CN115992071A - 一株具有缓解运动性疲劳功能的植物乳杆菌ccfm1280及其应用 - Google Patents
一株具有缓解运动性疲劳功能的植物乳杆菌ccfm1280及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株具有缓解运动性疲劳功能的植物乳杆菌CCFM1280及其应用，属于微生物技术领域。本发明的植物乳杆菌CCFM1280可以增加小鼠力竭游泳的时间，增强运动耐力；可以降低肌肉乳酸水平和血清尿素氮水平，减少代谢产物的累积；可以增加肌糖原水平和肝糖原水平，增加肌肉和机体的能量储存；可以增加血清睾酮水平，增加在运动过程中的“下丘脑‑垂体‑性腺轴”的响应；可以降低血清乳酸脱氢酶活性，减少由于过量运动导致的组织损伤；可以增加血液血红蛋白水平，保证在运动过程中具有充足的氧气供应从而减少无氧代谢。本发明的植物乳杆菌CCFM1280能够从多方面有效的缓解运动性疲劳，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株具有缓解运动性疲劳功能的植物乳杆菌CCFM1280及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
运动性疲劳是指运动引起肌肉产生最大收缩力量或者最大输出功率暂时性下降的生理现象。1982年第五届国际生物化学会议将运动性疲劳定义为“机体不能将其机能保持在某一特定水平和/或不能维持某一预定的运动强度”。现代快节奏的生活和高强度的负荷很容易给个体带来长期且较重的身心负担，引发慢性疲劳甚至运动性疲劳，使得运动性疲劳已经成为威胁人类健康的重要疾病负担之一。近年来，肠道因包含丰富的神经元、免疫细胞、内分泌细胞和微生物群，受到广泛的关注和进一步的科学研究。
运动性疲劳的发病机制涉及到外周肌肉疲劳和中枢神经疲劳两个方面，包括能源物质的消耗、代谢产物的累积、中枢神经的抑制等。随着“微生物-肠-脑轴”的提出和运动性疲劳机制研究的深入，益生菌与运动性疲劳的关系不容忽视，益生菌通过“微生物-肠-脑轴”影响中枢神经疲劳来缓解运动性疲劳成为可能。在2022年的保健食品功能检验于评价方法中，运动性疲劳归类于体力疲劳，开发具有缓解体力疲劳的功能保健益生菌食品刻不容缓。
发明内容
本发明的第一个目的是提供植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)CCFM1280，已于2022年9月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62796，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明的第二个目的是提供含有所述植物乳杆菌CCFM1280的组合物。
在一种实施方式中，所述植物乳杆菌CCFM1280的数量≥1×109CFU/mL或≥1×109CFU/g。
在一种实施方式中，所述组合物包括但不限于微生物制剂、功能性食品或膳食补充品。
在一种实施方式中，所述组合物中含有所述植物乳杆菌CCFM1280的活菌株、干菌株、菌株代谢物或灭活的菌株。
在一种实施方式中，所述微生物制剂是按如下方法制备而成：将植物乳杆菌CCFM1280在培养基中，于30～37℃培养一段时间，收集培养液中的菌泥，洗涤后，用脱脂乳重悬。
在一种实施方式中，所述脱脂乳重悬后还进行了冷冻干燥，获得含植物乳杆菌CCFM1280的菌粉。
本发明还提供了所述植物乳杆菌CCFM1280在制备预防和/缓解运动性疲劳的药品或保健品方面的应用。
在一种实施方式中，所述缓解运动性疲劳包括但不限于如下至少一种作用：
(1)降低哺乳动物因运动性疲劳导致的肌肉组织乳酸水平升高；
(2)降低哺乳动物因运动性疲劳导致的血清尿素氮水平升高；
(3)提高哺乳动物因运动性疲劳导致的肝脏糖原水平降低；
(4)提高哺乳动物因运动性疲劳导致的肌肉糖原水平降低；
(5)提高哺乳动物因运动性疲劳导致的血清睾酮水平降低；
(6)提高哺乳动物因运动性疲劳导致的血液血红蛋白水平降低；
(7)降低哺乳动物因运动性疲劳导致的血清乳酸脱氢酶水平升高。
在一种实施方式中，所述预防运动性疲劳包括但不限于如下至少一种作用：
(1)提高哺乳动物的运动耐力；
(2)减轻哺乳动物因运动导致的肌肉组织乳酸水平升高；
(3)减轻哺乳动物因运动导致的血清尿素氮水平升高；
(4)提高哺乳动物因运动导致的肝脏糖原水平降低；
(5)提高哺乳动物因运动导致的肌肉糖原水平降低；
(6)提高哺乳动物因运动导致的血清睾酮水平降低；
(7)提高哺乳动物因运动导致的血液血红蛋白水平降低；
(8)降低哺乳动物因运动导致的血清乳酸脱氢酶水平升高。
在一种实施方式中，所述哺乳动物包括但不限于人类。
在一种实施方式中，所述药品或保健品是含有植物乳杆菌CCFM1280和辅料的胶囊剂、片剂、颗粒剂或粉剂等多种固体制剂剂型。
本发明还提供了所述植物乳杆菌CCFM1280在制备发酵食品中的应用。
本发明的有益效果：所述植物乳杆菌CCFM1280具有良好的生长特性以及对于模拟胃肠液具有较好的耐受能力，有助于适应胃肠道环境、稳定定植。所述植物乳杆菌CCFM1280能够提高疲劳小鼠力竭游泳时间，增强运动耐力；能够降低疲劳小鼠肌肉组织中的乳酸水平和血清尿素氮水平，减少代谢产物的过度累积；能够增加疲劳小鼠肝糖原和肌糖原的储存量，增加了能源物质的累积；能够增加疲劳小鼠血清的睾酮水平，增强“下丘脑-垂体-性腺体轴”的响应；能够提高疲劳小鼠血液血红蛋白水平，增加了氧气的供应从而减少了机体的无氧代谢；能够降低疲劳小鼠血清中乳酸脱氢酶的水平，减少高强度运动带来的运动损伤。所述植物乳杆菌CCFM1280能够通过缓解能源物质消耗、代谢产物累积和神经内分泌系统失调等多方面全面的缓解运动性疲劳，减轻了肌肉的受损程度，具有广泛的应用前景。
生物材料保藏
植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)CCFM1280，分类命名为Lactiplantibacillus plantarum，已于2022年9月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：62796。
附图说明
图1是不同组别小鼠力竭游泳时间；
图2是不同组别小鼠肌肉组织中乳酸的浓度；
图3是不同组别小鼠血清尿素氮的浓度；
图4是不同组别小鼠肝脏肝糖原的含量；
图5是不同组别小鼠肌肉肌糖原的含量；
图6是不同组别小鼠血清睾酮的浓度；
图7是不同组别疲劳小鼠血液血红蛋白的含量；
图8是不同组别小鼠血清乳酸脱氢酶的活性；
图9是不同组别小鼠血清乳酸的浓度；
图10是不同组别小鼠的体重变化；
图11是不同组别小鼠肌肉损伤情况；
其中，所有组与疲劳组比较，*P<0.05，**P<0.01。
具体实施方式
植物乳杆菌FXJWS11M2公开于“Mao B,Yin R,Li X,Cui S,Zhang H,Zhao J,ChenW.Comparative Genomic Analysis of Lactiplantibacillus plantarum Isolated fromDifferent Niches.Genes(Basel).2021Feb 8；12(2):241.doi:10.3390/genes12020241.PMID:33567604；PMCID:PMC7914981.”；植物乳杆菌ATCC 10241购自ATCC。
实施例1：植物乳杆菌CCFM1280的筛选及菌悬液的制备
(一)乳杆菌的分离筛选
(1)收集产自重庆的泡菜水样品1ml。涂布于含有山梨醇的MRS培养基中富集12h，然后将富集的样品梯度稀释后涂布于添加了0.02％溴甲酚紫的MRS固体平板上，梯度分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，均置于37℃恒温培养箱中培养48h。
(2)选择合适稀释梯度的平板，根据菌落的颜色、大小、边缘形状等，用接种环挑取菌落在MRS固体平板上划线纯化，置于37℃恒温培养箱中培养48h。
(3)从步骤(2)划线纯化的菌落中挑选5个单菌落，分别在MRS固体平板上再进行一次划线纯化，置于37℃恒温培养箱中培养48h，挑取单菌落，接种MRS液体培养基培养24h，得到增殖后的纯培养菌株。
(4)取步骤(3)中的纯培养菌株置于甘油管中-80℃保藏。
(二)乳杆菌的分子生物学鉴定
(1)将分离纯化后得到的单菌落进行16S rDNA细菌PCR扩增，鉴定，其16S rDNA序列测定如SEQ ID NO.1所示，鉴定单位：苏州金唯智生物科技有限公司。鉴定结果：该菌株为植物乳杆菌属，推测为植物乳杆菌。
(2)将鉴定后的菌株命名为植物乳杆菌CCFM1280，保藏于-80℃备用。
(三)菌悬液的制备
将植物乳杆菌CCFM1280在MRS液体培养基中，于37℃培养24h时间，收集培养液，离心收集菌泥，用生理盐水洗涤后，用浓度为10％(100g/L)的脱脂乳重悬，制得浓度为1.02×109CFU/mL菌悬液。
实施例2：植物乳杆菌CCFM1280对模拟胃肠液具有良好的耐受性
将植物乳杆菌CCFM1280以2％的接种体积分数至MRS液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养12h，进行不同浓度梯度的平板计数，经过稀释处理获得活菌浓度为1×109CFU/mL的发酵液。
取3ml菌液离心处理(6000r/min，2min)，用生理盐水清洗沉淀2次，将得到的菌泥重悬至3ml的人工胃液(含3g/L胃蛋白酶、pH＝3.0的生理盐水)中，混匀于37℃恒温培养箱中培养，分别在0h、2h时取样，用MRS琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率，平行三次实验。
取3ml菌液离心处理(6000r/min，2min)，用生理盐水清洗沉淀2次，将得到的菌泥重悬至3ml的人工肠液(含胰蛋白酶1g/L、胆盐0.3％、pH＝8.0的生理盐水)中，混匀于37℃恒温培养箱中培养，分别在0h、2h、4h时取样，用MRS琼脂培养基浇注培养进行平板菌落计数，测定活菌数并计算其存活率，平行三次实验。
存活率(％)以该培养液中在取样时的活菌数与在第0h时活菌数之比计算。
实验结果如表1所示，植物乳杆菌CCFM1280在人工模拟胃肠液中具有较好的耐受能力，在耐受2小时人工模拟胃液和2、4小时人工模拟肠液过程中的存活率都达到了90％以上，具有较好的益生菌特性。
表1植物乳杆菌CCFM1280在人工模拟胃肠液中的耐受能力
实施例3：植物乳杆菌CCFM1280对于运动性疲劳的缓解作用的动物实验
实验动物购入健康雄性ICR小鼠40只，以动物饲料和水提供予小鼠自由摄食，光照与黑暗各12小时。所有动物适应一周后，随机分成5组，分别是空白组、疲劳组、CCFM1280干预组、FXJWS11M2干预组、ATCC10241干预组。疲劳组和三组干预组进行为期六周的负重游泳造模实验，记录小鼠每周的体重变化。
植物乳杆菌的培养方法参照实施例1。空白组小鼠每日灌胃200μL超纯水复溶的10％脱脂乳；疲劳组小鼠每日灌胃200μL超纯水复溶的10％脱脂乳；CCFM1280干预组每日灌胃200μL含有浓度为1.02×109CFU/mL植物乳杆菌CCFM1280的10％脱脂乳；FXJWS11M2干预组每日灌胃200μL含有浓度为1.02×109CFU/mL植物乳杆菌FXJWS11M2的10％脱脂乳；ATCC10241干预组每日灌胃200μL含有浓度为1.02×109CFU/mL植物乳杆菌ATCC10241的10％脱脂乳。
造模六周后进行所有小鼠的运动耐力的测定，行为学采用力竭游泳时间测试：对所有小鼠采取尾部负重的方式进行游泳，缠绕松紧适宜，负总重量为体重的5％，单独处于水深50cm，水温25℃±1℃的游泳箱中。从小鼠进入水箱开始计时，当小鼠游至连续3次没入水面下，每次超过7s，视为力竭，记录力竭游泳时间。结果如表2所示。
表2动物实验行为学指标
| 组别 | 力竭游泳时间(s) |
| 空白组 | 828.333±295.663 |
| 疲劳组 | 315±96.281 |
| CCFM1280干预组 | 901.167±368.508 |
| FXJWS11M2干预组 | 415.143±188.606 |
| ATCC10241干预组 | 438.75±158.784 |
注：所有数值以Mean±SD表示
结果显示：与空白组相比，负重游泳造模实验使疲劳组小鼠力竭游泳时间显著降低；与疲劳组相比，植物乳杆菌CCFM1280干预组能够显著增加力竭游泳时间。这说明，运动性疲劳会导致运动耐力的显著降低，而植物乳杆菌CCFM1280可以显著的提高小鼠的抗疲劳能力和运动耐力；而同为植物乳杆菌的FXJWS11M2和ATCC10241对力竭游泳时间的改善不明显，对小鼠的运动耐力无明显影响。
检测完所有小鼠的运动耐力后，第二天将所有小鼠在水箱进行无负重游泳，游泳30分钟后立刻进行摘眼球取血并辅以颈椎脱臼法处死解剖，取一份全血样本，-80℃冻存，用于血红蛋白含量的检测；其余血液样本3500r/min离心15分钟，取上清，-80℃冻存，用于血清指标分析；组织样本(肌肉、肝脏)分装后于液氮中速冻并转移于-80℃冻存，用于组织指标分析；取右腿腓肠肌保存在4％的多聚甲醛中，避光放置，用于切片分析。
实施例4：植物乳杆菌CCFM1280对于运动性疲劳的缓解作用的动物实验：血清指标分析
动物模型的建立同实施例3，检测所有无负重游泳30分钟后小鼠血清样本中血清乳酸水平、血清尿素氮水平、睾酮水平和乳酸脱氢酶水平。血清乳酸、血清尿素氮、血清睾酮和血清乳酸脱氢酶的测定按照试剂盒方法进行。
如表3所示，与空白组相比，负重游泳造模实验使疲劳组小鼠血清尿素氮显著升高，血清睾酮水平显著降低，血清乳酸脱氢酶活性显著升高；与疲劳组相比，植物乳杆菌CCFM1280干预组血清尿素氮显著降低，血清睾酮水平显著升高，血清乳酸脱氢酶活性显著降低。这说明运动性疲劳会导致血清中血清尿素氮的累积和“下丘脑-垂体-性腺轴”的减弱，同时也会造成过多的组织损伤从而使得组织中的乳酸脱氢酶进入血液；而植物乳杆菌CCFM1280能够有效的对抗运动性疲劳所带来的氨代谢和神经系统的紊乱，同时减少组织损伤所导致的血清乳酸脱氢酶变化，从而有效的缓解运动性疲劳；相对于疲劳组，植物乳杆菌FXJWS11M2和植物乳杆菌ATCC10241对运动性疲劳所带来的血清指标的改良效果并不显著。
而对于血清乳酸水平，各组均没有显著的差异性。血清乳酸作为运动性疲劳的重要指标，需要深入探究，推测可能是小鼠刚结束运动过程，乳酸在肌肉组织中并未及时进入血液。
表3动物实验血清相关指标
实施例5：植物乳杆菌CCFM1280对于运动性疲劳的缓解作用的动物实验：肌肉组织指标分析
动物模型的建立同实施例3，检测所有无负重游泳30分钟后小鼠肌肉组织样本中乳酸水平和糖原水平，肌肉乳酸的测定和肌肉糖原水平的测定按照试剂盒方法进行。
如表4所示，与空白组相比，负重游泳造模实验使疲劳组小鼠肌肉乳酸显著升高，肌糖原水平显著降低；与疲劳组相比，植物乳杆菌CCFM1280干预组肌肉乳酸显著降低，肌糖原水平显著升高。这说明运动性疲劳过程中肌肉的无氧代谢会导致肌肉中乳酸的过度累积和肌糖原过度的消耗；而植物乳杆菌CCFM1280能够使小鼠在维持相同的运动强度的过程中有效的降低肌肉乳酸的堆积，增加肌肉中的能量储备，从而有效的缓解运动性疲劳；而同为植物乳杆菌的FXJWS11M2和ATCC10241对外周肌肉组织上的疲劳表征并无显著影响。
表4动物实验肌肉组织相关指标
| 组别 | 肌肉乳酸(mmol/g) | 肌糖原(mg/g) |
| 空白组 | 0.057±0.004 | 0.858±0.125 |
| 疲劳组 | 0.065±0.007 | 0.656±0.091 |
| CCFM1280干预组 | 0.053±0.004 | 0.804±0.122 |
| FXJWS11M2干预组 | 0.058±0.008 | 0.704±0.184 |
| ATCC10241干预组 | 0.065±0.009 | 0.649±0.071 |
实施例6：植物乳杆菌CCFM1280对于运动性疲劳的缓解作用的动物实验：肝脏组织指标分析
动物模型的建立同实施例3，检测所有无负重游泳30分钟后小鼠肝脏组织样本中肝糖原水平，组织糖原水平的测定按照试剂盒方法进行。
如表5所示，与空白组相比，负重游泳造模实验使疲劳组小鼠肝糖原水平显著降低；与疲劳组相比，植物乳杆菌CCFM1280干预组肝糖原水平显著升高。这说明运动性疲劳会减弱小鼠整体的能量储存；而植物乳杆菌CCFM1280能够使小鼠在运动过程中增加肝糖原的储备，积累更多的有效能量，从而有效的缓解运动性疲劳。而同为植物乳杆菌的FXJWS11M2也有一定的缓解效果，也能积累更多的肝糖原；而植物乳杆菌ATCC10241对运动性疲劳带来的整体能量储存上的减少并无显著影响。
表5动物实验肝脏组织相关指标
| 组别 | 肝糖原(mg/g) |
| 空白组 | 36.64±6.196 |
| 疲劳组 | 21.303±6.158 |
| CCFM1280干预组 | 35.34±12.622 |
| FXJWS11M2干预组 | 30.474±7.087 |
| ATCC10241干预组 | 25.021±3.714 |
实施例7：植物乳杆菌CCFM1280对于运动性疲劳的缓解作用的动物实验：血液指标分析
动物模型的建立同实施例3，检测所有无负重游泳30分钟后小鼠血液样本中血红蛋白水平，全血血红蛋白水平的测定按照试剂盒方法进行。
如表6所示，与空白组相比，负重游泳造模实验使疲劳组小鼠血红蛋白水平显著降低；与疲劳组相比，植物乳杆菌CCFM1280干预组血红蛋白水平显著升高。这说明运动性疲劳会减少小鼠运动时的氧气供应，增加组织的无氧代谢从而加重运动带来的疲劳感；而植物乳杆菌CCFM1280能够使小鼠在运动过程中获取充足的氧气，进行更多的有氧代谢产生更多的能量，从而有效的缓解运动性疲劳。而同为植物乳杆菌的FXJWS11M2和ATCC10241对运动性疲劳带来的血液血红蛋白含量的减少并无显著影响
表6动物实验血液相关指标
实施例8：植物乳杆菌CCFM1280对于运动性疲劳的缓解作用的动物实验：小鼠体重变化分析
动物模型的建立同实施例3，每周检测小鼠的体重变化。如图10所示，与空白组相比，负重游泳造模实验使疲劳组小鼠体重的增加速度降低，但是对小鼠健康并无不良影响；与疲劳组相比，植物乳杆菌CCFM1280干预组小鼠体重变化与空白组变化接近。这说明运动性疲劳会使小鼠较为消瘦，减慢生长发育过程中体重的增加；而植物乳杆菌CCFM1280能够使小鼠积累更多能量，体重变化更为正常。植物乳杆菌FXJWS11M2干预组小鼠体重的变化趋势与空白组相似，植物乳杆菌ATCC10241干预组小鼠对运动性疲劳带来的体重变化更加趋像于疲劳组小鼠的体重变化。
实施例9：植物乳杆菌CCFM1280对于运动性疲劳的缓解作用的动物实验：肌肉组织病理切片分析
动物模型的建立同实施例3，为了评估植物乳杆菌CCFM1280是否对于肌肉组织产生病理上的不良影响，取无负重游泳结束的小鼠肌肉组织样本中的腓肠肌进行病理切片分析。
如图11所示，空白组小鼠腓肠肌病理表现肌细胞大小轻度不等，呈多边形排列，每个肌细胞有数个肌细胞核，位于肌膜下，整个切片无明显炎症细胞浸润现象；疲劳组小鼠腓肠肌病理表现肌细胞部分泛白坏死，出现明显肿胀萎缩现象，细胞间出现大且多的裂纹，有明显严重的炎症细胞浸润现象；与疲劳组相比，植物乳杆菌CCFM1280干预组小鼠腓肠肌病理表现肌肉排列比较紧密，有少量肌细胞肿胀萎缩现象，组织病理结构接近空白组小鼠腓肠肌。说明，植物乳杆菌CCFM1280能够有效的缓解运动性疲劳对于肌肉组织的损伤。
实施例10：使用植物乳杆菌CCFM1280制备产品
将植物乳杆菌CCFM1280接种于MRS培养基中进行菌株的活化，于37℃恒温培养箱中培养连续传代3次，通过涂布平板计数方法活菌计数，培养至活菌浓度为1×109CFU/mL时通过离心获取菌体细胞，洗涤并重悬于PBS溶液中，制备获得含植物乳杆菌CCFM1280的液体制剂。
可选地，将植物乳杆菌CCFM1280菌体细胞重悬于细胞保护剂中，通过冷冻干燥获得含植物乳杆菌CCFM1280的菌粉。
可选地，将植物乳杆菌CCFM1280加入辅料制成胶囊剂、片剂、颗粒剂和粉剂等多种固体制剂剂型，制成功能保健食品。
所述菌粉和功能保健食品能够有效缓解体力疲劳问题。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一株具有缓解运动性疲劳作用的植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)CCFM1280，已于2022年9月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62796。
2.含有权利要求1所述植物乳杆菌CCFM1280的组合物。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述植物乳杆菌CCFM1280的数量≥1×109CFU/mL或≥1×109CFU/g。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述组合物中含有所述植物乳杆菌CCFM1280的活菌株、干菌株、菌株代谢物或灭活的菌株。
5.根据权利要求1～4任一所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括但不限于微生物制剂、功能性食品和膳食补充品。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述微生物制剂是按如下方法制备而成：将植物乳杆菌CCFM1280在培养基中，于30～37℃培养一段时间，收集培养液中的菌泥，洗涤后，用脱脂乳重悬。
7.权利要求1所述的植物乳杆菌CCFM1280在制备预防和/缓解运动性疲劳的药品或保健品方面的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药品或保健品是含有植物乳杆菌CCFM1280和辅料的固体制剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述固体制剂为胶囊剂、片剂、颗粒剂或粉剂。
10.权利要求1所述植物乳杆菌CCFM1280在制备发酵食品中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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