CN101068918B - 具有减少身体脂肪活性的鼠李糖乳杆菌以及包含它们的食品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有减少身体脂肪的活性的乳酸杆菌菌株并提供了鼠李糖乳杆菌菌株PL60KCCM-10654P。本发明的菌株可以直接用作减少身体脂肪的功能食品，或者可以用作减少身体脂肪的功能食品的添加剂、或者减少身体脂肪的功能发酵食品的发酵起始菌株。本发明的菌株产生的抑制身体脂肪的物质可加以分离以被利用。另外，在利用所述菌株来生产发酵食品的情况下，本发明提供了能够具有最大程度减少身体脂肪的作用的条件。

Description

具有减少身体脂肪活性的鼠李糖乳杆菌以及包含它们的食品
技术领域
本发明涉及具有减少身体脂肪活性的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)和包含它们的食品。本发明提供了具有减少身体脂肪活性的乳酸杆菌菌株。本发明还提供了含有具有减少身体脂肪作用的CLA的活的生物、死的生物、破碎的细胞壁部分、培养液、干燥的培养液、培养物提取物(其均由本发明的乳酸杆菌菌株产生)，以及包含它们的减少身体脂肪的功能食品和食品添加剂。另外，本发明提供了利用具有减少身体脂肪作用的乳酸杆菌菌株作为起始菌株(starter strain)或添加剂的减少身体脂肪的功能食品和饮料。此外，本发明提供了一种含有本发明的乳酸杆菌菌株的具有减少身体脂肪作用的药物。
另外，本发明提供了在利用本发明的菌株生产发酵食品时能够最大程度减少身体脂肪作用的条件。
背景技术
在现代社会中，肥胖症是具有比癌症更低的完全治愈比例的疾病，并且增加了死亡率以及由此产生的各种成人疾病。在美国，它已经带来了足以使公众与肥胖症进行斗争的严重问题。许多材料被宣称是对预防和治疗肥胖症有效的物质，但是直到目前，根据科学原理，仅有丙酮酸和共轭亚油酸(CLA)被证明是有效的(Lenz TL，Hamilton WR.Supplemental products used for weight loss.2004.J AmPharm Assoc(Wash DC)44：59-67)。有研究表明减少身体脂肪的机制是通过诱导脂肪细胞的凋亡来减少脂肪细胞的数量、减少脂肪细胞的大小、减少能量和食品的摄取、减少脂肪的产生、增加能量的消耗、分解脂肪活性、增加脂质氧化等(Chardigny JM，Hasselwander O，Genty M，Kraemer K，Ptock A，Sebedio J L.2003，Effect of conjugatedFA on feed intake，body composition，and liver FA in mice.Lipids.38(9)：895-902)。
CLA(c9t11-十八碳二烯酸、t10c12-十八碳二烯酸)是通过亚油酸(LA，C18:2顺式9顺式12)的异构化形成的。根据双键的位置，已知CLA具有抗氧化作用、降低胆固醇作用、生长促进作用、以及抗癌作用。最近，已知CLA具有减少身体血浆脂质、减少身体脂肪等作用。已报道CLA可以在动物肉类、发酵牛奶等中存在。动物实验和临床试验已经证明：CLA异构体中的c9，t11-CLA尤其具有减少身体脂肪的作用。最理想地，c9t11-CLA和t10c12-CLA最优选以同样的量生产。
溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibriosolvents)是首先发现的生产CLA的厌氧性微生物，其从反刍动物(如奶牛)中分离出来。它通过两个步骤对LA的生物氢化产生反-11-十八碳烯酸。在对产生的共轭酸进行氢化以产生反-11-十八碳烯酸之前，通过亚油酸异构酶的作用产生顺-9，反-11-十八碳二烯酸。
根据2004年的最新挪威研究(Gaullier JM，Halse J，Hoye K，Kristiansen K，Fagertun H，Vik H，Gudmundsen O.2004.Conjugatedlinoleic acid supplementation for 1 y reduces body fat mass in healthyoverweight humans.Am J Clin Nutr.79(6)：1118-1125)，当将CLA给予180个超重者达一年时，导致4-10％的重量减轻同时没有副作用。
本发明选择并鉴定了过度生产t10c12-CLA的具有减少身体脂肪作用的韩国型乳酸杆菌菌株，确认了菌株的前生命期的特性，如肠内适应性等，并且通过实施证实重量减少的动物试验找到了该菌株能够最大程度生产CLA的条件以及具有减少身体脂肪作用的乳酸杆菌菌株。
发明内容
[技术问题]
因此，鉴于上述问题，形成了本发明，并且本发明的一个目的是提供生产CLA的菌株。
本发明的菌株是鼠李糖乳杆菌菌株PL60，保藏编号为KCCM-10654P，于2005年5月9日在韩国微生物培养中心保藏。
本发明的另一目的是提供能够减少身体脂肪的乳酸杆菌菌株。
本发明的另一目的是通过减少身体脂肪来预防或治疗各种成人疾病。
本发明的又一目的是提供生产最大量的具有减少身体脂肪作用的CLA的条件。
本发明的又一目的是提供一种菌株，其具有减少身体脂肪的作用、对肠道具有良好的粘附性、以及对酸和胆汁具有强的耐受性。
本发明的又一目的是提供作为前生命期的乳酸杆菌菌株，其不转移抗生素耐受性并且是无害的。
乳酸杆菌菌株可以制成各种组合物，优选这些组合物是合成形式，如胶囊、片剂、粉剂等以及能够被加入到各种食品中的便利形式。
这些制剂可以通过已知的方法，利用药学上可接受的载体、赋形剂、溶剂或添加物来制备。这些方法和成分是熟知的，并且详细地披露在标准教科书和手册中，例如出版物(Remington.1995.TheScience and Practice of Pharmacy.Mack Publishing Co.Easton，PA18042，USA)，其通过引用方式并入本文中。
含有乳酸杆菌菌株的助消化食品可以通过本领域熟知的方法来制备。
具有减少身体脂肪作用的食品和饮料可以通过本领域熟知的方法，利用所述菌株作为包含发酵奶制品的发酵食品的起始菌株或添加物来制备。
具有最大程度减少身体脂肪作用的发酵食品可以利用本文提供的条件生产。
在下文中，将更详细的解释本发明。
[技术方案]
根据本发明的一个方面，上述和其他目的可以通过提供具有减少身体脂肪的功能食品来实现。
根据本发明的另一方面，提供了能够减少身体脂肪的鼠李糖乳杆菌菌株PL60KCCM-10654P。
根据本发明的另一方面，提供了包含1×106-1×1011CFU/g的量的鼠李糖乳杆菌菌株PL60KCCM-10654P的减少身体脂肪的功能食品，以便利用减少身体脂肪的作用来预防和治疗成人疾病。
根据本发明的另一方面，提供了包含鼠李糖乳杆菌菌株PL60KCCM-10654P的食品和饮料添加剂。
根据本发明的另一方面，提供了利用鼠李糖乳杆菌菌株PL60KCCM-10654P能够在发酵食品中获得最大程度的减少身体脂肪作用的条件。
在下文中，将通过参照本发明的优选具体实施方式的实施例来更详细地描述本发明，然而，其不应被解释为以任何方式限制本发明。
[有益效果]
本发明的鼠李糖乳杆菌菌株PL60具有减少身体脂肪的作用，而能够预防或治疗由肥胖引起的疾病。另外，本发明的干燥鼠李糖乳杆菌菌株PL60和鼠李糖乳杆菌菌株PL60培养滤液、干燥培养滤液可以用作各种食品和饮料的添加剂，以用于预防和治疗身体肥胖，因此可以用于预防和治疗所有肥胖相关疾病。此外，利用本发明的所述鼠李糖乳杆菌菌株PL60的发酵食品可以通过减少身体脂肪作用来预防和治疗肥胖症。
另外，根据本发明，鼠李糖乳杆菌菌株PL60必须是在含有LA的培养基中初步培养的，以便生产最多的CLA。LA的含量为100-1000ppm，吐温-80的含量为1～0.1％，并且糖类优选果糖、蔗糖、和乳糖，最优选果糖，以便利用鼠李糖乳杆菌菌株PL60的发酵食品具有最大程度的减少身体脂肪作用。
附图说明
通过以下结合附图的详细说明将更清楚地理解本发明的上述和其他目的、特征和其他优点，其中：
图1是鉴定由鼠李糖乳杆菌菌株PL60生产的CLA的气相色谱图。
图2是鼠李糖乳杆菌菌株PL60的显微照片。
图3示出了鼠李糖乳杆菌菌株PL60的16S rRNA序列。
图4是利用多重PCR鉴定鼠李糖乳杆菌菌株PL60的带状图。
图5示出了鼠李糖乳杆菌菌株PL60对Caco-2细胞的适应性(adaptation)的实验结果。
图6a和6b示出了鼠李糖乳杆菌菌株PL60对人肠道的粘附性的实验结果。
图7为示出了将鼠李糖乳杆菌菌株PL60口服给予人后分离的菌落的PCR结果的带状图。
图8示出了服用鼠李糖乳杆菌菌株PL60的大鼠的体重变化。
图9示出了服用鼠李糖乳杆菌菌株PL60后第10周的各组大鼠的体重的比较图。
具体实施方式
实施例1：筛选能够生产共轭亚油酸(下文中称作CLA)的乳酸杆菌菌株
为了选择生产CLA的菌株，筛选在含有LA(CLA的底物)的培养基中生长的乳酸杆菌菌株。然后，确认它们是否表达异构酶(-种涉及生产CLA的酶)。
<材料和方法>
首先，选择在含有亚油酸(LA)的培养基中生长的乳酸杆菌菌株，在其中筛选生产CLA的乳酸杆菌菌株。为此，通过利用异构酶测定可以从大量的乳酸杆菌菌株中容易地筛选生产CLA的菌株(Ogawa J，Matsumura K，Kishino S，Omura Y，and Shimizu S.2001.Conjugated linoleic acid accumulation via10-Hydroxy-12-octadecaenoic acid during microaerobic transformationof linoleic acid by Lactobacillus acidophilus.Appl.Envir.Microbiol.67：1246-1252)。首先，初步选择在含有0.1％LA的MRS培养基中生长的乳酸杆菌菌株。然后，这些乳酸杆菌菌株在MRS肉汤培养基中进行二次传代培养，并在含有0.1％LA 10mL的MRS肉汤培养基中培养2天。在用0.1M磷酸钾缓冲溶液(pH 7.0)洗涤细胞之前，将5mL的培养基在8000rpm下离心10分钟以收集细胞。再次，向其中加入0.1M磷酸钾缓冲溶液(pH 7.0)1.0mL，随后利用超声破碎机(ultrasonic breaker)在冰冷状态下每3分钟破碎并离心混合物，以获得粗制的酶溶液。将该粗制的酶溶液加入到底物溶液中(LA0.1mL、0.1M磷酸钾缓冲溶液2.7mL、以及1，3-丙二醇0.2mL)，以在233nm处测量吸光度。
<结果与讨论>
利用异构酶试验从超过200个乳酸杆菌菌株中筛选出产生CLA的乳酸杆菌菌株。
实验实施例1：利用气相色谱法鉴定CLA的生产
为了证实通过表达异构酶的乳酸杆菌菌株实质上产生了多少CLA，利用气相色谱确定产生的CLA的量。
<材料和方法>
将乳酸杆菌备选菌株接种到含有LA的MRS液体培养基中，然后在37℃下培养该混合物24-48小时之前。用十七酸和氯仿∶甲醇的混合物提取培养的培养基(medium)。提取物用硫酸钠处理，以除去湿气(水分)，随后蒸发。将1N氢氧化钠(甲醇中)加入到制备的样品中，随后在100℃下皂化该样品15分钟之前。向其中加入4％HCl(甲醇中)以甲基化。将己烷∶水(1∶1，v/v)加入到该甲基化的样品中，随后混合并离心。利用氮气带走有机溶剂部分以除去有机溶剂，随后将该样品溶解在1mL己烷中。
根据本发明，通过具有火焰电离检测器(FID)的气相色谱(Hewlett Packard 5890 Series II GC)在除去氧化物之前和之后测量每个样品内的CLA含量。所用的毛细管柱(DB FFAP毛细管柱)具有30m的长度、0.25μm的内径、以及0.25μm的膜厚度。将该柱设置在GC中后，在以下条件下使用GC：炉温(柱温)(210℃)；检测器温度(270℃)；进样温度(250℃)；载气(氦(1mL/min))；分流比(50∶1)；以及进样量(2μ1)。每个峰面积利用与GC相连的积分仪(3395，Hewlett Packard)来计算。鉴定CLA，与标准物质的保留时间进行比较。十七酸用作内部标准物质以便测量CLA含量(Lin，T.Y.2000.Conjugated linoleic acid concentration as affected bylactic cultures and additives，Food Chemistry 69.27-31)。
<结果和讨论>
如图1的气相色谱图所示，分离的乳酸杆菌菌株生产CLA的c9t11和t10c12两种异构体。如果以ppm表示具有减少身体脂肪作用的t10c12CLA的产量，则鼠李糖乳杆菌菌株PL60产生的t10c12CLA的量为43.25ppm，并且与所报道的路氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)和发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)(其生产的CLA的量分别为30ppm和28ppm)相比，其具有更优异的生产能力。
实验实施例2：乳酸杆菌菌株的鉴定：革兰氏染色、利用API 试剂盒、16SrRNA序列 分析、多重PCR检测进行鉴定
为了鉴定生产CLA的乳酸杆菌菌株，要确认它们对革兰氏染色是否表现出革兰氏阳性以及过氧化氢酶阴性。利用API试剂盒进行各种生物化学和生理学试验，并且分析和鉴定16S rRNA序列。另外，为了把紧密相关的物种进行分类，通过多重PCR检测利用种群特异性引物鉴定菌株。
1.革兰氏染色
将菌株在载玻片上涂片并热固定，然后在其上加入结晶紫溶液，反应约1分钟。所得的载玻片用碘溶液处理以便洗去多余的染料，随后在其上加入碘，处理1分钟。所得的载玻片用95％乙醇脱色30秒，然后用水洗涤2-3秒，用吸管(吸盘)除去水。所得的载玻片用番红精0溶液处理10-30秒用于复染(counter stain)。所得的载玻片用水小心漂洗直到染料不再出来，随后用吸管干燥所得的载玻片，滴上一滴浸渍用油以便通过显微镜观察。
<结果与讨论>
如图2所示，生产CLA的乳酸杆菌菌株表现为革兰氏阳性。
2.利用API试剂盒进行生物化学和生理学试验
在确认菌株是否为完全分离后，在30℃或37℃下，在MRS培养基中培养该菌株24小时。将它们在MRS肉汤培养基中超过两次传代培养，随后从MRS培养基分离菌落。悬浮培养基安瓿瓶被打开以利用棉球制备具有极高浊度的重悬浮液。制备的菌株溶液被逐滴滴入5mL该悬浮培养基直到浊度达到2McFarland。含有该菌株的API 50CHL培养基被分入条形管中并在30℃或37℃、需氧条件下培养48小时。如果产酸，则API试剂盒通过该培养基中的溴甲酚紫指示剂使培养基变为适度的淡黄色。如果在Esculin试验(第25号管)中的颜色从紫色变为黑色，则意味着是阳性反应。
<结果与讨论>
如表1所示，利用API 50CH试剂盒的试验结果表明本发明的乳酸杆菌菌株与鼠李糖乳杆菌和类干酪乳杆菌(Lactobacillus paraparacasei)具有类似性，但是没有对其以％进行评价。
[表1]利用API CH50试剂盒鉴定乳酸杆菌菌株的结果
Figure G2005800270866D00101
3.利用16S rRNA序列分析的鉴定
分离基因组DNA以扩增其16S核糖体DNA片断，随后通过电泳确认扩增的DNA片断。利用Qiagen PCR纯化试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)来纯化DNA片断以便与含有d-若丹明染料标记的dd-NTP的反应溶液混合，随后进行直接测序以利用乙醇/醋酸钠沉淀来纯化获得的DNA。将纯化的DNA溶解在TSR(模板抑制试剂)中以便用ABI棱镜(prism)310基因分析仪(PE AppliedBiosystems，U.S.A)进行分析。利用基因库(Genebank)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)来鉴定所分析的序列。
<结果与讨论>
作为分析生产CLA的乳酸杆菌菌株的结果(图3)，其表现出与鼠李糖乳杆菌842/844(99％)和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)(99％)的相似性。
4.利用多重PCR的鉴定
为了确认PL60菌株是否为鼠李糖乳杆菌或干酪乳杆菌(类干酪乳杆菌)，在进行多重PCR检测后，将从PL60菌株获得的DNA片段与它们的DNA片断进行比对(Song，Y.，N.Kato，C.Liu，Y.Matsumiya，H.Kato，and K.Watanabe.2000.Rapid identification of 11human intestinal Lactobacillus species by multiplex PCR assays usinggroup-and species-specific primers derived from the 16S 23S rRNAintergenic spacer region and its flanking 23S rRNA.FEMS Mictrobiol.Letters，187：167-173)。为此，利用含有1x反应缓冲剂、200μM的dNTP、0.15单位的Taq聚合酶、10pmol的引物(LU-5，CTA GCG GGTGCG ACT TTG；Lpar-4，GGC CAG CTA TGT ATT CAC TGA；Rha II，GCG ATG CGA ATT TCT ATT ATT)、以及20ng的DNA的混合物，以30μl的最终量实施PCR反应。该PCR反应包括以下步骤：使该混合物反应，重复循环35次，该循环包括在95℃20秒、62℃2分钟，以及在74℃2分钟；使该混合物在72℃下反应10分钟；以及在4℃下保存产物。利用0.5x TBE(0.045M三硼酸盐，0.001MEDTA)缓冲溶液将该PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳20分钟，随后观察展开的DNA片段的图案。
<结果与讨论>
作为多重PCR检测的结果，鼠李糖乳杆菌菌株和PL60菌株产生113bp的DNA片段，而类干酪乳杆菌ATCC 25302产生312bp大小的DNA片段(如图4所示)。因此，PL60菌株被鉴定为鼠李糖乳杆菌。直到现在，生产CLA的鼠李糖乳杆菌菌株仍未有报道。本发明首次报道了生产CLA的鼠李糖乳杆菌菌株。
实验实施例3：鼠李糖乳杆菌的肠道适应性
为了用作前生命期物(probiotic)，它必须对酸和胆汁具有强的耐受性，并且对肠道细胞具有良好的适应性。应该通过人实验来确定肠道适应性。
1.耐酸性试验
为了知晓pH是否影响所选菌株的存活性，在利用10N HCl调整pH为7.0、4.8和4.5后，使用MRS(DeMan-Rogosa-Sharpe)培养基。活化的菌株溶液(OD＝2.0)以2％的量接种至MRS培养基并在37℃下培养24小时，随后在600nm处测量吸光度。利用所测得的吸光度考察pH是否影响所选菌株的生长。pH7.0的OD被稀释至1/10以测量并记录吸光度(Conway PL，Gorback SL，Goldin BR，1987.Survival of lactic acid bacteria in the human stomach andadhesion to intestinal cells.J.Dairy Sci.70：1-12)。
<结果与讨论>
作为低酸存在下的存活性实验结果，即使所述菌株被处理24小时，它们仍存活，因此对酸具有强的耐受性，如表2所示。
[表2]鼠李糖乳杆菌菌株PL60的耐酸性实验结果(在600nm处的OD)
  时间   0hr   3hr   6hr   24hr
  PH7.0   0.022   0.069   0.467   8.080
  PH4.8   0.036   0.063   0.249   6.850
  PH4.5   0.029   0.064   0.200   5.820
2.胆汁耐受性试验
为了知晓胆汁是否影响所选菌株的生长，将牛胆(ox-gall)(OXOID)以0.125％和0.25％的量加入MRS(DeMan-Rogosa-Sharpe)培养基以消毒灭菌。活化的菌株溶液(OD＝2.0)以2％的量被接种至该无菌的培养基并在37℃下培养24小时，随后在600nm处测量吸光度。0％胆汁中的OD被稀释至1/10以测量并记录吸光度(Ibrahim SA，Bezkorovainy A.1993.Survival of bifidobacteria inthe presence of bile salt.J.Sci.Food Agric.62：351-354)。
<结果和讨论>
健康人的小肠内具有0.06％的胆汁浓度。该菌株甚至在0.250％的胆汁中仍存活，因此具有强的胆汁耐受性。
[表3]
  时间   0hr   3hr   6hr   24hr
  胆汁0.000％   0.022   0.069   0.467   8.080
  胆汁0.250％   0.007   0.038   0.335   3.570
3.肠道粘附性试验
为了知晓对人肠道的粘附性，将鼠李糖乳杆菌菌株PL60粘附至来源于肠上皮细胞的Caco-2细胞系。为此，将Caco-2细胞系在含有2.7g/L碳酸氢钠、20％(v/v)的胎牛血清(FBS)和抗生素antimicotics的DMEM培养基(pH 7.0)中进行培养。将3×105个细胞接种至30mm皮氏培养皿中的2mL培养基中，以培养为单层。该培养基每2天更换一次。6天后，用2mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)漂洗该细胞单层两次。将1×107个细胞的该乳酸杆菌菌株悬浮在2mL的培养基中并加入到皮氏培养皿，随后在5％CO2-95％空气下、在37℃下培养该混合物达60-90分钟。用无菌的PBS漂洗该细胞两次并用甲醇固定10分钟。在革兰氏染色后通过光学显微镜观察它们。在100倍显微镜下观察20个视野用于定量分析。计数粘附菌株的数量并以每100个Caco-2细胞粘附的菌株数量表示(Bibiloni R，Perez PF，DeAntoni GL.1999.Anaerobe 5，483-485；Edited by R.Fuller(1997)Probiotics 2，10-22)。
<结果与讨论>
如图5所示，鼠李糖乳杆菌菌株PL60对Caco-2细胞具有良好的粘附性。如果用20个视野来计算每个视野的粘附菌株的数量来计算每个视野的粘附菌株的平均数量，则每个视野粘附了59.29±5.33个乳酸杆菌菌株。这意味着每个培养皿中超过4000个乳酸杆菌菌株粘附至这些细胞，具有比常见的乳酸杆菌菌株更好的肠道粘附性。
4.对人肠道的适应性试验
为了确定乳酸杆菌菌株在人大量服用它们后是否对肠道适应，以1010CFU的量口服鼠李糖乳杆菌菌株PL60，每天一次，服用8天。次日，在MRS(具有1％溴代酚蓝，30μg/mL万古霉素)中培养粪便48小时。所有类似的菌落通过革兰氏染色来考察、传代培养、以及完全分离。利用完全分离的菌落进行种群特异性PCR试验。
<结果与讨论>
如图6所示，在服用鼠李糖乳杆菌菌株PL60后一到六天进行检测并在检测到后立即停止服用。通过种群特异性PCR试验证明所检测的乳酸杆菌菌落为鼠李糖乳杆菌(图7)。这证明鼠李糖乳杆菌菌株PL60适应肠道。尤其是，如图6所示，认为在给予鼠李糖乳杆菌菌株PL60后，通过肠道内的细菌群落的事实进行的判断变得更简单，该乳酸杆菌菌株具有肠道调节性。
实验实施例4：乳酸杆菌菌株的安全性试验
对于人服用量，应该进行乳酸杆菌菌株的安全性试验。为此，要确认乳酸杆菌菌株是否产生毒性物质，如氨、吲哚、溶血素等，以及有毒的酶是否存在。
1.溶血试验
当将鼠李糖乳杆菌菌株PL60被接种入羊血琼脂中并在37℃下培养24小时时，仅发现α-溶血作用，未发现β-溶血作用。
2.明胶液化试验
将鼠李糖乳杆菌菌株PL60接种入由MRS明胶培养基(0.3g浓缩牛肉汁、0.5g蛋白胨、12g明胶、以及100mLMRS肉汤)制成的斜面培养基中并在35℃下培养6周。当它与对照一起在4℃冷却大约4小时以检查明胶液化时，由于没有观察到明胶液化，因此认为明胶酶不存在。
3.氨形成试验
将尿素琼脂培养基(尿素20g、NaCl 5g、KH2PO42g、蛋白胨1g、葡萄糖1g、苯酚12mg、以及蒸馏水100mL)过滤并灭菌，随后将15g琼脂溶解在900mL蒸馏水中以被湿灭菌(wet-sterilized)，并与制备的尿素琼脂培养基混合以调节总体积至1L(pH 6.9)。将鼠李糖乳杆菌菌株PL60接种至其上并在37℃下培养约12小时，随后观察该培养基的颜色变化。因为黄色培养基意味着阴性，因此证明鼠李糖乳杆菌菌株PL60不产氨。
4.吲哚形成试验
将鼠李糖乳杆菌菌株PL60接种到含0.1％胰胨的MRS琼脂中并培养约18小时。当加入5滴Kovac试剂(p-二甲氨基苯甲醛10g、丁醇150mL、以及盐酸50mL)后，没有颜色变化。这表明没有产生吲哚。
5.苯丙氨酸脱氨试验
将鼠李糖乳杆菌菌株PL60接种至含0.2％D，L-苯丙氨酸的MRS培养基中并培养约24小时。在将5-10滴10％氯化铁滴落其上以流到斜面培养基上后，在1-5分钟内观察到颜色改变。在阳性反应的情况下，则产生的苯丙酮酸与氯化铁反应而使培养基呈现绿色。鼠李糖乳杆菌菌株PL60表现出阴性反应。
6.β-葡糖醛酸糖苷酶试验
将p-硝基苯基-β-D-葡糖苷酸溶解在0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.0)中至0.2％的浓度。将鼠李糖乳杆菌菌株PL60悬浮在磷酸盐缓冲液中至Ab600＝4以形成悬浮液。将具有基质(底物)的200μl缓冲溶液加入到200μl所述悬浮液中并在37℃下处理16小时。如果培养液变黄，则为阳性。然而，这个试验表现为阴性反应。将该培养液离心以获取上清液。在405nm处确定该上清液的吸光度为0.078。
7.硝基还原酶活性试验
在MRS液体培养基中过夜培养的鼠李糖乳杆菌菌株PL60在3000xg下离心10分钟以收集生物质(菌体，biomass)，随后声波处理该生物质5分钟。将4-硝基苯甲酸(最终浓度为300μg/mL)和三氯乙酸(最终浓度为0.21％)加入到该上清液中并在37℃下处理1小时，随后加入亚硝酸钠(最终浓度为0.007％)以在室温下处理20分钟。其中加入氨基磺酸铵(最终浓度为0.04％)并在室温下处理3分钟。向其加入NEDD(N-(1-萘基)乙二胺二盐酸盐)(最终浓度为0.35％)并在4℃下生长。当在540nm的分光光度计下观察生长的上清液时，它表现为阴性反应。将它与由加入1μg/mL 4-氨基苯甲酸获得的阳性反应进行比较。
8.抗生素耐受性
前生命期物具有的抗生素耐受性越强，则在肠内的存活能力越强。因此，抗生素耐受性越强，则越好。然而，如果抗生素耐受性转移，则会导致耐受性问题。要确认抗生素耐受性是否转移至其它细菌。
[表4]鼠李糖乳杆菌菌株PL60的抗生素耐受性
  抗生素   生长抑制的直径(mm)
  氨苄青霉素   21
  羧苄青霉素   25
  头孢哌酮(Cefoperazone)   22
  头孢金素(Cephalothin)   20
  氯霉素   24
  氯林肯霉素   26
  红霉素   28
  抗生素   生长抑制的直径(mm)
  庆大霉素   10
  苯甲异噁唑青霉素   8
  青霉素   25
  哌拉西林   30
  利福平   24
  链霉素   11
  四环素   29
  Trimethpprime/磺胺甲噁唑   6
  万古霉素   6
9.抗生素耐受性的转移试验
为了考察抗生素耐受性的转移，实施了滤器结合测定(Givers，D.，G.Huys，and J，Swings.2003.In vitro conjugal transfer oftetracycline resistance from Lactobacillus isolates to otherGram-positive bacteria.FEMS Microb.Letters 225：125-130)。将鼠李糖乳杆菌菌株PL60培养至对数生长期中期(约4-5小时)。将1mL培养菌株与1mL粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CCARM 5510混合，随后通过无菌的醋酸纤维素滤器过滤该混合物以用PPS(蛋白胨生理盐水溶液)洗涤。滤纸放在非选择性琼脂培养基上并在37℃下培养16小时。在该滤纸上生长的生物质用2mLPPS洗涤并与该滤纸分离，随后稀释该生物质以接种至含有各种抗生素的Enterococcosal选择性培养基中并在37℃下培养24-48小时。观察是否存在具有抗生素耐受性的粪肠球菌，但在培养物中不存在具有抗生素耐受性的粪肠球菌。这说明抗生素耐受性没有转移。
[用于本发明的实施方式]
实施例2：用于生产CLA的最佳条件
我们找到了可以最大程度地生产CLA的LA的浓度和基质(底物)的种类。
1.能够最大程度生产CLA的LA的浓度
由于高浓度的LA抑制细菌自身的生长，因此LA不能以高浓度加入培养基中。另外，为了节约培养基上消耗的LA，找到了能够最大程度生产CLA的LA的浓度。
<材料和方法>
将各种浓度的水溶性LA酯加入脱脂乳培养基和MRS培养基并过夜培养，随后测量在介质中产生的CLA的量。为此，提取培养基中的脂质并甲基化，然后利用GC来测量产生的CLA的量。为此，将1000ppm的十七酸和200mL的氯仿∶甲醇(2∶1)加入到20mL培养液中，随后向其中加入玻璃珠，剧烈摇晃5分钟并均化5分钟。
将该混合物在6000rpm下离心15分钟(4℃)并分为两部分。用硫酸钠处理有机溶剂部分以除去残留水分，随后蒸发有机溶剂以用氮气干燥。将1N氢氧化钠(甲醇)3mL加入该干燥的样品中并在100℃下皂化15分钟。此时，使用用特弗隆胶带处理的螺帽盖住的试管并且将该螺帽用石蜡膜(parafilm)包裹。向其加入4％HCl(甲醇)6mL以甲基化20分钟。将该甲基化的样品与2mL己烷∶水(1∶1，v/v)混合并剧烈摇晃10分钟，随后在8000rpm下(4℃)离心混合物15分钟。提取有机溶剂部分并利用氮气干燥，随后将该干燥的物质溶解在1mL己烷中。
<结果与讨论>
假定标准参考物质十七酸(heptodecanoic acid)的峰面积为100，则当LA以超过100ppm的量加入培养基中时，CLA以足够的量产生(表5)。另外，如果LA分别以1000ppm和500ppm的量加入，则它们之间在生产CLA方面没有显著的差别。优选地，LA以100-1000ppm的量加入以便生产CLA。考虑到成本和效率，500ppm是最优选的。
[表5]根据加入到培养基中的LA浓度的CLA生产
Figure G2005800270866D00201
2.用于最大程度生产CLA的乳化剂添加条件
考察当加入乳化剂以提高LA在培养液中的溶解度时，CLA的产量是否提高。为此，将LA以0.1％的浓度加入至脱脂乳培养基和MRS培养基。此时，LA以三种形式加入：LA、LA盐、以及LA盐和吐温-80(0.2％)，并过夜培养，随后确定鼠李糖乳杆菌菌株PL60的CLA生产能力。利用上述方法，提取培养液中的脂质以被甲基化，随后通过GC确定CLA的量。
<结果与讨论>
与LA盐相比，所使用的用于提高培养液中LA的溶解度的吐温-80三倍地提高了t10c12CLA的生产。非常重要的是，在将LA加入培养基时加入乳化剂，提高LA的溶解度。
[表6]吐温-80的加入对CLA生产的影响
Figure G2005800270866D00211
3.在原始培养物上用于诱导CLA生产的乳化剂添加条件
为了在获取鼠李糖乳杆菌菌株PL60本身、或起始菌株或其添加物(additive)后立即最大程度生产CLA，要考察当培养鼠李糖乳杆菌菌株PL60以产生如冻干干粉的产物时，加入吐温-80以提高LA的溶解度是否是有效的条件。为此，将LA盐、0.1％的LA和吐温-80、0.2％的LA和吐温-80、以及0.5％的LA和吐温-80加入到其中有原始培养的起始菌株的培养基中。将原始培养的鼠李糖乳杆菌菌株PL60在生产CLA的培养基(含0.1％LA的脱脂乳)中培养以测量产生的CLA的量。
<结果与讨论>
为了在商业生产所用的脱脂乳培养基(乳清培养基)中最大程度地生产CLA，当在含有0.1％的LA和0.1-0.5％的吐温-80的脱脂乳培养基中培养鼠李糖乳杆菌菌株PL60以诱导CLA生产时，CLA的生产能力为最佳(表7)。认为0.2％的吐温-80比0.5％的吐温-80的CLA生产能力更高的原因是0.5％的吐温-80对乳酸杆菌菌株有生长抑制作用。
[表7]根据用于在培养基中溶解LA的吐温-80的浓度的鼠李糖乳杆菌菌株PL60的CLA生产能力
Figure G2005800270866D00221
4.用于最大程度生产CLA的糖类添加条件
我们找到了能够最大程度生产CLA的糖种类。为此，将6％浓度的果糖、蔗糖、以及乳糖各自加入到含0.1％LA的脱脂乳培养基中以测量CLA的生产。
<结果与讨论>
在加入果糖后生产的CLA最多，其次为蔗糖和乳糖。当加入葡萄糖时，没有观察到有效的CLA生产。
[表8]根据各种糖的CLA生产的变化
Figure G2005800270866D00222
实施例3：给予生产CLA的鼠李糖乳杆菌菌株PL60的大鼠体重的变化
将冻干的鼠李糖乳杆菌菌株PL60(其在利用脱脂乳作为赋形剂的含0.1％LA和0.2％吐温-80的培养基中培养)以109CFU/天和107CFU/天的剂量给予大鼠，并同时给予高脂肪饮食，随后观察大鼠体重的变化。
<材料和方法>
将C57BL/6N大鼠(Charles river laboratory animal facility，USA)分为五组，每组四只。第一组给予常规饮食(Purina rodent chow#5057(3.28cal/g))；第二组给予高脂肪饮食(Research饮食45％高脂肪饮食D12451(5.252卡/g))；第三组为对照组，给予高脂肪饮食和赋形剂的脱脂乳；第四组给予高脂肪饮食和高浓度(109CFU/天)的鼠李糖乳杆菌菌株PL60；第五组给予高脂肪饮食和低浓度(107CFU/天)的鼠李糖乳杆菌菌株PL60。当三周大的大鼠吃饱高脂肪饮食和水时，观察它们体重和喂养饮食量的变化。大鼠在第8周被解剖，以便在染色后利用显微镜观察肠道脂肪的重量、所有器官中脂肪细胞的大小和数量。
<结果与讨论>
表9示出了给予鼠李糖乳杆菌菌株PL60的大鼠体重的变化。根据表9，虽然给予高浓度鼠李糖乳杆菌菌株PL60的组，在第4周几乎没有表现出显著的统计量，但与对照组相比，它的重量增加较小，在第8周超过2g(图8和图9)。也就是说，常规饮食组的平均重量为24.7g，高脂肪饮食组的平均重量为33.4g，脱脂乳组的平均重量为31.9g，给予高浓度鼠李糖乳杆菌菌株PL60组的平均重量为26.9g，而给予低浓度鼠李糖乳杆菌菌株PL60组的平均重量为28.7g。高浓度组的重量增加比高脂肪饮食组的重量增加少6.5g，少了19.5％。低浓度组的重量增加比高脂肪饮食组少4.7g，少了14％。与脱脂乳组相比，高浓度组和低浓度组分别表现出较少的重量增加，为5g(15.7％)和3.2g(10％)。认为高脂肪饮食组和脱脂乳组的重量差为1.5g(4.5％)，其在容许误差范围内而不是由脱脂乳所致的重量减少。
[表9]
Figure G2005800270866D00241
[工业应用]
本发明的鼠李糖乳杆菌菌株PL60具有减少身体脂肪的作用。所述乳酸杆菌菌株可以直接用作减少身体脂肪的功能食品，用于预防或治疗由肥胖导致的所有疾病，或可用作减少身体脂肪的功能食品的添加剂。
虽然为了说明目的，已经披露了本发明的优选具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离所附权利要求书披露的本发明的范围和精神的情况下，可以进行各种更改、添加和替换。
用于专利程序的微生物保藏的国际承认的布达佩斯条约
国际表格
至：韩国首尔中区         由在本页底认定的
    南大门路5街500       国际保藏单位
    CJ株式会社           依据条约第7.1条做出的
                         原始情况下的接收
Figure G2005800270866D00261
1其中采用6.4(d)条，该日期为国际保藏单位获得的日期，其中在获得国际保藏单位保藏后，布达佩斯条约外的保藏变为布达佩斯条约下的保藏，该日期为国际保藏单位收到该微生物的日期。

Claims (13)

1.一种将亚油酸转化为共轭亚油酸的鼠李糖乳杆菌菌株PL60，其保藏编号为KCCM-10654P。
2.根据权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌菌株，其中，所述菌株为活菌株或干菌株。
3.一种用于生产共轭亚油酸的组合物，包含根据权利要求1或2所述的菌株。
4.一种利用鼠李糖乳杆菌菌株大量生产共轭亚油酸的方法，在含有亚油酸的培养基中初步培养根据权利要求1或2所述的菌株。
5.根据权利要求4所述的利用鼠李糖乳杆菌菌株大量生产共轭亚油酸的方法，其中，所述培养基含有0.01-1.0％的亚油酸。
6.根据权利要求5所述的利用鼠李糖乳杆菌菌株大量生产共轭亚油酸的方法，其中，所述培养基进一步含有0.01-1.0％的吐温-80。
7.根据权利要求6所述的利用鼠李糖乳杆菌菌株大量生产共轭亚油酸的方法，其中，所述培养基进一步含有作为糖底物的果糖、蔗糖或乳糖。
8.减少身体脂肪的功能食品，包含作为添加剂的根据权利要求1或2所述的菌株。
9.根据权利要求8所述的减少身体脂肪的功能食品，其中，所述食品为保健食品或含有酸奶、干酪、泡菜、苦椒酱以及大酱的发酵食品。
10.利用保藏编号为KCCM-10654P的鼠李糖乳杆菌菌株PL60作为起始菌株制备的乳制品。
11.利用保藏编号为KCCM-10654P的鼠李糖乳杆菌菌株PL60作为发酵起始菌株制备的源自谷物的发酵食品。
12.一种用于预防和治疗肥胖相关疾病的药物，包含保藏编号为KCCM-10654P的鼠李糖乳杆菌菌株PL60的活菌株、干菌株或培养滤液。
13.根据权利要求12所述的用于预防和治疗肥胖相关疾病的药物，其中，平均体重为60kg的健康人以1×107-1×1011CFU/剂量的量服用保藏编号为KCCM-10654P的鼠李糖乳杆菌菌株PL60，每天1-2次。
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