CN115478036A - 一株缓解非酒精性脂肪肝的黏膜粘液乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株缓解非酒精性脂肪肝的黏膜粘液乳杆菌及其应用,属于微生物技术领域。本发明筛选出了一株黏膜粘液乳杆菌CCFM1276，保藏编号为GDMCC No：62776。本发明提供的黏膜粘液乳杆菌CCFM1276具有缓解非酒精性脂肪肝的作用，具体体现在：缓解高脂饮食所致非酒精性脂肪肝个体的体重、肝脏重量、附睾脂肪及肾周脂肪重量增加；显著改善非酒精性脂肪肝引起的肝脏的脂肪累积，减小脂肪细胞大小；显著降低非酒精性脂肪肝个体血脂水平；缓解非酒精性脂肪肝个体葡萄糖抵抗；调节肝脏组织炎症；调节血清内毒素水平；改善肠道菌群。

Description

一株缓解非酒精性脂肪肝的黏膜粘液乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株缓解非酒精性脂肪肝的黏膜粘液乳杆菌及其应用,属于微生物技术领域。
背景技术
随着饮食结构向高脂高蛋白转变，由此所诱发的非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)发病率逐年提高，且呈低龄化发展，NAFLD已成为世界范围内最常见的慢性肝病之一。如美国NAFLD患病率近年来显著升高，现已占总人口数量的四分之一。在肥胖人群中，NAFLD的患病率更高。有研究发现，NAFLD患者人群的死亡率显著高于正常人群。NAFLD是各种慢性肝脏疾病的主要诱发因素，如肝硬化和肝癌等。由于NAFLD的发病机制较为复杂，目前尚无理想的治疗药物和方案。
NAFLD的发病过程根据病理特征可分为三个阶段，首先是由于肝脏脂肪堆积而造成的非酒精性脂肪肝，脂肪过度堆积后引起炎症，称为非酒精性脂肪肝，随后肝脏发生纤维化，发展为肝硬化。
肠道微生物包括多种微生物(主要是细菌)，有助于消化、能量提取和拮抗病原菌定植，还可以通过竞争性摄取营养和空间来刺激胃肠道的免疫系统，从而减少病原体。近年来的许多研究表明，肥胖、NAFLD等代谢类疾病会引起肠道微生物的失调，而肠道微生物的失调会引起肠道屏障受损，导致一些由肠道微生物产生的毒素如脂多糖LPS经由门静脉进入肝脏，诱发肝脏进一步发生炎症。因此使用益生菌修复肠屏障，干预非酒精性脂肪肝成为近期的研究热点，已有大量的证据表明，益生菌可通过恢复肠道屏障，降低肝脏炎症来缓解NAFLD。
中国发明专利申请CN 113265361A公开了一种缓解非酒精性脂肪肝的复合益生菌制剂、制备方法及其应用，但未研究单菌对于非酒精性脂肪肝的缓解作用。本研究聚焦于单种益生菌对于非酒精性脂肪肝的缓解作用，得到了一株缓解作用较好的黏膜粘液乳杆菌。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术缺陷，经过动物实验体内研究获得一株具备预防非酒精性脂肪肝的黏膜粘液乳杆菌CCFM1276，其具备降低体重、肝脏重量、附睾及肾周脂肪重量，减少肝脏内脂质沉积，减小脂肪细胞大小，降低血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)，降低肝脏中促因子IL-1β和TNF-α，以及降低血清中内毒素，改善肠道菌群中厚壁菌门与拟杆菌门的比例。
为了实现以上目的，本发明提供一株黏膜粘液乳杆菌(Limosilactobacillusmucosae)CCFM1276，保藏编号为GDMCC No：62776，已于2022年9月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
在一种实施方式中，所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1276具有下述生物学特性：
菌体特征：呈乳黄色；
菌落特征：在MRS固体平板上菌落乳黄色凸起，边缘不规则，革兰氏阳性菌；
生长特性：在37℃恒温有氧的条件下，在MRS培养基中培养约16h达到对数末期。
本发明还提供了所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1276在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。
在一种实施方式中，所述药物中黏膜粘液乳杆菌CCFM1276的活菌数不低于1×1010CFU/g。
在一种实施方式中，所述药物含有所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1276、药物载体和/或药用辅料。
本发明还提供了所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1276在制备有助于调节肠道菌群、有助于控制体内脂肪、有助于维持血脂健康水平和/或有助于维持血糖健康水平的保健品中的应用。
在一种实施方式中，所述保健品含有活菌数不低于1×1010CFU/g或1×1010CFU/mL的黏膜粘液乳杆菌CCFM1276。
本发明还提供了含有所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1276的产品。
在一种实施方式中，所述产品中黏膜粘液乳杆菌CCFM1276的活菌数不低于1×1010CFU/g。
在一种实施方式中，所述产品为发酵剂。
在一种实施方式中，所述发酵剂是将所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1276在培养基中培养一段时间，收集细胞培养液中的菌体细胞，直接作为发酵剂或对菌体细胞进行处理后获得发酵剂。
在一种实施方式中，所述处理包括但不限于：洗涤、添加保护剂、干燥等处理方式中的一种或多种。
在一种实施方式中，所述发酵剂的制备方法为将所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1276按照占培养基总质量1～5％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用生理盐水重悬，得到发酵剂。
在一种实施方式中，所述培养基为MRS培养基。
在一种实施方式中，所述产品包含食品或药品。
在一种实施方式中，所述药品含有所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1276、药物载体和/或药用辅料。
在一种实施方式中，所述食品包括含有所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1276的保健食品。
在一种实施方式中，所述食品包括使用所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1276的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品、肉制品或果蔬制品。
本发明还提供黏膜粘液乳杆菌CCFM1276在食品添加剂中的用途，所述用途包括但不限于作为食品发酵剂。
有益效果：本发明提供了黏膜粘液乳杆菌CCFM1276在降低非酒精性脂肪肝个体体重、肝脏重量、附睾及肾周脂肪重量，减少肝脏内脂质沉积，减小脂肪细胞大小，降低血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)，缓解葡萄糖抵抗，降低肝脏中促因子IL-1β和TNF-α，降低血清中内毒素水平，改善肠道菌群方面的应用。本发明提供的黏膜粘液乳杆菌CCFM1276表现出对非酒精性脂肪肝更好的治疗或预防效果，可以制备用于预防和治疗非酒精性脂肪肝的益生菌产品，具有非常广泛的应用前景。
生物材料保藏
黏膜粘液乳杆菌CCFM1276，分类命名为Limosilactobacillus mucosae，保藏编号为GDMCC No：62776，已于2022年9月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1表示各组造模期间体重的变化，表明黏膜粘液乳杆菌CCFM1276降低小鼠体重、肝脏重量、附睾脂肪和肾周脂肪重量；图中：柱状图上方字母不相同表示显著差异(P<0.05)。
图2表示各组肝脏组织油红染色，表明黏膜粘液乳杆菌CCFM1276减少肝脏中脂肪沉积；图中：柱状图上方字母不相同表示显著差异(P<0.05)。
图3表示各组肾周脂肪组织HE染色，表明黏膜粘液乳杆菌CCFM1276减小脂肪细胞大小；图中：柱状图上方字母不相同表示显著差异(P<0.05)。
图4表示各组低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)的变化，表明黏膜粘液乳杆菌CCFM1276能显著降低小鼠的血脂水平；图中：柱状图上方字母不相同表示显著差异(P<0.05)。
图5表示黏膜粘液乳杆菌CCFM1276对小鼠葡萄糖抵抗的影响，表明黏膜粘液乳杆菌CCFM1276能缓解小鼠葡萄糖抵抗；图中：柱状图上方字母不相同表示显著差异(P<0.05)。
图6表示黏膜粘液乳杆菌CCFM1276对小鼠肝脏中炎症因子IL-1β和TNF-α变化的影响，表明黏膜粘液乳杆菌CCFM1276能缓解小鼠肝脏炎症；图中：柱状图上方字母不相同表示显著差异(P<0.05)。
图7表示黏膜粘液乳杆菌CCFM1276对小鼠血清中内毒素LPS变化的影响，表明黏膜粘液乳杆菌CCFM1276能降低小鼠血清内毒素水平；图中：柱状图上方字母不相同表示显著差异(P<0.05)。
图8表示黏膜粘液乳杆菌CCFM1276对小鼠肠道菌群厚壁菌门/拟杆菌门变化的影响，表明黏膜粘液乳杆菌CCFM1276能降低小鼠厚壁菌门/拟杆菌门；图中：柱状图上方字母不相同表示显著差异(P<0.05)。
具体实施方式
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
在本发明中，如无特殊说明，用于说明浓度或比例的“％”或百分比均为重量百分比。
本发明涉及以下培养基：
MRS液体培养基：胰蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、柠檬酸氢二铵2g、醋酸钠5g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.5g、一水合硫酸锰0.25g，吐温80 1mL，加水至1000mL。
MRS固体培养基是在以上基础添加以液体培养基总重计1.5％琼脂得到的。
实施例1：黏膜粘液乳杆菌CCFM1276采集、分离和鉴定
取1g采自浙江台州的成年女性粪便样品，梯度稀释后涂布于MRS固体培养基，置于有氧环境下在37℃下培养72h，观察记录菌落形态，挑去菌落划线纯化，然后在MRS液体培养基中在37℃下培养48h，所得菌落进行革兰氏染色并记录菌株形态，弃除菌落中的革兰氏阴性菌株和革兰氏阳性球菌，挑选得到革兰氏阳性杆菌，经过过氧化氢酶分析后弃除过氧化氢酶阳性菌株，保留过氧化氢酶阴性菌株，以果糖-6-磷酸激酶检测以弃除阴性菌株，所得均经过16S rDNA测序鉴定为黏膜粘液乳杆菌，命名为CCFM1276。所得黏膜粘液乳杆菌进行传代培养，收集菌体置于离心管中3000rpm离心10min洗涤，重复3次，所得菌体加入基体保护剂中进行冷冻保存，16S rDNA鉴定后将菌株CCFM1276保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62776。同批次筛选的另一株黏膜粘液乳杆菌命名为FGSYC17L3。
16S rDNA扩增条件：95℃5min；35个循环(95℃30s，55℃30s,72℃2min)；72℃10min；扩增引物：27F:(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，1492R:(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增产物纯化和序列比对过程按文献(Turroni F etal.Exploring the Diversity of the Bifidobacterial Population in the HumanIntestinal Tract[J].Appl Environ Microb.2009；75(6):1534–45)记载的方法进行。
实施例2：黏膜粘液乳杆菌CCFM1276菌悬液的制备
(1)活化培养：
采用MRS液体培养基，37℃普通培养箱中静置培养。
培养目标：取冷冻保存的菌体，挑单菌落于液体MRS液体培养基中，在37℃普通培养箱中静置培养约24h，活化黏膜粘液乳杆菌CCFM1276。
(2)一级培养：
采用MRS液体培养基，于37℃普通培养箱中静置培养。
培养目标：将活化培养的黏膜粘液乳杆菌CCFM1276以培养基体积计1％接种量转接至MRS液体培养基，传两代。
(3)二级培养：
将经过一级培养的黏膜粘液乳杆菌CCFM1276以培养基体积计1％接种量转接至1LMRS液体培养基中，37℃普通培养箱中静置培养约24h，收集菌体。用pH 7.4的PBS洗涤两遍，接着重悬于30％甘油溶液中，活菌数为2.2×1010CFU/mL，后续试验使用时，离心弃去甘油，用生理盐水洗涤一遍后重悬于生理盐水中。
实施例3：黏膜粘液乳杆菌CCFM1276胃肠液耐受性的测定
模拟胃肠液中的存活率的测定方法：人工模拟胃肠液需新鲜配制。将胃蛋白酶(国药沪试，64008860)溶于pH3.0的PBS中使其终浓度为3g/L，经0.22μm滤膜过滤后制备成模拟胃液。将胰蛋白酶(上海生工生物工程有限公司，A003319-0001)溶于pH8.0的PBS中使其终浓度为1g/L，经0.22μm滤膜过滤后制备成模拟肠液。将按照实施例2的方法培养好的黏膜粘液乳杆菌在4℃下以6000rpm离心10min，收集菌泥，用0.85％生理盐水重悬后，在模拟胃液(pH3.0)中将其菌液密度调节为1×109CFU/mL。混匀后将其放置于37℃培养2h后计活菌数。取1mL模拟胃液处理过的菌液加入至9mL模拟肠液(pH8.0)中，混匀后于37℃培养，4h后检测活菌数。处理后的活菌数与初始活菌数比值的百分比为存活率。
结果显示，CCFM1276在模拟胃液中的存活率为88.13％，在模拟肠液中的存活率为79.93％
实施例4：黏膜粘液乳杆菌CCFM1276改善非酒精性脂肪肝小鼠体重、肝脏重量、附睾脂肪和肾周脂肪重量
1.实验动物
雄性SPF级C57BL/6J小鼠(4周龄，体重20-23g)，来自中国浙江维通利华实验动物技术有限公司。小鼠饲养在聚丙烯笼子里，每组8只小鼠，笼子里装有食物和水，控制温度(22℃)，相对湿度(50±10％)，自由饮水，用标准饲料喂养对照小鼠，购于南通特洛菲饲料科技有限公司含60％脂肪的高脂饲料(TP23300)喂养造模组、CCFM1276组和FGSYC17L3组小鼠。
2、实验方法
(1)非酒精性脂肪肝小鼠模型的建立
用标准饲料喂养对照小鼠，用60％高脂饲料喂养造模组、CCFM1276组和FGSYC17L3组小鼠，自由饮水，持续12周，每周称体重，12周后造模组体重比对照组高25％，即视为造模成功。
(2)实验分组及给药
黏膜粘液乳杆菌菌悬液的制备方法参照实施例2。将32只C57BL/6J小鼠随机分为4组，即对照组，造模组、黏膜粘液乳杆菌CCFM1276处理组和黏膜粘液乳杆菌FGSYC17L3处理组，每组8只。黏膜粘液乳杆菌处理组给药方式为灌胃，灌胃剂量为4×1010CFU/100μL/只/天。黏膜粘液乳杆菌处理组造模每天灌胃黏膜粘液乳杆菌，正常组和模型组均灌胃生理盐水作为对照至实验结束。
小鼠造模期间，每周称量小鼠体重。
造模12周后，造模组体重比对照组高25.81％，FGSYC17L3组与造模组体重相当，而CCFM1276组比对照组高17.11％，比造模组低6.92％。处死小鼠后，分别称量肝脏、附睾脂肪和肾周脂肪的重量，造模组肝脏重量比对照组高16.41％，附睾脂肪重量比对照组高387.40％，肾周脂肪重量比对照组高509.85％；而CCFM1276组肝脏重量比造模组低7.04％，附睾脂肪重量比造模组降低25.16％，肾周脂肪重量比造模组降低25.10％。这表明，黏膜粘液乳杆菌CCFM1276可降低小鼠肝脏和附睾脂肪重量，显著降低小鼠肾周脂肪重量(p<0.05)。
图1表明，造模组体重相比于对照组体重、肝脏、附睾脂肪和肾周脂肪重量升高，黏膜粘液乳杆菌CCFM1276可良好地缓解，而FGSYC17L3无此作用。
实施例5：黏膜粘液乳杆菌CCFM1276改善非酒精性脂肪肝小鼠的肝脏脂肪累积
造模、分组处理的实施方式同实施例4。
实验结束后处死小鼠，解剖部分肝脏组织，利用生理盐水将血液冲洗干净，4％多聚甲醛固定24h，脱水、石蜡包埋、冷冻切片。接下来，取超薄切片(4μm)异丙醇冲洗后使用油红O染色液染色。染色后的切片以中性树胶作为粘合剂封上盖玻片。病理切片扫描仪用于记录显微照片。
结果如图2所示，非酒精性脂肪肝小鼠肝脏中脂肪累积增多，油红切片中可观察到脂滴数目增多，脂滴面积增大，可以反应非酒精性脂肪肝的严重程度。使用软件Image ProPlus分析切片中脂肪占比，造模组相较于空白组，脂肪占比显著增加(p<0.05)，而黏膜粘液乳杆菌CCFM1276可显著缓解由高脂饮食引起的脂肪累积(p<0.05)，脂肪面积由模型组的22.61％降低至9.03％，接近对照组水平。
实施例6：黏膜粘液乳杆菌CCFM1276改善非酒精性脂肪肝小鼠脂肪细胞面积
造模、分组处理的实施方式同实施例4。
实验结束后处死小鼠，解剖部分肾周脂肪组织，利用生理盐水将血液冲洗干净，4％多聚甲醛固定24h，脱水、石蜡包埋、切片。接下来，取超薄切片(4μm)苏木精、伊红(HE)染色。染色后的切片以中性树胶作为粘合剂封上盖玻片。病理切片扫描仪用于记录显微照片。
非酒精性脂肪肝小鼠脂肪细胞体积较大，排列松散。使用软件FIJI分析切片中脂肪细胞大小，造模组相较于空白组，脂肪细胞大小显著增加(p<0.05)，而黏膜粘液乳杆菌CCFM1276可显著缓解这一情况(p<0.05)。黏膜粘液乳杆菌CCFM1276改善非酒精性脂肪肝小鼠脂肪细胞大小的结果列于图3中。
如图3所示，造模组小鼠与对照组相比脂肪细胞增大，脂肪细胞面积提高至2928.23μm2，黏膜粘液乳杆菌CCFM1276组脂肪细胞面积为1924.69μm2，可良好地缓解脂肪细胞增大的趋势，而FGSYC17L3无此作用。
实施例7：黏膜粘液乳杆菌CCFM1276改善非酒精性脂肪肝小鼠血脂水平
造模、分组处理的实施方式同实施例4。
在最后一次灌胃的24h后，从眶静脉丛血样采集，血液静置，离心4000g，10min，离心取血清，置于-80℃冰箱保存，用于后续试验。使用血清生化分析仪测定小鼠血清中LDL-C、TC、TG水平。
如图4所示，与对照组相比，模型组小鼠的血脂水平显著增高(p<0.05)，TG、LDL-C、TC分别提升至0.5349mmol/L、1.27mmol/L、5.74mmol/L，而黏膜粘液乳杆菌CCFM1276组分别为0.21mmol/L、0.78mmol/L、5.05mmol/L，表明黏膜粘液乳杆菌CCFM1276对于小鼠的血脂水平有显著的降低作用(p<0.05)，而FGSYC17L3无此作用。
实施例8：黏膜粘液乳杆菌CCFM1276改善非酒精性脂肪肝小鼠葡萄糖抵抗
造模、分组处理的实施方式同实施例4。
在造模的第10周进行口服葡萄糖耐量试验。禁食12小时后，小鼠灌胃40％葡萄糖溶液(2g/kg体重)。分别在0、15、30、60、90和120分钟时测量血糖水平。根据时间和血糖值绘制曲线，计算曲线下面积，得出糖耐量值。
黏膜粘液乳杆菌对非酒精性脂肪肝小鼠的葡萄糖抵抗的改善效果如图5所示。与对照组相比，模型组小鼠的曲线下面积显著增高至1386(p<0.05)，而黏膜粘液乳杆菌CCFM1276组为1159，表明黏膜粘液乳杆菌CCFM1276对于小鼠的葡萄糖抵抗有显著的降低作用(p<0.05)。
实施例9：黏膜粘液乳杆菌CCFM1276改善非酒精性脂肪肝小鼠肝脏炎症水平
造模、分组处理的实施方式同实施例4。
在最后一次灌胃的24h后，取部分肝脏组织，置于-80℃冰箱保存，用于后续试验。实验时取出肝脏组织，加入PBS溶液，使用高通量研磨仪研磨，得到肝脏匀浆，使用酶联免疫吸附测定方法(ELISA)检测小鼠肝脏中IL-1β、TNF-α水平。
黏膜粘液乳杆菌CCFM1276调节炎症结果如图6所示。根据前述指标测定，与正常组相比，非酒精性脂肪肝造模小鼠肝脏产生炎症，炎症因子水平上升，IL-1β和TNF-α分别升高至7.29pg/μg总蛋白、7.55pg/μg总蛋白。与造模组相比，黏膜粘液乳杆菌CCFM1276处理可以显著下调IL-1β至4.61pg/μg总蛋白(p<0.05)，下调TNF-α至5.74pg/μg总蛋白，并与对照组水平相当。表明黏膜粘液乳杆菌CCFM1276可良好地降低炎症因子水平，而FGSYC17L3无此作用。
实施例10：黏膜粘液乳杆菌CCFM1276改善非酒精性脂肪肝小鼠血清内毒素水平
造模、分组处理的实施方式同实施例4。
在最后一次灌胃的24h后，从眶静脉丛血样采集，血液静置，离心4000g，10min，离心取血清，置于-80℃冰箱保存，用于后续试验。使用酶联免疫吸附测定方法(ELISA)检测小鼠血清中内毒素水平。
结果如图7所示。内毒素是小鼠肠道微生物中革兰氏阴性菌细胞壁的一种成分，可诱发炎症，小鼠发生非酒精性脂肪肝时，肠道粘膜屏障受损，肠道通透性增加，内毒素将由门静脉流出，使肝脏暴露于内毒素中，从而进一步诱发肝脏炎症。根据测定，与正常组相比，非酒精性脂肪肝造模小鼠血清中内毒素水平显著上升(p<0.05)，而黏膜粘液乳杆菌CCFM1276处理可以显著下调小鼠血清中内毒素水平(p<0.05)。模型组小鼠内毒素水平相比于对照组的239.18ng/L升高至276.66ng/L，黏膜粘液乳杆菌CCFM1276可降低内毒素水平至243.67ng/L，而FGSYC17L3无显著降低效果。
实施例11：黏膜粘液乳杆菌CCFM1276改善非酒精性脂肪肝小鼠肠道菌群
造模、分组处理的实施方式同实施例4。
试验结束后，提取粪便中基因组DNA，对V3-V4区进行特异性PCR扩增，16S rDNA测序，分析粪便菌群变化。结果表明非酒精性脂肪肝小鼠肠道菌群厚壁菌门与拟杆菌门的比值由对照组的3.37增大至5.09，而黏膜粘液乳杆菌CCFM1276降低厚壁菌门与拟杆菌门的比值至3.40。
图8表明，模型组小鼠与正常组相比壁菌门与拟杆菌门的比值升高，黏膜粘液乳杆菌CCFM1276可良好地调节这一比值，并恢复至与对照组相当的水平，而FGSYC17L3无此作用。
实施例4～11的结果表明，黏膜粘液乳杆菌CCFM1276能通过改善肠道菌群下调内毒素及炎症因子水平改善炎症反应，改善小鼠血脂水平，同时对小鼠体重、肝脏重量、附睾脂肪及肾周脂肪重量有着较好的调节作用，最终体现为对非酒精性脂肪肝具有较显著的缓解效果，它可以制备用于预防和治疗非酒精性脂肪肝的药物或保健品，或者生产益于减肥的食品，例如作为益生菌饮料、酸豆奶、发酵果冻、发酵茶饮料或乳制品(如酸奶、奶酪制品、乳酸菌、奶粉)的食品添加剂等。
实施例12：制备含有黏膜粘液乳杆菌CCFM1276菌剂的片剂
具体制作工艺基本步骤如下：菌种活化→扩大培养→收集菌体→菌悬液制备→冷冻干燥→总混→压片；
1、菌种活化：黏膜粘液乳杆菌CCFM1276以培养基体积计1％的接种量在MRS液体培养基中在37℃普通培养箱中静置培养，连续活化两代。
2、扩大培养：将活化的黏膜粘液乳杆菌CCFM1276以培养基体积计1％的接种量转接到1L MRS液体培养基中进行扩大培养，在37℃静置培养24h。
3、收集菌体、制备菌悬液：扩大培养结束后，在4℃低温离心收集菌体，用PBS(pH7.4)洗涤两次后，用以重量计13％脱脂乳水溶液制成1×1010CFU/mL的菌悬液。
4、冷冻干燥：根据常规冷冻干燥工艺将菌悬液制成菌粉。
5、总混：加入以菌粉总重计2％硬脂酸作润滑剂，3％CMC-Na作粘合剂，混匀。
6、压片：根据常规压片工艺通过压片机压片。
实施例13：制备含有黏膜粘液乳杆菌CCFM1276菌剂的粉剂
具体制作工艺基本步骤如下：菌种活化→扩大培养→收集菌体→菌悬液制备→冷冻干燥菌种活化、扩大培养、收集菌体、制备菌悬液步骤同实施例2。
冷冻干燥：根据常规冷冻干燥工艺将菌悬液制成冻干菌体粉剂。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株黏膜粘液乳杆菌 (Limosilactobacillus mucosae) CCFM1276，已于2022年9月26日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62776。
2.权利要求1所述的黏膜粘液乳杆菌CCFM1276在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用。
3.权利要求1所述的黏膜粘液乳杆菌CCFM1276在制备有助于调节肠道菌群、有助于控制体内脂肪、有助于维持血脂健康水平和/或有助于维持血糖健康水平的保健品中的应用。
4.含有权利要求1所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1276的发酵剂。
5.根据权利要求4所述的发酵剂，其特征在于，所述发酵剂是将所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1276在培养基中培养一段时间，收集细胞培养液中的菌体细胞，直接作为发酵剂或对菌体细胞进行处理后获得发酵剂。
6.含有权利要求1所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1276的产品，其特征在于，所述产品中黏膜粘液乳杆菌CCFM1276的活菌数不低于1×1010 CFU/g。
7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述产品为食品、药品或保健品。
8.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述药品含有所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1276、药物载体和/或药用辅料。
9.根据权利要求7所述的产品，其特征在于，所述食品包括使用权利要求1所述黏膜粘液乳杆菌CCFM1276或权利要求4所述发酵剂生产得到的乳制品、豆制品、肉制品或果蔬制品。
10.权利要求1所述的黏膜粘液乳杆菌CCFM1276在食品添加剂中的应用。
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