效，可推测为持续发挥效果。
产业上的可利用性
本发明的乳酸菌具有在肠管内的增殖能力，所以当摄入体内时，该乳酸菌通过到达肠管内后的增殖，可持续地抑制脂肪吸收及有效地抑制体重增加，从而可以减肥效果为目的而被适用。
序列表自由内容
序列表的序列号1为戊糖乳杆菌TUA4337L的recA的碱基序列。
序列表的序列号2为戊糖乳杆菌/植物乳杆菌特异性引物的碱基序列。
序列表的序列号3为戊糖乳杆菌/植物乳杆菌特异性引物的碱基序列。

Claims (1)

1.保藏号为NITEBP-1479的戊糖乳杆菌TUA4337L株，其特征在于，具有在肠管内的增殖能力。
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